Diese Methode kann uns helfen, die Bewegungen der Blutgefäße innerhalb der Mausleber entlang der Evolution der Dynamik der Leber in mehreren Dimensionen zu visualisieren. Mit dieser Methode können wir die Dynamik der Blutgefäße in der Leber in drei Dimensionen visualisieren. Wir haben die Verwendung von Gefäßfarbstoff demonstriert, aber Sie können die Gefäßfärbung mit Ihrer Substanz von Interesse vor der mikroskopischen Visualisierung durchführen.
Nach der Bestätigung eines Mangels an Rechten Reflex in einem anästhetisierten acht Wochen alten männlichen C 57 schwarze sechs Maus. Wischen Sie den Schwanz der Maus mit 75% Alkohol ab und verwenden Sie eine Ein-Mikroliter-Spritze, die mit einer 30-Meter-Nadel ausgestattet ist, um 10 Milligramm pro Milliliter frisch zubereitetes Rhodamine B Isothiocyanat-Dextran in 100 Mikroliter Rhodamine B Isothiocyanat-Dextran in die kaudale Schwanzvene zu injizieren. Wenn die gesamte Lösung geliefert wurde, verwenden Sie einen Wattestäbchen, um Druck auf die Punktionsstelle auszuüben und Gaze nass mit sterilem Wasser zu verwenden, um das Bauchfell einzuweichen.
Verwenden Sie ein Rasiermesser, um den Bauch zu rasieren, Machen Schläge in Richtung des Fells, und legen Sie die Maus auf eine 37 Grad Celsius, Alkohol desinfiziert Heizungspad. Um die Mausleber mit einem Körperorgan-Bildrahmen zu fixieren, legen Sie zuerst einen sauberen Saugnapf mit fünf Millimeterdurchmessern in eine feste Position und wischen Sie das Heizkissen und den Saugnapf mit 75% Alkohol ab. Schließen Sie den Saugnapf an den Vakuumpumpenschlauch an und schalten Sie die Pumpe ein.
Auf einem 75%Alkohol sterilisierten Tisch verwenden chirurgische Schere, um zwei Zentimeter Haut von der unteren Brustrand der Maus zu schneiden und die Leber auszusetzen. Legen Sie die Maus und das Heizkissen auf die Halterung des Körperrahmens und stellen Sie die Organbildleuchte so ein, dass der Saugnapf die Leber halten kann. Dann verwenden Sie einen Unterdruck von 30 bis 35 Kilopascal zum Absaugen, so dass die Leber an der Tasse befestigt wird.
Um das Multiphoton Laser Scanning Microscope einzurichten, schalten Sie das Mikroskop ein und wählen Sie das 60 X Objektiv aus. Fixieren Sie den Rahmen und die Maus unter dem Objektiv und fügen Sie einen Tropfen normaler Saline zur Tasse hinzu, die groß genug ist, um die Linse zu bedecken. Passen Sie das Objektiv so an, dass die Linse nur die normale Saline berührt und schalten Sie die Lasersoftware ein.
Schalten Sie den Laser ein und halten Sie den Ein-/Ausschalter und den Auslöser für drei Sekunden gedrückt. Starten Sie dann die Mikroskop-Betriebssoftware und stellen Sie den Laser auf 800 Nanometer ein. Um die Bildaufnahmesteuerung einzustellen, klicken Sie auf den Leuchtstoffschalter und schalten Sie die Raum- und Geräteleuchten aus.
Öffnen Sie den Lichtpfadverschluss am Mikroskop und drehen Sie den Fluoreszenzfilter auf den vierten Gang. Ziehen Sie die beiden Hebel des optischen Schalters und schauen Sie durch das Augenstück, verwenden Sie den Kurs und feine Fokussier quasi Spiralen, um die Brennweite einzustellen. Verwenden Sie dann die X Y-Achsen, um das Sichtfeld anzupassen, um den Zielbereich zu finden.
Schalten Sie für die Bildgebung den Leuchtstoffschalter in der Software aus und schalten Sie den Leuchtstofffilter auf den zweiten Gang um. Drücken Sie die beiden Hebel des optischen Schalters und klicken Sie auf Fokuszeiten zwei, um die Erfassungseinstellungen und die Bildaufnahmesteuerungsparameter und die Drucksteuerung plus C in der Vorschau anzuzeigen, um die Hochspannungsverstärkung und den Offset anzupassen. Klicken Sie auf Stopp, um die Vorschau zu beenden, klicken Sie auf die Schaltfläche X Y, um in zwei Dimensionen zu scannen, und klicken Sie auf Speichern.
Wählen Sie einen Bereich aus, und klicken Sie auf Tiefe und Vorschau, um das Ende und die Startsätze in den Mikroskopeinstellungen auszuwählen. Scannen Sie 3D-Bilder und speichern Sie sie. Wählen Sie nach dem Scannen eine Region aus, klicken Sie auf Zeit, und passen Sie die anderen Erfassungseinstellungen und bildaufnahmegesteuerten Parameter an.
Scannen Sie dann die verschiedenen Slices und speichern Sie, um den resultierenden Imagefilm zu erhalten. Hier kann eine Visualisierung der Verteilung der Blutgefäße in der Leber mittels Multi-Photonenmikroskopie beobachtet werden. Dieses Blutgefäß ist in eine Vielzahl von Zweigen unterteilt, die aus einem Stamm stammen und in den umgebenden Raum verteilt sind.
Der äußere Umfang des Blutgefäßes kann rot beobachtet werden, während die innere Höhle dunkel ist, wie im Video beobachtet, dass nicht rote Objekte, die sich innerhalb der Gefäße bewegen, Zellen sein könnten. Die Dunkelheit des Gewebes in diesem Video beobachtet ist wahrscheinlich aufgrund der Leber nicht gut im Laufe der Zeit fixiert worden. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass, wie narbenlose Leber fixiert ist, die Stabilität des Bildes beeinflusst.
Diese Methode kann auch auf die Position anderer Strukturen innerhalb der Leber angewendet werden, um die Verteilung oder Veränderungen in bestimmten Arbeitsstrukturen von Interesse direkt zu beobachten.
