This work was supported by the Ronald Peter Griggs Memorial Fellowship in ALS Research (to KP) and a Neuromuscular Research Partnership Program grant from the CIHR, the ALS Society of Canada, and Muscular Dystrophy Canada (JNM-69682) to CK and FMR. Additional support was also provided by the ALS Society of America (57969). We would like to thank Dr. R. Keith Humphries from the Terry Fox Laboratory/Department of Pathology, BC Cancer Agency, Vancouver, Canada and the staff at the Simon Fraser University Animal Care Unit.

注：倫理声明：このプロトコルは、見直し、サイモン·フレーザー大学の動物実験委員会によって承認されている（UACC、許可証番号1037K-12と1060K-03）とアニマルケアに関するカナダの協議会に準拠している、のためのNIHガイド実験動物の管理と使用、およびEEC理事会指令。 1.特別な考慮事項注：ブスルファンは、細胞傷害性である。ハンドルと安全データシートと制度ガイドラインに従って廃棄してください。 <ol><li>層流フード内で無菌的にすべての技術を実行する。 </li><li>このような剥離パッケージ、およびオートクレーブのような適切な包装材料で包むことによって、使用前に器具を滅菌する。 </li><li>感染のリスクは、照射に比べブスルファン付きの下ですが、唯一の移植後最初の2週間は、層流フードで動物を扱う。 </li></ol> 2.コンディショニングレシピエントマウス<ol><li>滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いて溶液を3mg /にブスルファンを希釈する。 注：注射の毎日を使用直前にブスルファンの新鮮な希釈することが重要である。 </li><li>毎日のIP注射を経由して、レシピエントマウスに希釈しブスルファンの20mg / kgのを管理します。 </li><li> 60-100 mgの総用量まで20mg / kgのブスルファンの毎日のIP注射を繰り返し/ kgの（ すなわち、80 mg / kgを総用量のために、4日間連続ブスルファンを20mg / kgで投与）送達された。 </li></ol>ドナー骨髄細胞の3.絶縁注意：このプロトコルは正常に最大5ドナーマウスからのBM細胞を単離および調製するために使用されてきた。通常、マウス当たり細胞収量は、12-16レシピエントマウスに移植するのに十分である約30から40000000 BMDCを、である。以上のドナーマウスが必要な場合は、プロトコルに応じて調整する必要があるかもしれない。 <ol><li>ブスルファンコンディショニングの最後の日に続いてeuthCO 2を使用した（一から六ヶ月）のGFPドナーマウスをanize（または機関に受け入れられ、他の安楽死法による）。移植の合併症を回避するために、受信者と同じ性別である同系ドナーを使用しています。 </li><li> 70％エタノールでマウススプレー。リフト腹部の皮膚と外科用ハサミを使用するには、足首に向かって腹腔まで足から皮膚を介して切開する。足を持ち、しっかりと脚組織を暴露腰に向かって足首から肌を引き出します。 </li><li>股関節を露出するために大腿骨から筋肉及び脂肪組織を切り取る。 </li><li>優しく足を拡張するために、足を引っ張っている間、股関節に対してハサミを押してください。ちょうど大腿骨自体をカットしないように注意しながら、大腿骨の頭の上にカット。 </li><li> 、無菌性を維持するのに役立ち足で足を保持し、オートクレーブ組織と骨表面をこすることにより骨から残りの組織をクリーニングするには。 </li><li>膝関節を切断することにより、大腿骨と脛骨を分離滅菌PBSを含む培養皿に大腿骨を置く。氷上でインキュベートする。 </li><li>腓骨は脛骨に接続している箇所で切断することにより、腓骨を取り外し、廃棄します。大腿骨との培養皿で脛骨を置き、氷上でインキュベートする。 </li><li>繰り返して、他の足のために3.2から3.7を段階的に説明し、必要に応じて、追加のドナーマウス。骨を除去した後、ホットビーズ滅菌器で手術器具を滅菌するか、その後の工程のための無菌の新しいツールセットを使用します。 </li><li>大腿骨の場合は、鉗子で大腿骨を保持し、慎重に手術用ハサミを使用して「剃る」は遠位骨をオフに終了します。 BM空洞を公開するために、必要に応じて骨のような少しを削除します。 </li><li>滅菌PBS 3mlで注射器を記入し、23 Gの針を取り付けます。慎重にBM空洞に針を産んと無菌培養皿にBMをフラッシュする。すべての所望の細胞の除去を確実にするために、ニードルポイントで髄空洞をこすりしてください。