. Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Zuschuss aus den Natur- und Ingenieurwissenschaften Research Council of Canada Kim Gilbert unterstützt hält ein Stipendium vom Fonds de la recherche du Québec - Santé.

Die Tiere werden in Übereinstimmung mit der Verordnung des lokalen Animal Care Committee behandelt, in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care. Die Ratten werden individuell unter konstanten Bedingungen untergebracht (Temperatur von 21-22 ° C und einer Luftfeuchtigkeit von 40-50%), einschließlich einer 12 h Hell-Dunkel-Zyklus, beginnend um 08.00 Uhr. Chow Pellets und Leitungswasser sind ad libitum während der gesamten Studie. Einer Eingewöhnungszeit von 3 Tagen nach Lieferung durch den Lieferanten wird vor dem Experiment erlaubt. Männliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht zwischen 300-800 g wurden routinemäßig mit diesem Protokoll verwendet. 1. MI-Chirurgie <ol><li> Induzieren Anästhesie mit intraperitonealen Injektionen von Ketamin 60 mg / kg und Xylazin 10 mg / kg. Überprüfen Sie die ordnungsgemäße Betäubung durch Abwesenheit von Reflex, wenn die Pfoten eingeklemmt werden. </li><li> Rasur Operationsstelle. Intubieren Ratte mit Endotrachealtubus: Katheter (16G 1,77 Zoll) und legen Tier in Seitenlage. Legen Sie die Tiere auf einem Heizkissen auf die Temperatur um 37 ° C zu halten. Verbinden Sie den Endotrachealtubus bis 2% Isofluran. </li><li> Bereiten Operationsstelle mit Chlorhexidingluconat und Isopropylalkohol. Während der Operation verwenden sterile Handschuhe und sterilisierten Instrumente. Bewerben Augensalbe für beide Augen bis zur Trockenheit während der Narkose zu verhindern. Setzen sterilen Bereich auf tierische und die Instrumente auf einem anderen sterilen Bereich neben dem Tier. </li><li> Einzuschneiden Haut mit Skalpellklinge # 10. Ziehen Sie weg Muskelgewebe mit einem blutstillenden Klemme. Legen Sie das Tier in ventralen Dekubitus-Position. Offene Brustwand mit einem blutstillende Klammer und Position der Brust Aufroller. Offene Herzbeutel mit einem blutstillenden Klemme. </li><li> Zur Herstellung Koronarverschluss, Schleife eine 360 ​​mm lange 4-0 Seidennaht auf der absteigenden Koronararterie, die durch die angrenzenden Herzmuskelgewebe. Stecken Sie die beiden Enden des Seidenfaden in ein 14G, 1,25 cm langen Kunststoffrohr. </li><li> Ziehen Sie die beiden Enden des Seidennaht und Eiterh das Rohr nach unten gegen die Arterie, um sie zu verschließen, für 40 Minuten. Sicheren Verschluß durch Klemmen des Kunststoffrohr mit einem hämostatischen Klemme. </li><li> Nach 40 min, lassen Sie die Okklusion durch Lösen der hämostatischen Klemme, gefolgt vom Entfernen des flexiblen Schlauches und Seidennaht. Anmerkung: Sham Kontrollratten unterziehen desselben chirurgischen Eingriffs minus die Okklusion der Koronararterie. </li><li> Vor dem Schließen der Brustwand, legen einen flexiblen Katheter (18 g, 4,5 cm) über der Brusthöhle, um Luft aus dem Brustkorb mit einer 5-ml-Spritze zur Pneumothorax zu verhindern, zu zeichnen. </li><li> Schließen Thoraxhöhle mit 2-0 Nahtstich den Muskel mit 4-0 Seidennaht und die Haut mit 3-0 Seidennaht. </li><li> Vor dem Schließen des letzten Haut Stelle nochmals ziehen Luft aus dem Thorax mit 5-ml-Spritze durch den Katheter vorher im Thoraxhohlraum angeordnet. </li><li> Naht letzten Hautstelle. Stoppen Isofluran Belüftung. </li><li> Überwachen Ratte Erwachen. Haben ein Tier nicht unbeaufsichtigt lassen, bis es Regained ausreichend Bewusstsein Brustlage zu halten. </li><li> Behandlung von Ratten alle 8 h 24 h mit einem Analgetikum (Buprenorphin 0,05 mg / kg ip) anästhesiert und mit einem Antibiotikum (einer Einzeldosis von duplocillin, 0,2 mg / kg ip). </li><li> Nach der Operation Haus Ratten einzeln bis zum Zeitpunkt der Tötung, dh 3 Tage nach MI. </li><li> Infarktgröße, insbesondere Nekrose, wird als das Verhältnis der Infarktgewebe im Risikobereich des linken Ventrikels ausgedrückt. Dies kann unter Verwendung von Triphenyltetrazoliumchlorid Färbung 11. </li></ol> 2. Amygdala Isolation <ol><li> Legen Sie das Tier mit dem Kopf voran in einem kegelförmigen Tasche, mit der Nase aus dem schmalen Ende Öffnung vorsteht. Sichere Ratte jede Bewegung zu vermeiden. Positionieren Sie den Kopf in geeigneter Weise auf der Guillotine, zwischen den Scherenblätter. Enthaupten Tier. </li><li> Place-Kopf der Ratte in einer Schale gehalten auf Crushed Ice. Führen Sie alle Verfahren zur Gewebetrennung auf zerstoßenem Eis (4 ° C). </li><li> Schnitten skVoll mit einer Schere vorsichtig lösen Knochenhüllen mit Bone Rongeurs durch Hochziehen und die Vermeidung von verstümmeln das Gewebe darunter. </li><li> Legen Sie die flache Klinge eines Spatels zwischen der Unterseite des Schädels und der hinteren ventralen Oberfläche des Gehirns und sorgfältig lösen Gehirn von Schädel durch leichtes Drücken der Klinge nach vorne entlang der Unterseite des Schädels, bis das Gehirn kann sich langsam nach oben aus dem gehoben werden Schädel. Entsorgen Sie den Schädel. </li><li> Zeigen Gehirn auf seiner Rückenfläche. Identifizieren Hypothalamus (Struktur vor dem Cerebellum) und schneiden das Gehirn koronal vor seinem vorderen Ende und seinem hinteren Ende hinter; Verwerfen der vorderen und hinteren Teile des Gehirns, wenn auch nicht für andere Zwecke benötigt wird. </li><li> Visualisieren Sie die Amygdala als kleine Kugeln unter den Schläfenlappen, bilateral, direkt neben dem Hypothalamus. </li><li> Flip das Gehirn flach auf seinem vorderen Ende, dorsale Oberfläche weg von der Experimentator. </li><li> Beginnen mit der linken oder der rechten Seite des Gehirns. Trennen Sie die hemiKugeln und dann die Rinde von der angrenzenden Amygdala. Geschnitten Weise über 8 mm dieses lose Kortex der Isolierung der Amygdala ermöglichen. Schneiden Sie Amygdala mit Skalpell. </li><li> Isolieren Sie die basolateralen Teil der Amygdala von seinem centromedial Teil durch Schneiden entlang der dunklen Naht, die sich über sie läuft, fast die Hälfte und die Hälfte. Diese Struktur ist nicht immer leicht erkennbar. </li><li> Setzen Amygdala Unterteile in getrennten identifiziert