Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es zum ersten Mal ermöglicht, die Wirkung einer Bakterienspezies auf Zellen des enterischen Nervensystems zu untersuchen. Da das enterische Nervensystem nicht leicht zugänglich ist, ermöglicht dieses Modell, die Wirkung des Darmmikrobioms auf Zellen des enterischen Nervensystems zu untersuchen. In Zukunft kann mit diesem Modell beobachtet werden, wie sich das Darmmikrobiom erkrankter Patienten auf Zellen des enterischen Nervensystems auswirkt, zum Beispiel bei der Parkinson-Krankheit.
Ein mögliches zukünftiges Ziel wäre es, dieses Modell mit anderen Organ-on-Chip-Modellen zu verbinden, um ein Modell zu erstellen, das die Darm-Hirn-Achse repräsentiert. Die visuelle Demonstration dieser Technik ist von entscheidender Bedeutung, da das Protokoll viele Schritte umfasst und jeder Schritt für die erfolgreiche Umsetzung dieses Modells entscheidend ist. Dieses Verfahren wird Catherine Sedrani, Doktorandin am Labor für Systemökologie, demonstrieren.
Ziehen Sie zunächst die Schrauben fest, die den oberen und unteren Teil der Klemme sichern, und übertragen Sie den beschichteten und getrockneten unteren Polycarbonatdeckel von der quadratischen Petrischale auf die Oberseite der Klemmbasis, indem Sie die vier Schrauben an der Ecke des Deckels festhalten. Verwenden Sie eine sterile Pinzette, um die Epithelkammerdichtung mit der Membran nach oben auf dem Polycarbonatdeckel zu positionieren. Richten Sie die Dichtung und den Deckel mit Schrauben aus und stellen Sie sicher, dass die Eckeinlass- und -auslassöffnungen mit den Dichtungsöffnungen ausgerichtet sind.
Legen Sie die Sandwichdichtung mit der Oberseite nach oben auf die Kollagendichtung. Setzen Sie dann den oberen Polycarbonatdeckel auf die Sandwichdichtung. Stellen Sie sicher, dass die Widerhaken am Klemmdeckel mit der Einlass- und Auslassöffnung der Membranbaugruppen ausgerichtet sind und dass die unteren Deckelschrauben auf die Öffnung des oberen Deckels passen.
Um das Gerät zu schließen, setzen Sie den Klemmdeckel auf den Polycarbonatdeckel und schließen Sie die Verriegelungen. Für die Ansaugung der Schlauchleitungen führen Sie die Belüftungsnadeln mit Filtern in das Septum jeder Zu- und Abflussflasche ein. Führen Sie mit einer sauberen, sterilen Pinzette die 120-Millimeter-Nadeln in die 250-Millimeter-Serumflaschen und die 80-Millimeter-Nadeln in die 15-Millimeter-Serumflaschen ein.
Führen Sie die 40-Millimeter-Nadeln am Ende jeder Schlauchleitung in eine Ausfluss-Serumflasche ein. Die 40-Millimeter-Nadeln der epithelialen und neuronalen Schlauchleitungen sind mit derselben Ausflussflasche verbunden, um das Medium zu entsorgen. Die Bakterienschlauchleitung führt zur zweiten Ausflussflasche.
Führen Sie die Pumpenschlauchleitungen in die Pumpenkassetten ein. Stellen Sie die Schlauchpumpe so ein, dass sie Medien mit einer Geschwindigkeit von fünf U/min vom Zufluss zur Auslaufflasche leitet, und drücken Sie die Starttaste, um die Pumpe zu starten. Stellen Sie sicher, dass die Dreiwegehähne der Schlauchleitungen alle geöffnet sind.
Sobald das Medium in die Abflussflaschen tropft, stellen Sie sicher, dass keine Leckagen oder Luftblasen in den Schlauchleitungen und Verbindungsstellen vorhanden sind. Wenn alle Schlauchleitungen in die Abflussflaschen fallen, stellen Sie die Durchflussrate auf zwei Umdrehungen pro Minute ein, um das erste Gerät anzuschließen. Um eine Leitung anzuschließen, schließen Sie die Dreiwege-Absperrventile, beginnend mit der Abflussseite.
Löse den kurzen Schlauch von der weiblichen Köderverbindung und befestige ihn an der Auslassöffnung des Geräts, indem du den Schlauch über den Widerhaken schiebst. Für eine sichere, leckagefreie Verbindung schieben Sie den Schlauch ganz nach unten über den Stecker und stellen Sie sicher, dass er den Deckel berührt. Öffnen Sie den Absperrhahn, sobald eine Leitung vollständig an das Gerät angeschlossen ist.
Stellen Sie die Durchflussmenge der Pumpe auf zwei U/min ein und erhöhen Sie die Pumpendrehzahl auf maximal 2,5 U/min, um Leckagen durch Druckaufbau zu vermeiden. Lassen Sie die Pumpe die Kammern ansaugen. Reduzieren Sie die Pumpendrehzahl auf 0,5 U/min, sobald alle Kammern mit dem Zellkulturmedium gefüllt sind und keine Blasen mehr im Gerät verbleiben.