抽出に続いて、赤いBMは表示されなくなりと骨が今白く見えることを確認してください。 </li><li>繰り返しは、同じ培養皿にBMのすべてをプール、後続の大腿骨用3.9から3.10を繰り返します。 </li><li>脛骨のために脛骨がBM空洞が露出するように膝に取り付けた最後を、鉗子で脛骨を保持し、慎重に「剃る」。可視赤色BMが終わる骨に沿って第2のカットを行います。 </li><li>滅菌PBS 3mlで注射器を記入し、25 Gの針を取り付けます。静かに（膝に取り付けた端から）BM空洞の中に針を挿入し、大腿骨からBMを含む培養皿にBMをフラッシュする。すべての細胞を除去するために針でBMキャビティの壁をこすり。抽出に続いて、赤のBMが見えなくなると骨が今白表示されていることを確認していない。 </li><li>繰り返しは、同じ培養皿にBMのすべてをプール、後続の脛骨のため3.12から3.13を繰り返します。 </li><li>穏やかcと解離を1 mlピペットチップでBMを粉砕するのエル。 </li><li>滅菌した50mLの遠心分離管に40μMバスケットフィルターを通して細胞懸濁液を渡す。残りの細胞を取得し、遠心管にフィルターを介してこれを転送するためにPBSでディッシュをすすぐ。 </li><li> 4℃で450×gで5分間遠心。上清を除去し、廃棄する。 </li><li>再懸濁赤血球溶解緩衝液3ml中にペレットを再。 8.5分間氷上でインキュベートする。 </li><li>溶解バッファをクエンチするの無菌PBS〜30ミリリットルを追加します。 </li><li> 4℃で450×gで5分間遠心。上清を除去し、廃棄する。 </li><li>滅菌PBSの1ミリリットル中にペレットを再懸濁。氷の上に保管してください。 </li><li>細胞ホモジネートの小アリコートを取り、PBSで希釈し（1：1マウス100; 1：2匹のマウス200等）の血球計数器を用いて細胞数を定量する。 </li><li> 8×10 6細胞/ mlの細胞懸濁液を希釈し、注射まで氷上でインキュベートする。 </li></ol> 4.骨髄移植<ol><li> Fiのllの各マウスに希釈した細胞懸濁液を300μlと（28 Gイン​​スリン針付き）が0.5 mlシリンジに注入する。注射器中に存在する任意の気泡を除去するようにしてください。 </li><li>加熱パッドを条件とレシピエントマウスを含むマウスケージを置き、尾静脈を拡張することができます。 </li><li>拘束装置において、レシピエントマウスと起こる。 70％エタノールを浸した外科ガーゼでテールを拭きます。 </li><li>しっかりと尾を保持し、ベベルを上にして、軽く外側尾静脈の1に針を挿入し、細胞懸濁液を注入する。 </li><li>出血が新しいクリーンケージにマウスを導入する前に停止するまで注射部位に外科ガーゼを持ってください。 </li></ol> 5. BMキメラ現象の程度を推定 NOTE：キメラ化レベルが1週間後BMTにおける末梢血中で一般的に可変であり、そのようキメリズムのレベルは、通常、少なくとも2週間後BMT推定される。チムのレベルerismはBMT後3〜4週間以内に末梢血中の&gt; 80％のGFP +細胞に到達する必要があります。 <ol><li> FACS緩衝液（PBS中の2mM EDTA + 2％ウシ胎児血清）を準備。 NOTE：FACSバッファは数週間4℃で保存することができる。 </li><li>拘束チューブにマウスを置き、横伏在静脈を露出させるために後部脚に毛を剃る。 </li><li>薄くコートワセリンとピアス25 G針で伏在静脈と足。 </li><li>ヘパリンコーティングされた毛細管血液の約50μlのを収集します。 FACS緩衝液1mlを含むマイクロ遠心チューブに血液を加える。反転によってチューブを混合し、氷上で保存する。 </li><li>戻ってケージにマウスを返す前に停止し、出血するまで、注射部位に外科ガーゼを保持します。 </li><li>遠心分離機900×gで5分間の血液サンプルは上清を除去し、廃棄する。 </li><li>赤血球溶解緩衝液500μl中にペレットを再懸濁。 8.5分間氷上でインキュベートする。 </li><li>溶解緩衝液をクエンチし、FACS緩衝液1mlを加える。 </li><li> 900×gで5分間、サンプルを遠心する。上清を除去し、廃棄する。 </li><li>赤血球溶解緩衝液500μl中に第二溶解ステップを実行します。 8.5分間氷上でインキュベートする。 </li><li>溶解緩衝液をクエンチし、FACS緩衝液1mlを加える。 </li><li> 900×gで5分間、サンプルを遠心する。上清を除去し、廃棄する。ペレットは今白であることを確認してください。 注：ペレットがまだ赤い表示される場合は、追加の溶解工程は、次のステップに進む前に必要になる場合があります。 </li><li>再懸濁FACS緩衝液1ml中でペレット。 900×gで5分間、サンプルを遠心する。上清を除去し、廃棄する。 </li><li> FACS緩衝液300μl中にペレットを再懸濁し、フローサイトメトリーを用いて、GFP +細胞を定量化する（注：この時点で、細胞の任意の免疫染色は、標準的な技術を使用して、行うことができる前にフローサイトメトリー分析する）。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