Fläschchen und auf zerstoßenem Eis zu halten. </li><li> Wiederholungs Dissektion Verfahren mit der anderen Hemisphäre. </li><li> Einzutauchen Fläschchen in flüssigem Stickstoff für 1 min. Halten Fläschchen in -80 ° C Gefrierschrank bis sie benötigt. </li></ol> 3. Caspase-3 Aktivität <ol><li> Vorbereitung Lysepuffer mit 0,32 M Saccharose, 1% Triton-X-100, 10 mM Tris-HCl, pH 8, 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure, 2 mM Dithiothreitol, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 10 ug / ul Leupeptin , 10 ug / ul Pepstatin A und 10 &amp; mgr; g / &amp; mgr; l Aprotinin. </li><li>Zugabe von 150 &amp; mgr; l Lysepuffer zu jeder Probe (5-10 mg). Halten Sie auf dem Eis. Beschallen jede Probe auf Eis für 5 s bei maximaler Intensität (40 W). Inkubieren Gewebe in Lysepuffer auf Eis für 30 min. Wirbel jede Probe für 5 min. </li><li> Führen Sie 3 Einfrieren / Auftauen, indem Proben abwechselnd in flüssigem Stickstoff und auf einem thermostatisch gesteuerten Heizplatte bei 37 ° C eingestellt. Zentrifuge Gewebe bei 13.000 g (4 ° C) für 10 min. Überstand vorsichtig abnehmen und halten Sie in Röhrchen auf Eis. </li><li> Sind Standardproteinkonzentrationen zwischen 0 und 10 ug / ml mit Rinderserumalbumin. Bereiten Rohlinge mit nur Puffer. </li><li> Fügen Sie 200 ul von Bradford-Reagenz zu jedem Standard. Lesen Standard bei 595 nm. Für Proteinspiegel werden 5 ul der Probe Überstand in 795 ul destilliertem Wasser und 200 &amp; mgr; l von Bradford-Reagenz. Lesen Sie jede Probe bei 595 nm und zu quantifizieren Protein mit Standardkurve. </li><li> Vorbereitung Reaktionspuffer mit 50 mM Tris-HCl, pH 7, 5 mM MgCl 2 &lt;/ sub&gt;, 1 mM Ethylenglykoltetraessigsäure, 0,1% 3-Cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-Propansulfonat und 1 mM Dithiothreitol. </li><li> Man gebe 25 &amp; mgr; g Protein im Reaktionspuffer und Caspase-3-Substrate, um positive und negative Blindproben zu erhalten. Für negative Proben, fügen Reaktionspuffer, 25 &amp; mgr; g Protein, 0,4 ul Ac-DEVD-CHO 800 uM und 0,8 ul Ac-DEVD-AMC 10 mM. Für positive Proben, fügen Sie 25 ug Protein, um Reaktionspuffer und 0,8 &amp; mgr; l von Ac-DEVD-AMC 10 mM. Verarbeiten alle negativen und positiven Proben in dreifacher Ausfertigung. Füllen Sie das endgültige Volumen jeder Probe bis zu 200 &amp; mgr; l durch Zugabe von Reaktionspuffer. </li><li> Erzeugen negative Kontrollen, indem 188,7 ul Reaktionspuffer und 0,5 ul Ac-DEVD-CHO 800 uM, 0,8 ul Ac-DEVD-AMC 10 mM und 10 ul Lysepuffer. Für positive Kontrollen, fügen 189,2 ul Reaktionspuffer, 0,8 &amp; mgr; l von Ac-DEVD-AMC 10 mM und 10 ul Lysepuffer. </li><li> Proben inkubieren undKontrollen im Dunkeln für 3 Stunden bei 37 o C. </li><li> Stop der Reaktion mit 600 ul 0,4 M Glycin und 0,4 M NaOH (pH 10) in jeder Probe und Kontrolle. </li><li> Quantifizierung Fluoreszenz durch Spektrofluorometrie bei einer Anregungswellenlänge von 365 nm und Emissionswellenlänge von 465 nm. In 2 ml destilliertem Wasser, um die Reaktion in Glasküvetten. Lesen Kontrollen und Proben für 10 Sekunden mit 1 Punkt an jedem sec. </li><li> Quantifizierung spezifischer Aktivität in jeder Probe: ((Fluorescence der negativen Proben minus Fluoreszenz der positiven Proben) x Volumen von 2,8 ml) geteilt durch (Inkubationszeit 3 ​​Stunden x Proteinmenge 25 mg). </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Unsere Erfahrung mit diesem Protokoll in den letzten 10 Jahren zu der Ermittlung der kritischen methodische Probleme. Erstens ist eine schnelle Gehirn Dissektion in einer Petrischale auf zerstoßenem Eis wichtig, Vorbereitung Qualität aufrecht zu erhalten. Zweitens muss realisiert werden, dass Gewebe Beschallung kürzer für die zerebrale Amygdala Vergleich zu anderen Arten von Geweben, wie dem Herzen (10 sec) oder der Nieren (20 sec). Drittens sollte darauf geachtet, vermischen sorgfältig das Substrat, bevor Sie die Ware in den Proben werden. Wir stießen auf veränderliche Signale, wenn das Mischfolge war unzureichend. Viertens sollten keine Blasen in der Quarzzelle vorhanden sein, wenn das Lesen der Proben. Andernfalls könnte das Signal verändert werden. Wir eine Änderung in den letzten Jahren, um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu erhöhen: Erhöhung der Substrat Volumen zu Volumen von weniger als 1 &amp; mgr; l zu vermeiden. Dennoch können kleine Veränderungen zwischen aufeinander Assays auftreten, und mindestens 3 Kontrollproben verwendet werdenSteuerung für Variationen. Fluoreszenz Maßnahmen dieser Steuerelemente werden gemittelt, und der Mittelwert wird als 100% gesetzt. Fluoreszenz Maßnahmen experimentellen Proben werden in Prozent der Kontrollproben umgewandelt. Eine weitere Einschränkung des Verfahrens ist, dass nur ein Teil des Gewebes verwendet wird und daher die Caspase-3-Aktivität unterschätzt werden kann. Tatsächlich ist das Zeitfenster der Apoptose kurz in jede gegebene Zelle und kann verfehlt werden, obwohl es in den benachbarten Bereichen tritt zum Zeitpunkt der Probenahme 1,4,15. Das Umgekehrte ist ebenfalls möglich: Apoptose konnte in Gewebeteile besonders intensiv sein, was zu einer Überschätzung der Caspase-3-Aktivität. Wir empfehlen die Verwendung von Restgewebe (Amygdala) für komplementäre Techniken wie TUNEL-Assays oder Bax / Bcl-2-Verhältnis (siehe Einleitung). Spektrofluorometrie weist wenigstens zwei Vorteile gegenüber der Western Blot. Erstens, direkt erzeugt quantitative Daten. Zweitens misst er eine enzymatischectivity selbst anstatt Protein oder RNA-Expression, die unabhängig sein können, und es ist bekannt, dass die Proteinexpression kann ohne jede Änderung in der enzymatischen Aktivität erhöht werden. Darüber hinaus kann Spektrofluorometrie auf andere Gewebe oder mit unterschiedlichen Tierarten durchgeführt werden, und kann für andere Caspase Subtypen eingestellt werden kann, mit verschiedenen Substraten, so dass sichere Vergleiche angestellt werden können. Abschließend Dieses Dokument zeigt die Verwendung Spektrofluorometrie Caspase-3-Aktivität in der Amygdala zu messen, den Nachweis, dass die Apoptose tritt in diesem Bereich des limbischen Systems 3 Tage nach MI.

