Die Wechselwirkungen zwischen den bösartigen Gliomzellen und ihren umgebenden Neuronen gewinnen an Interesse. Hier zeigen wir die Entwicklung eines In-vitro-Modells, das abgeleitete kortikale glutamaterge Neuronen und Tumorzellen kokulturiert. Die mikrofludischen Geräte, die für Co-Kulturen verwendet werden, die an Multielektrodenarrays gekoppelt sind, ermöglichen die Untersuchung verschiedener Zelltypen und die Durchführung elektrischer Aktivitätsaufzeichnungen zu verschiedenen Zeitpunkten der Kulturen.
Diese Methode ist besonders hilfreich für funktionelle und mechanistische Studien und für die Analyse der Wirkungen pharmakologischer Wirkstoffe, die die pädiatrische Migration hochgradiger Gliomzellen und die Interaktion mit Neuronen blockieren. Um mit der Kultivierung der kommerzialisierten menschlichen IPS-abgeleiteten kortikalen glutamatergen Neuronen zu beginnen, leeren Sie die Ein- und Austrittsreservoirs des mikrofluidischen Geräts durch Pipettenaspiration und lassen Sie nur die Gerätekanäle mit Medium füllen. Säen Sie die menschlichen IPS-Zellen, indem Sie 10 Mikroliter von 6,5 Millionen menschlichen IPS-Zellen pro Milliliter-Suspension in das Medium geben und das Gerät für 15 Minuten unter der Haube lassen, damit sich die Zellen anheften können.
Füllen Sie nach 15 Minuten sowohl die Einlass- als auch die Auslassbehälter mit 50 Mikrolitern des Kulturmediums des vierten Tages und geben Sie das Gerät dann in den Inkubator, um die Zellen 23 Tage lang bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid zu halten. Ersetzen Sie das Medium alle drei bis vier Tage, wie im Text beschrieben. Um die Zellen zu zählen und die Lebensfähigkeit mit einem Standard-Phasenkontrastmikroskop zu beurteilen, machen Sie mikroskopische Bilder am 4., 21. Tag und 23. Tag.
Kultur sowohl UW479- als auch BT35-Zelllinien in DMEM und F-12 GlutaMAX, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum in einem Zellkulturkolben. Halten Sie die Zellkultur während des gesamten Experiments unter einer kontrollierten Umgebung bei 37 Grad Celsius unter normoxischen Bedingungen aufrecht. Beobachten Sie jede Zelllinie, um eine Konfluenz von 80% zu erreichen.
Beginnen Sie am Tag 21 nach der Kultur von glutamatergen Neuronen mit der Co-Kultur, indem Sie UW479- und BT35-Zellen trypsinisieren. Säen Sie die trypsinisierten UW479- und BT35-Zellen auf die reifen adhärenten glutamatergen Neuronen in jedes dedizierte mikrofluidische Gerät. Halten Sie die Co-Kulturen für zwei Tage unter einer kontrollierten Umgebung bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid mit glutamaterge Neuron D11 und höherem Medium.
Zählen Sie pädiatrische hochgradige Gliomzellen anhand der mit der Bildanalysesoftware analysierten mikroskopischen Bilder, um ihre Lebensfähigkeit zu beurteilen und den Prozentsatz der Zellen zu berechnen. Platzieren Sie das MFD im Aufnahmegerät und verwenden Sie eine handelsübliche Software, um die elektrophysiologische Aufzeichnung von glutamatergen Neuronen am 21. Tag durchzuführen. Bevor Sie pädiatrische hochgradige Gliomzellen aussäen, führen Sie eine zweite elektrophysiologische Aufzeichnung der differenzierten glutamatergen Neuronen durch, die parallel zur Kokultur als Kontrolle kultiviert wurden.
Führen Sie am 23. Tag nach zwei Tagen der Kokultur eine weitere elektrophysiologische Aufnahme durch. Humane IPS-abgeleitete kortikale glutamaterge Neuronen wurden unter Verwendung von Nestin, SOX2, metabotropen Glutamatrezeptoren II und VGLUT1-Immunfärbung charakterisiert und bewertet. Nestin ist ein intermediäres Filamentprotein und wurde in undifferenzierten ZNS-Zellen exprimiert.
SOX2 wurde auch in undifferenzierten Zellen des neuronalen Epithels im ZNS exprimiert. Der Prozentsatz der Nestin- und SOX2-positiven Zellen nahm vom vierten Tag bis zum 21. Tag ab, was den differenzierten Zustand der glutamatergen Neuronen bestätigt. Die mikroskopischen Bilder zeigten eine progressive Verteilung von glutamatergen Neuronen über mikrofluidische Geräte.
Als BT35 und UW479 der Kultur hinzugefügt wurden, wurde beobachtet, dass die schwimmenden Zellen nach der Gliomzellaussaat am 21. Tag vorhanden waren, die bis zum 23. Tag progressiv verschwanden und im Gerät hafteten. Die Prozentsätze lebensfähiger Zellen für BT35 und UW479 waren vergleichbar und implizierten, dass von Patienten abgeleitete Zelllinien angemessen verwendet werden könnten. Spike-Erkennung und Raster-Plot am 23. Tag der Kultur zeigten erhöhte elektrische Aktivität nach dem Hinzufügen von pädiatrischen hochgradigen Gliomzellen.
Um die Synchronizität der neuronalen Netzwerkaktivität zu überwachen, wurde die momentane Feuerrate in BT35- oder glutamatergen Neuronen aufgezeichnet. Der Unterschied in der elektrischen Aktivität zwischen den einzeln kultivierten und kokultivierten glutamatergen Neuronen war am 23. Tag signifikant. Weitere methodische Entwicklungen können die funktionelle Bewertung des Netzwerks mit Burst-Analyse und speziellen zeitlichen Querkorrelationen des Netzwerks umfassen.
Jetzt haben Forscher ein vielversprechendes Werkzeug, um Interaktionen und pharmakologisches Targeting von pädiatrischen hochgradigen Gliom-Tumorlinien und hohen PSC-Neuronen zu erforschen. Mehrere Tumorlinien und mehrere Neuronentypen könnten verwendet werden.