ブスルファン調整は容易に検出された造血細胞を有するマウスにおける高レベルのBMキメラの生成を可能にする。この調整は、照射設備を必要とせずに行うことができる。また、このプロトコルで概説ブスルファンの用量の骨髄抑制はよく照射骨髄破壊用量によって引き起こされる有害な副作用を最小限に許容され、従って、よりあり、若い古い、または罹患したマウスにおけるBMキメラを生...

Recently, there has been considerable interest in the roles of microglia and bone marrow (BM)-derived cells (BMDCs) in the central nervous system (CNS), both during disease as well as with normal aging. Microglia, the resident immune cells of the CNS, are now known to develop in the CNS following the entry of primitive myeloid progenitors during embryogenesis1. Microglia retain aspects of their myelomonocytic lineage well into adult life. While evidence suggests that the contribution of BMDCs to the microglial pool is minimal in healthy adult animals1, the role BMDCs play in the progression of various neurodegenerative diseases remains unclear. This uncertainty is compounded by the fact that it is difficult to distinguish BMDCs that accumulate within the CNS from endogenous resident microglia, as no universally accepted discriminating immunohistochemical marker has been identified. In order to monitor BMDCs in vivo, we employ a BM transplantation (BMT) protocol whereby endogenous BM cells of a recipient mouse are replaced with those of a donor mouse ubiquitously expressing green fluorescent protein (GFP) under control of the &#946;-actin promoter. This protocol permits the determination of both the localization and morphology of GFP+ BMDCs within the recipient mouse using immunohistochemistry, and facilitates further characterization of these cells using fluorescence-activated cell sorting (FACS) followed by subsequent biochemical assays. 
For a successful BMT, recipient BM cells need to be ablated (termed myeloablation) in order to generate niche space within the recipient BM to allow for donor cell engraftment. Often, myeloablation is achieved using total body gamma irradiation which induces double strand breaks in DNA that leads to cell death, particularly in actively dividing cells such as hematopoietic progenitor cells2,3. The irradiation protocols are done to induce sufficient BM cell death such that animal lethality results if the recipient animal does not achieve adequate donor cell engraftment from BMT (so called &#8216;lethal irradiation&#8217;). However, irradiation requires a specialized facility and equipment, along with veterinary and animal husbandry resources not available to researchers at all institutions. Furthermore, myeloablative irradiation can cause potentially lethal damage to other tissues, and due to immunosuppresion, irradiated animals are more susceptible to secondary infections3. As such, reduced intensity conditioning (so called &#8216;RIC&#8217; protocols) regimens have been developed that are intended to minimize potentially toxic side effects of the conditioning protocol in patients, particularly for use in at risk populations such as children and the elderly4. 
Some RIC protocols rely upon chemotherapeutics such as busulfan in order to condition the BM compartment. Busulfan is a bifunctional DNA alkylating agent often used clinically as an alternative to irradiation5,6. Notably, busulfan can be safely administered to mice by intraperitoneal (IP) injection and does not require the specialized facilities and equipment necessary to irradiate mice. Busulfan conditioning has been used extensively in our lab7, as well as in several other recent publications8&#8211;11. When doses of 60-100 mg/kg are employed, high degrees of stable chimerism (>80% GFP+ cells) can be established in the peripheral blood and BM7. Importantly, at these doses myeloablation is not complete and as such mice are able to survive without receiving support BM cells (K. Peake, J. Manning, C. Lewis, and C. Krieger, unpublished observations). Moreover, with myelosuppressive busulfan conditioning there is rapid reconstitution of peripheral blood myelomonocytic cells by donor cells. However, the replacement of peripheral blood lymphocytes by donor cells is slower, highlighting the lack of immunosuppression that occurs with 60-100 mg/kg doses of busulfan compared to total body irradiation7. 
We have successfully used busulfan-induced chimerism to investigate BMDCs in wild-type mice, as well as in mouse models of the neurodegenerative disorders amyotrophic lateral sclerosis (ALS)7 and Alzheimer disease. It has been observed that under certain conditions significant numbers of GFP+ BMDCs accumulate within the CNS7,12. Importantly, like myeloablative conditioning with irradiation, busulfan conditioning followed by BMT is sufficient to allow for GFP+ BMDC accumulation within the CNS in both wild-type mice, and mice with neurological disorders7&#8211;11. As a major obstacle in treating neurodegenerative disorders is the ability to get therapeutic molecules from the circulation into the CNS where they can exert beneficial effects, this raises the possibility that BMDCs could be engineered to express therapeutic molecules, and subsequently used as a vehicle to deliver therapeutics to the CNS of busulfan conditioned recipients, a mechanism we are actively investigating. Although we have found that myeloablative conditioning with irradiation leads to greater accumulation of GFP+ BMDCs in the CNS compared to busulfan conditioning7, irradiation may have considerable toxicity in patients with neurodegenerative disorders and in murine models of CNS disease.
While we, and many others, have used BMT models to study BMDCs in neurodegenerative disorders, the ability to largely replace the BM compartment of a recipient mouse with a distinctly identifiable population of BM cells is an invaluable tool for studying various aspects of the hematopoietic system. This includes a wide array of research topics such as hematopoietic lineage development, leukemia, organ transplantation, graft-versus-host disease, and immunobiology.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="726">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:224px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Busulfex</td>
			<td style="width:224px;">Otsuka Canada Pharmaceutical Inc.</td>
			<td style="width:119px;">DIN 02240602</td>
			<td>Dilute busulfan to 3 mg/mL with sterile PBS just prior to use. Busulfan is cytotoxic. Handle and dispose according to the MSDS and institutional guidelines.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ACK Lysing Buffer</td>
			<td style="width:224px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A10492-01</td>
			<td>Other lysis buffer could be substituted but incubation times may need to be adjusted accordingly</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:224px;">Life Technologies</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