Caspasen oder Cystein-abhängigen Aspartat gerichtete Proteasen sind eine Familie von Enzymen, die in verschiedenen Homöostase processess 1 beteiligt sind. Caspasen können grob nach ihrer Rolle bei der Apoptose oder Entzündung eingestuft werden. Caspase-1, -4, -5 und -12 sind in eine Entzündung involviert während die in Apoptose eingreifen kann unterklassifiziert als Initiatorcaspasen (Caspase-8 und -9) und Vollstrecker Caspasen (Caspase-3, -6 und -7 ). Caspasen spielen eine bedeutende Rolle in vielen Krankheiten, vor allem in Störungen, bei denen die Apoptose kann übermäßig sein, wie nach einem Myokardinfarkt (MI) oder zerebrale Ischämie beobachtet. Im Rattenmodell der in unserem Labor verwendete post-MI-Syndrom festgestellt wird, dass Caspase-3 ist nicht nur im Myokard, sondern auch in 2 des limbischen Systems, die bei der Steuerung der Stimmung und Emotionen 3-6 gebracht wird aktiviert. Es ist auch ersichtlich, dass Caspase-3 ist in verschiedenen Regionen aktiviertendes limbischen Systems, wie der Amygdala und Hippocampus, und diese Aktivierung Gipfel rund 3 Tage nach dem ischämischen Insult 4. Interessant ist, dass Caspase-3-Aktivität korreliert mit post-MI Verhaltensstörungen, und dessen Dämpfung durch pharmakologische und ernährungsphysiologischen Interventionen reduziert diese Verletzungen, was auf eine mögliche Verbindung zwischen Caspase-3-und Post-MI Depressionen 7-12. Caspase-3-Aktivierung kann nach verschiedenen Techniken gemessen werden. Westernblot ermittelt die enzymatischen Eigenschaften der Caspasen und aktive Enzyme sowie ihre pro-Enzymformen zu detektieren. Western-Blot, jedoch semi-quantitative und kleine Abweichungen können durch schwaches Signal-Rausch-Verhältnissen 13 verloren. Eine bessere Technik basiert auf der Spaltung eines Substrats (DEVD-AMC), die durch Caspase-3, die eine fluorogene Verbindung freigibt und spektrofluorometrisch gemessen werden kann. Caspase-3-Aktivierung ist ein zuverlässiger Marker für Apoptose. Die Messung der Apoptose can ist instabil, da das Zeitfenster für das Auftreten kurz ist, und der Nachbarzellen apoptotische Körper oder Zellen 14 phagozytieren können. Die Apoptose kann durch andere Techniken, wie Desoxyribonukleotidyltransferase dUTP nick end labeling (TUNEL) Test bestätigt werden, dass die DNA-Fragmentierung von apoptotischen Signalkaskaden 6, oder das Verhältnis der Pro- / anti-apoptotische Proteine ​​wie Bax / resultierenden erkennt Bcl2 6.