Für die Epithelzellen werden die Caco-2-Zellen mit Trypsin-EDTA aus dem Kolben gelöst. Resuspendieren Sie sie in RPMI 1640 plus 10 % FBS und zählen Sie sie in einem Neubauer-Zellzähler mit dem Trypanblau-Ausschluss-Assay. Zentrifugieren Sie die Caco-2-Zellen-Suspension drei Minuten lang bei 300 G und verwerfen Sie den Überstand, um die verbleibenden Trips in EDTA zu entfernen.
Resuspendieren Sie die Caco-2-Zellen in RPMI 1640 plus 10 % FBS, um eine Suspension von 0,35 Millionen Zellen pro Milliliter zu erhalten. 1,5 Milliliter der Caco-2-Zellsuspension in eine sterile Zwei-Milliliter-Spritze überführen und alle verbleibenden Luftblasen in der Spritze entfernen. Schließen Sie die Dreiwege-Absperrventile an den Schläuchen der Bakterien- und der neuronalen Kammer und trennen Sie die Schläuche von der Pumpe, indem Sie die Kassetten mit den entsprechenden Schläuchen vom Rotor entfernen.
Öffnen Sie die Kappe des Absperrhahns des Zuflussschlauchs, der zur Epithelkammer führt, und drehen Sie das Ventil, um den Mediumstrom vom Gerät zum offenen Anschluss umzuleiten. Lassen Sie das Medium fließen, bis ein Tropfen des Mediums am offenen Ende des Absperrventils erscheint. Führen Sie die Spritze mit Epithelzellen in den offenen Konnektor ein, indem Sie die Tropfen-Tropfen-Verbindungsmethode verwenden, um das Eindringen von Luftblasen während des Einführens zu verhindern.
Drehen Sie das Ventil des Absperrhahns, um den Durchfluss des Mediums aus der Zulaufflasche zu stoppen und den Fluss von der angeschlossenen Spritze zum Ausgangsgerät zu ermöglichen. Trennen Sie die Epithelkammer von der Pumpe und drücken Sie langsam auf die Spritze, um die Epithelkammer mit 1,5 Millilitern Zellsuspension zu impfen. Schließen Sie das Ventil des Abflusshahns und trennen Sie die Spritze.
Schließen Sie das offene Ende des Absperrhahns mit der Kappe und halten Sie die Kammer mindestens zwei Stunden lang geschlossen. Impfen Sie in der Zwischenzeit die neuronalen Zellen. Nachdem Sie das Gerät aus dem Inkubator genommen und die Schlauchleitungen entfernt haben, öffnen Sie langsam die Klemme und entfernen Sie den Deckel.
Entfernen Sie den oberen Polycarbonatdeckel vorsichtig. Sammeln Sie das Medium in einem 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen und legen Sie es auf Eis. Entfernen Sie vorsichtig die Sandwichdichtung, während Sie das Medium aus der Epithelkammer auffangen, ohne die Zellschicht zu berühren.
Legen Sie die Sandwichdichtung in eine quadratische Petrischale und geben Sie sterile 0,9%ige Natriumchlorid- und Wasserlösung in die Bakterienkammer, bis die Kammer vollständig bedeckt ist. Entfernen Sie langsam die Kollagendichtung, während Sie das Medium aus der neuronalen Kammer sammeln. Nachdem Sie das Medium in ein Mikrozentrifugenröhrchen umgefüllt haben, stellen Sie die Röhrchen auf Eis.
Legen Sie die Kollagendichtung in eine quadratische Schale und geben Sie vorsichtig einige Milliliter PBS in die Caco-2-Schicht, bis die Zellschicht vollständig bedeckt ist. Legen Sie den unteren Polycarbonatdeckel in eine quadratische Petrischale und geben Sie vorsichtig etwa zwei Milliliter PBS auf die neuronalen Zellen, damit sie während des Probenahmevorgangs nicht austrocknen. Zentrifugieren Sie das Medienröhrchen fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius.
Nachdem Sie die Überstände jedes Röhrchens in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen umgefüllt haben, stellen Sie es sofort auf Trockeneis. Die KBE-Anzahl wurde für zwei verschiedene Ersteinstellungen des Geräts bewertet. L. reuteri kokultivierte mit Caco-2 und L. reuteri im humanen mikrobiellen Crosstalk-Gerät.
In beiden Setups unterschieden sich die KBE-Zählungen signifikant von denen des HuMix-Inokulums und der geernteten Zellen, was auf das Wachstum der Bakterienzellen im Inneren des ursprünglichen Geräts hindeutet. Um zu beurteilen, ob die Kultivierung der enterischen Neuronen im Gerät den Zellphänotyp verändert, wurde ihre grobe Morphologie mit einem inversen Phasenkontrastmikroskop beobachtet. Die Etablierung eines konfluenten neuronalen Netzwerks deutete darauf hin, dass die Zellen gut an den beschichteten Polycarbonatdeckel des Geräts gebunden waren.
Die Kante zwischen dem konfluierenden neuronalen Netzwerk und der durch die Dichtung abgegrenzten Spirale war deutlich zu erkennen. Das Potenzial von Neurohumika liegt in der Beantwortung von Fragen, die bisher aufgrund des Fehlens eines repräsentativen Modells schwierig zu beantworten waren, nämlich die Wechselwirkungen zwischen dem Mensch-Darm-Mikrobiom und dem enterischen Nervensystem.