busulfan as a myelosuppressive agent for generating stable high-level bone marrow chimerism in mice

Bone marrow transplantation (BMT) is often used to replace the bone marrow (BM) compartment of recipient mice with BM cells expressing a distinct biomarker isolated from donor mice. This technique allows for identification of donor-derived hematopoietic cells within the recipient mice, and can be used to isolate and characterize donor cells using various biochemical techniques. BMT typically relies on myeloablative conditioning with total body irradiation to generate niche space within the BM compartment of recipient mice for donor cell engraftment. The protocol we describe here uses myelosuppressive conditioning with the chemotherapeutic agent busulfan. Unlike irradiation, which requires the use of specialized facilities, busulfan conditioning is performed using intraperitoneal injections of 20 mg/kg busulfan until a total dose of 60-100 mg/kg has been administered. Moreover, myeloablative irradiation can have toxic side effects and requires successful engraftment of donor cells for survival of recipient mice. In contrast, busulfan conditioning using these doses is generally well tolerated and mice survive without donor cell support. Donor BM cells are isolated from the femurs and tibiae of mice ubiquitously expressing green fluorescent protein (GFP), and injected into the lateral tail vein of conditioned recipient mice. BM chimerism is estimated by quantifying the number of GFP+ cells within the peripheral blood following BMT. Levels of chimerism&nbsp;>80% are typically observed in the peripheral blood 3-4 weeks post-transplant and remain established for at least 1 year. As with irradiation, conditioning with busulfan and BMT allows for the accumulation of donor BM-derived cells within the central nervous system (CNS), particularly in mouse models of neurodegeneration. This busulfan-mediated CNS accumulation may be more physiological than total body irradiation, as the busulfan treatment is less toxic and CNS inflammation appears to be less extensive. We hypothesize that these cells can be genetically engineered to deliver therapeutics to the CNS.

ブスルファンの60〜10mg / kgの投与は、一般的にマウスが許容される。しかし、動物は、一般的に、コンディショニング相（〜5から10までパーセント）の間に体重を減らすため、食事は、そのような食べることを奨励するために照射ヒマワリの種のような扱いで補充する必要があるかもしれません。末梢血中の&gt; 80％のGFP +細胞のキメラ現象とBMのレベルは60〜100 mg / kgをブスルファン7を</sup...

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Busulfan as a Myelosuppressive Agent for Generating Stable High-level Bone Marrow Chimerism in Mice

We describe a protocol whereby busulfan conditioning permits the bone marrow of a recipient mouse to be replaced with bone marrow cells from donor mice ubiquitously expressing green fluorescent protein, in the absence of irradiation. This technique is useful to study bone marrow cell accumulation in the central nervous system.

マウスにおける安定な高レベルの骨髄キメラ現象を生成するための骨髄抑制剤としてブスルファン

Bone marrow transplantation (BMT) is often used to replace the bone marrow (BM) compartment of recipient mice with BM cells expressing a distinct ...

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13.1K ビュー.  Simon Fraser University. We describe a protocol whereby busulfan conditioning permits the bone marrow of a recipient mouse to be replaced with bone marrow cells from donor mice ubiquitously expressing green fluorescent protein, in the absence of irradiation. This technique is useful to study bone marrow cell accumulation in the central nervous system.