<table><tbody><tr><td>Spectroflurometer</td><td>Photon technology Instrument (now Horiba)</td><td>Ratiomaster M-40</td><td>with DeltaRAM&amp;nbsp; Random Access Monochromator&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Respirator</td><td>Harvard apparatus</td><td>683</td><td>small animal ventilation</td></tr><tr><td>Glass cuvette</td><td>NSG precision cells</td><td>3G10</td><td>Optical Glass (340-2,500 nm) 10 mm path</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Cole Parmer</td><td>4710&amp;nbsp; series</td><td></td></tr><tr><td>Spectrometer</td><td>Varian</td><td>Cary 50 Bio</td><td></td></tr></tbody></table>

caspase-3 activity in the rat amygdala measured by spectrofluorometry after myocardial infarction

Myokardinfarkt (MI) hat dramatische mittel- und langfristigen Auswirkungen auf die physiologischen und verhaltens Ebenen, aber die Mechanismen sind noch unklar. Unser Labor hat ein Rattenmodell der Post-MI-Syndrom, die eingeschränkter Herzfunktion, Verlust von Nervenzellen im limbischen System, kognitive Defizite und Verhaltens Anzeichen einer Depression zeigt entwickelt. Auf neuronaler Ebene, vermittelt Caspase-3-Aktivierung post-MI Apoptose in verschiedenen limbischen Regionen, wie der Amygdala - Spitzenwert von 3 Tagen nach der MI. Kognitiven und Verhaltensstörungen erscheinen 2-3 Wochen post-MI und diese korreliert statistisch mit Maßnahmen der Caspase-3-Aktivität. Das hier beschriebene Protokoll wird verwendet, um zu induzieren MI, sammeln Amygdala Gewebe und messen Caspase-3-Aktivität unter Verwendung Spektrofluorometrie. Um MI zu induzieren, wird der absteigenden Koronararterie für 40 Minuten verschlossen. Das Protokoll für die Auswertung der Caspase-3-Aktivierung beginnt 3 Tage nach MI: die Ratten getötet und die Amygdala isoliert rapiDLY aus dem Gehirn. Proben werden schnell in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 ° C gehalten, bis tatsächliche Analyse. Durchgeführt, um die Caspase-3-Aktivierung beurteilen Technik basiert auf der Spaltung eines Substrats (DEVD-AMC), die durch Caspase-3, die eine fluorogene Verbindung, die durch Spektrofluorometrie gemessen werden kann, freisetzt. Die Methodik ist quantitativ und reproduzierbar, aber die erforderliche Ausrüstung ist teuer und das Verfahren für die Quantifizierung der Proben ist zeitaufwendig. Diese Technik kann auf anderen Geweben, wie Herz und Niere verwendet werden. DEVD-AMC durch andere Substrate ersetzt werden, um die Aktivität von anderen Caspasen messen.

