Die Organkultur vom Trowell-Typ wird zur Kultivierung von Gewebeexplantaten verwendet. Hier zeigen wir, wie man mit dieser Methode die Stammzellen in kontinuierlich wachsenden Zähnen untersuchen kann. Mit dieser Technik können wir die Stammzellen und ihr Verhalten in der Nische untersuchen und die Wirkung verschiedener Moleküle auf das Überleben und die Erhaltung von Stammzellen untersuchen.
Diese Methode kann auch angewendet werden, um die Stammzellen anderer Organe wie Haut oder Brustdrüse zu untersuchen. Beginnen Sie, indem Sie 30-Millimeter-Metallgitter mit Löchern mit einem bis zwei Millimetern Durchmesser in eine 35-Millimeter-Petrischale legen. Füllen Sie den Ort mit Medien, bis das Medium die Rasteroberfläche erreicht.
Dann inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius, bis das Gewebe isoliert und bereit für die Kultur ist. Nachdem Sie die Maus enthauptet haben, entfernen Sie die Haut, um den Unterkiefer freizulegen, und schneiden Sie durch die Massetermuskeln, um den Unterkiefer vom Oberkiefer und dem Rest des Kopfes zu trennen. Sobald der Unterkiefer isoliert ist, entfernen Sie die Zunge und das maximale Weichgewebe.
Teilen Sie den Unterkiefer an der Mittellinie, indem Sie die Symphyse durchschneiden. Legen Sie den Unterkiefer in die Petrischale mit PBS auf das Eis. Verwenden Sie eine Einweg-20 x 26 Gauge Injektionsnadel, um den Schneidezahn zu sezieren.
Reinigen Sie dann das Weichgewebe und das Muskelgewebe von der Knochenoberfläche für eine bessere Visualisierung. Bei Unterkiefern, die von Tieren stammen, die jünger als 10 Tage sind, verwenden Sie Einweg-Injektionsnadeln von 20 x 26 Gauge, um jede Hälfte des Unterkiefers längs zu öffnen, um den Schneidezahn freizulegen. Lösen Sie den Schneidezahn vorsichtig vom umgebenden Knochen.
Schneiden Sie das proximale Ende, das die Zervixschlinge enthält, ab und entfernen Sie den mineralisierten Zahnschmelz und die Dentinmatrix. Bewahren Sie die gesammelten proximalen Enden in Dulbeccos PBS auf Eis, bis sie zur Kultur bereit sind. Bei Mäusen, die älter als 10 Tage sind, öffnen Sie jede Hälfte des Unterkiefers längs, um den Schneidezahn freizulegen.
Verwenden Sie eine Pinzette, um den Unterkiefer zu greifen und den Knochen zu brechen, um den Zahn freizulegen. Schneiden Sie das proximale Ende, das die Zervixschleife enthält. Bewahren Sie die gesammelten proximalen Enden in Dulbeccos PBS auf Eis, bis sie zur Kultur bereit sind.
Platzieren Sie die Rechteckfilter vorsichtig oben auf dem Gitter in einer vorgewärmten Kulturschale und richten Sie die Gewebestücke richtig aus. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid und 90 bis 95% Feuchtigkeit. Wechseln Sie das Medium an wechselnden Tagen vorsichtig und vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen.
Überwachen Sie das Gewebewachstum und erfassen Sie täglich Bilder. Entfernen Sie das Kulturmedium aus der Schale und geben Sie vorsichtig eiskaltes Methanol in das Gewebe. Dann inkubieren Sie es für fünf Minuten.
Einen Filter, der das Gewebeexplantat trägt, in das mit Fixierlösung gefüllte Probenahmeröhrchen geben. Fixieren Sie die Explantat in 4% Paraformaldehyd, das in PBS für maximal über Nacht bei vier Grad Celsius hergestellt wurde. Die epithelialen Stammzellen befinden sich in einer Nische, die als zervikale Schleife bezeichnet wird und sich am proximalen Ende des Schneidezahns befindet.
Die zervikale Schleife besteht aus einem inneren und äußeren Schmelzepithel, das das Sternretikulum, einen Kern locker angeordneter Epithelzellen, umhüllt. Jeder Schneidezahn hat eine labiale und eine linguale Zervixschlinge, aber nur die labiale Zervixschleife enthält die Stammzellen. Das proximale Ende eines Schneidezähnes, isoliert aus zweitägigen postnatalen Sox2-GFP-Mäusen, wurde erfasst, was die Identifizierung und Visualisierung der Sox2-exprimierenden Schneidepithelstammzellen ermöglichte.
In zervikalen Schleifen, die aus den transgenen Mäusen Sox2-GFP und Fucci Red isoliert wurden, wurden GFP-positive Stammzellen und Fucci-rot-positive nicht-proliferative Zellen identifiziert. Die Sox2-GFP-Expression wurde als Reporter verwendet, um die Wirkung des Wnt/beta-Catenin-Signalaktivators BIO zu analysieren, der sowohl Sox2-exprimierende Stammzellen als auch die GFP-Expression negativ beeinflusste. Diese Technik kann für die Live-Bildgebung des Stammzellverhaltens optimiert werden.
Gepresste oder kultivierte Explantate können auch enzymatisch zu einzelligen Suspensionen zur weiteren Analyse verarbeitet werden.