Die Amygdala wurde in 8 sham (Kontrolle) und 8 MI-Ratten drei Tage nach der Induktion der Ischämie / Reperfusion-Protokoll isoliert. Caspase-3-Aktivität wurde in diesem Gewebe mit Hilfe eines Fluorochroms, die durch aktive Caspase-3 gespalten und spektrofluorometrisch detektiert werden kann, gemessen. Positive und negative Messwerte (siehe Schritte 3.11, 3.12 und 3.16) wurden dreifach während 10 Sekunden durchgeführt und gemessen, wobei 1 Punkt an jedem sec. Unterschiede zwischen den positiven und negativen Kontrollen berechnet und der Mittelwert der Differenzen für alle Scheingewebe während dieses Experiment durchgeführt wurde auf 100% gesetzt. Ergebnisse aus MI-Ratten wurden nach dieser Referenz skaliert und Abbildung 1 zeigt die Endergebnisse: zeigt eine signifikant höhere Aktivität im MI-Ratten gegenüber Sham (p &lt;0,05). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53207/53207fig1.jpg" /> Abbildung 1. Caspase-3-Aktivität in der Amygdala von MI-Ratten, ausgedrückt als Prozentsatz der mittleren Aktivität in Schein-Kontrollen, um 100% (8 Ratten pro Gruppe) festgelegt. * Zeigt signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen (p &lt;0,05). Die Daten sind als Mittelwert ± SEM ausgedrückt.

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Caspase-3 Activity in the Rat Amygdala Measured by Spectrofluorometry After Myocardial Infarction

Myocardial infarction (MI) is not only followed by impaired cardiac function but also by apoptosis in the amygdala, a brain region involved in the behavioral consequences of MI. This protocol describes how to induce MI, collect amygdala tissue and measure caspase-3 activity, a marker of apoptosis, therein.

Caspase-3-Aktivität in der Ratte Amygdala spektrofluorometrisch Gemessen nach Myokardinfarkt

Myocardial infarction (MI) has dramatic mid- and long-term consequences at the physiological and behavioral levels, but the mechanisms involved are still ...

caspase-3-activity-rat-amygdala-measured-spectrofluorometry-after

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.7K Aufrufe.  Hospital du Sacre-Coeur de Montreal. Myocardial infarction (MI) is not only followed by impaired cardiac function but also by apoptosis in the amygdala, a brain region involved in the behavioral consequences of MI. This protocol describes how to induce MI, collect amygdala tissue and measure caspase-3 activity, a marker of apoptosis, therein.

Serie: Caspase-3 Activity in the Rat Amygdala Measured by Spectrofluorometry After Myocardial Infarction

Acute Myocardial Infarction in Rats

With heart failure leading the cause of death in the USA (Hunt), biomedical research is fundamental to advance medical treatments for cardiovascular diseases. Animal models that mimic human cardiac disease, such as myocardial infarction (MI) and ischemia-reperfusion (IR) that induces heart failure as well as pressure-overload (transverse aortic constriction) that induces cardiac hypertrophy and heart failure (Goldman and Tarnavski), are useful models to study cardiovascular disease. In particular, myocardial ischemia (MI) is a leading cause for cardiovascular morbidity and mortality despite controlling certain risk factors such as arteriosclerosis and treatments via surgical intervention (Thygesen). Furthermore, an acute loss of the myocardium following myocardial ischemia (MI) results in increased loading conditions that induces ventricular remodeling of the infarcted border zone and the remote non-infarcted myocardium. Myocyte apoptosis, necrosis and the resultant increased hemodynamic load activate multiple biochemical intracellular signaling that initiates LV dilatation, hypertrophy, ventricular shape distortion, and collagen scar formation. This pathological remodeling and failure to normalize the increased wall stresses results in progressive dilatation, recruitment of the border zone myocardium into the scar, and eventually deterioration in myocardial contractile function (i.e. heart failure). The progression of LV dysfunction and heart failure in rats is similar to that observed in patients who sustain a large myocardial infarction, survive and subsequently develops heart failure (Goldman). The acute myocardial infarction (AMI) model in rats has been used to mimic human cardiovascular disease; specifically used to study cardiac signaling mechanisms associated with heart failure as well as to assess the contribution of therapeutic strategies for the treatment of heart failure. The method described in this report is the rat model of acute myocardial infarction (AMI). This model is also referred to as an acute ischemic cardiomyopathy or ischemia followed by reperfusion (IR); which is induced by an acute 30-minute period of ischemia by ligation of the left anterior descending artery (LAD) followed by reperfusion of the tissue by releasing the LAD ligation (Vasilyev and McConnell). This protocol will focus on assessment of the infarct size and the area-at-risk (AAR) by Evan's blue dye and triphenyl tetrazolium chloride (TTC) following 4-hours of reperfusion; additional comments toward the evaluation of cardiac function and remodeling by modifying the duration of reperfusion, is also presented. Overall, this AMI rat animal model is useful for studying the consequence of a myocardial infarction on cardiac pathophysiological and physiological function.

The rat model of acute myocardial infarction (AMI) is useful to study the consequence of a MI on cardiac pathophysiological and physiological function.

Akuter Myokardinfarkt bei Ratten

With heart failure leading the cause of death in the USA (Hunt), biomedical research is fundamental to advance medical treatments for cardiovascular ...

Forschung

Medizin

Measuring Caspase Activity Using a Fluorometric Assay or Flow Cytometry

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators and executioners of apoptosis, the most studied form of programmed cell death. Apoptosis occurs during developmental processes and is a necessary event in tissue homeostasis. Pyroptosis is another form of cell death that utilizes caspases and is a critical process in activating the immune system through the activation of the inflammasome, which results in the release of members of the interleukin-1 (IL-1) family. To assess caspase activity, target substrates can be assessed. However, sensitivity can be an issue when examining single cells or low-level activity. We demonstrate how a fluorogenic substrate can be used with a population-based assay or single-cell assay by flow cytometry. With proper controls, different amino acid sequences can be used to identify which caspases are active. Using these assays, the simultaneous loss of the inhibitors of apoptosis proteins upon tumor necrosis factor (TNF) stimulation has been identified, which primarily induces apoptosis in macrophages rather than other forms of cell death.

The present protocol describes two methods to measure caspase activity through a fluorogenic substrate using flow cytometry or a spectrofluorometer.

Messung der Caspase-Aktivität mit einem fluorometrischen Assay oder einer Durchflusszytometrie

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators ...

Biochemie

Histological Quantification of Chronic Myocardial Infarct in Rats

Myocardial infarction is defined as cardiomyocyte death due to prolonged ischemia; an inflammatory response and scar formation (fibrosis) follow the ischemic injury. Following the initial acute phase, chronic remodeling of the left ventricle (LV) modifies the structure and function of the heart. Permanent coronary ligation in small animals has been widely used as a reference model for a chronic model of MI. Thinning of the infarcted wall progressively develops to transmural fibrosis. Histological assessment of infarct size is commonly performed; nevertheless, a standardization of the methods for quantification is missing. Indeed, important methodological aspects, such as the number of sections analyzed and the sampling and quantification methods, are usually not described and therefore preclude comparison across investigations. Too often, quantification is performed on a single section obtained at the level of the papillary muscles. Because novel strategies aimed at reducing infarct expansion and remodeling are under investigation, there is an important need for the standardization of accurate heart sampling protocols. We describe an accurate method to quantify the infarct size using a systematic sampling of harvested rat heart and image analyses of trichromatic stained histological sections obtained from base to apex. We also provide evidence that calculating the expansion index (EI) allowed for infarct size assessment, taking into account changes of the left ventricle throughout the remodeling.

The post-mortem assessment of myocardial infarction (MI) in rodents is based on quantification of the infarct on stained heart sections. We describe an accurate method to quantify the infarct size using systematic sampling of harvested rat hearts from base to apex and image analyses of trichrome-stained histological sections.

Die histologische Quantifizierung der chronischen Myokardinfarktes bei Ratten

Myocardial infarction is defined as cardiomyocyte death due to prolonged ischemia; an inflammatory response and scar formation (fibrosis) follow the ...

Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine models of MI with permanent ligation of left-anterior descending (LAD) coronary artery closely mimics MI in humans. Murine models benefit from the extensive genetic engineering available nowadays. Here we propose a reproducible murine surgical model of myocardial infarction by permanent LAD coronary ligation. Our technique comprises anesthesia with ketamine/xylazine that can be rapidly reversed by administration of an antagonist, intubation without tracheotomy for mechanical-assisted ventilation, ventilation with application of extrinsic positive end-expiratory pressure (PEEP) to avoid alveolar collapse, a thoracotomy method limiting to the minimum surgical lesions made to skeletal muscles, and lung inflation without thoracentesis. This method is sparsely invasive, reproducible and reduces post-surgery mortality and complications.

Herein we describe a surgical procedure showing how to achieve permanent ligation of the left-anterior descending coronary artery in mice. This model is of high relevance to investigate the pathophysiology of myocardial infarction and the concomitant biological processes.

Murine Myokardinfarkt Modell mit permanenten Ligation der linken Anterior absteigende Koronararterie

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine ...

A New Model of Heart Failure Post-Myocardial Infarction in the Rat

Ligation of the left anterior descending (LAD) coronary artery has been widely used to establish the rat model of heart failure (HF) post myocardial infarction (MI). However, the disadvantages of this model include high mortality rate after ligation and larger variations both in the infarct size and the degree of impaired cardiac function. In addition, a ventilator or exteriorization of the heart is indispensable for the previous models, which complicates the procedure during the ligation. In this study, we developed a reliable and reproducible model without the ventilator or exteriorization of the heart by ligating the LAD coronary artery. Four weeks after the procedure, we found that the serum concentrations of CK-MB, NT-proBNP, and Renin, which were used to assist diagnoses of MI and HF, were significantly higher in the MI group compared to the sham group. In contrast, the value of left ventricle ejection fraction (LVEF) in the MI group was obviously less than in the sham group. Furthermore, the infarct size and cardiac fibrosis area were individually confirmed and quantitatively analyzed by TTC staining and Masson's trichrome staining. Smaller variations were found in either infarct size or fibrosis area in the MI group, which helped to develop a reliable and reproducible model of HF post-MI. This new model of HF post-MI in the rat is vital for studying the potential mechanisms of MI and HF. This new method can be used to develop the new drug for treatment of MI and HF in rats by using pharmacological strategies.

We successfully developed a reliable and reproducible model of heart failure post-myocardial infarction in the rat without ventilation or exteriorization of the heart. This simplifies the procedure and benefits the further studies about the potential mechanisms behind the heart failure.

Ligation of the left anterior descending (LAD) coronary artery has been widely used to establish the rat model of heart failure (HF) post myocardial ...

An Intact Pericardium Ischemic Rodent Model

This protocol has shown that the pericardium and its contents play an essential anti-fibrotic role in the ischemic rodent model (coronary ligation to induce myocardial injury). The majority of pre-clinical myocardial infarction models require the disruption of pericardial integrity with loss of the homeostatic cellular milieu. However, recently a methodology has been developed by us to induce myocardial infarction, which minimizes pericardial damage and retains the heart&#39;s resident immune cell population. An improved cardiac functional recovery in mice with an intact pericardial space following coronary ligation has been observed. This method provides an opportunity to study inflammatory responses in the pericardial space following myocardial infarction. Further development of the labeling techniques can be combined with this model to understand the fate and function of pericardial immune cells in regulating the inflammatory mechanisms that drive remodeling in the heart, including fibrosis.

This protocol outlines the steps for inducing myocardial infarction in mice while preserving the pericardium and its contents.

Ein intaktes ischämisches Nagetiermodell des Perikards

This protocol has shown that the pericardium and its contents play an essential anti-fibrotic role in the ischemic rodent model (coronary ligation to ...

A Fluorescence Assay for Evaluating the Permeability of a Cardiac Microvascular Endothelial Barrier in a Rat Model of Ischemia/reperfusion

Revascularization therapies for culprit arteries, regardless of percutaneous coronary intervention and coronary artery bypass grafting, are considered the best strategy for improving the clinical prognosis of patients with acute coronary syndrome (ACS). Nonetheless, myocardial reperfusion following effective revascularization can trigger significant cardiomyocyte death and coronary endothelial collapse, known as myocardial ischemia/reperfusion injury (MIRI). Usually, endothelial cells and their intercellular tight junctions cooperatively maintain the microvascular endothelial barrier and its relatively low permeability but fail in reperfusion areas. 
Microvascular endothelial hyperpermeability induced by ischemia/reperfusion (IR) contributes to myocardial edema, increased infiltration of pro-inflammatory cells, and aggravated intramyocardial hemorrhage, which may worsen the prognosis of ACS. The tracer used in this study-70,000 Da FITC-dextran, a branched glucose molecule labeled by fluorescein isothiocyanate (FITC)-appears too large to infiltrate the cardiac microvascular endothelium in normal conditions. However, it is capable of infiltrating a broken barrier after MIRI. Thus, the higher the endothelial permeability is, the more FITC-dextran accumulates in the extravascular intercellular space. Thus, the intensity of fluorescence from FITC can indicate the permeability of the microvascular endothelial barrier. This protocol takes advantage of FITC-dextran to evaluate the cardiac microvascular endothelial barrier functionally, which is detected by an automated quantitative pathology imaging system.

Here, we describe a method to functionally assess the endothelial barrier of cardiac microvessels after ischemia/reperfusion injury via the measurement of the mean fluorescence intensity of extravasated 70,000 Da FITC-dextran in comparison with Evans Blue.

Revascularization therapies for culprit arteries, regardless of percutaneous coronary intervention and coronary artery bypass grafting, are considered the ...

An Experimental Model of Myocardial Infarction for Studying Cardiac Repair and Remodeling in Knockout Mice

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of death in Western countries, with acute myocardial infarction (MI) being the most prevalent form. This paper describes a protocol for studying the role of galectin 3 (Gal-3) in the temporal evolution of cardiac healing and remodeling in an experimental animal model of MI. 
The procedures described include an experimental model of MI with a permanent coronary ligature in male C57BL/6J (control) and Gal-3 knockout (KO) mice, an echocardiography procedure to study cardiac remodeling and systolic function in vivo, a histological evaluation of interstitial myocardial fibrosis with picrosirius red-stained and rhodamine-conjugated lectin-stained sections for studying myocyte hypertrophy by the cross-sectional area (MCSA), and the quantification of infarct size and cardiac remodeling (scar thinning, septum thickness, and expansion index) by planimetry in slices stained with Masson's trichrome and triphenyl tetrazolium chloride. Gal-3 KO mice with MI showed disrupted cardiac remodeling and an increase in the scar thinning ratio and the expansion index. At the onset of MI, myocardial function and cardiac remodeling were also severely affected. At 4 weeks post MI, the natural evolution of fibrosis in infarcted Gal-3 KO mice was also affected. 
In summary, the experimental model of MI is a suitable model for studying the temporal evolution of cardiac repair and remodeling in mice with the genetic deletion of Gal-3 and other animal models. The lack of Gal-3 affects the dynamics of cardiac repair and disrupts the evolution of cardiac remodeling and function after MI.

Here, we describe an experimental model of myocardial infarction, an echocardiography procedure to study cardiac remodeling and function, and procedures for quantifying fibrosis and hypertrophy in picrosirius red-stained and rhodamine-stained sections, as well as the infarct size and expansion index in slices stained with Masson's trichrome.

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of death in Western countries, with acute myocardial infarction (MI) being the most prevalent form. ...

<meta charset="utf8"></head><body>Immunfluoreszenzfärbung zur Untersuchung des Zelltods in MCAO-Schlaganfallmodellen der Ratte

Evaluating Cell Death Signaling by Immunofluorescence in a Rat Model of Ischemic Stroke

Stroke is a leading cause of death and disability worldwide. Most cases of stroke are ischemic and result from the occlusion of the middle cerebral artery (MCA). Current pharmacological approaches for the treatment of ischemic stroke are limited; therefore, novel therapies providing effective neuroprotection against ischemic injury following stroke are urgently needed. In the brain tissue following ischemic stroke, the area of the ischemic penumbra is salvageable but at risk of progressing to irreversible damage. The penumbral area surrounding the infarcted core is a conceptual target for neuroprotection. Since the blood flow is partially maintained in the penumbral area, neuronal and non-neuronal cells in this area transiently survive after stroke, and these cells that are still viable may be rescued by appropriate medical interventions. Understanding the pathophysiology of the penumbra is important in the development of neuroprotective therapies because the cell death pathways activated in the ischemic penumbra may indicate therapeutic targets, such as RUNX1 and cathepsins. These protein targets functioning as mediators of programmed cell death can be further exploited in translational research. With moderate size and similarity to the human brain, the in vivo rat model of MCA occlusion (MCAO) mimics the human ischemic stroke and offers an applicable tool to investigate the penumbral pathology, examine the cell death signaling, and evaluate the effects of potential targets in the context of MCAO. Here, we describe how to induce MCAO in rats and how to perform immunofluorescence staining for the detection of cell death signaling in the rat brain following MCAO.

<meta charset="utf8"></head><body>Bewertung der Zelltodsignalisierung durch Immunfluoreszenz in einem Rattenmodell für ischämische Schlaganfälle

Rat in vivo models are indispensable tools to investigate the pathological mechanisms and therapeutic targets for ischemic stroke. This work will describe performing immunofluorescence staining in infarcted brain slices following middle cerebral artery occlusion (MCAO) in rats.

Bewertung der Zelltodsignalisierung durch Immunfluoreszenz in einem Rattenmodell für ischämische Schlaganfälle

Stroke is a leading cause of death and disability worldwide. Most cases of stroke are ischemic and result from the occlusion of the middle cerebral artery ...

Caspase-3-Aktivität in der Ratte Amygdala spektrofluorometrisch Gemessen nach Myokardinfarkt

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Akuter Myokardinfarkt bei Ratten

Messung der Caspase-Aktivität mit einem fluorometrischen Assay oder einer Durchflusszytometrie

Die histologische Quantifizierung der chronischen Myokardinfarktes bei Ratten

Murine Myokardinfarkt Modell mit permanenten Ligation der linken Anterior absteigende Koronararterie

A New Model of Heart Failure Post-Myocardial Infarction in the Rat

Ein intaktes ischämisches Nagetiermodell des Perikards

A Fluorescence Assay for Evaluating the Permeability of a Cardiac Microvascular Endothelial Barrier in a Rat Model of Ischemia/reperfusion

An Experimental Model of Myocardial Infarction for Studying Cardiac Repair and Remodeling in Knockout Mice

Bewertung der Zelltodsignalisierung durch Immunfluoreszenz in einem Rattenmodell für ischämische Schlaganfälle

Bewertung der Zelltodsignalisierung durch Immunfluoreszenz in einem Rattenmodell für ischämische Schlaganfälle