Forschung in dieser Veröffentlichung berichtet, wird von der Air Force Office of Scientific Research Grund Initiative Statt FA9550-12-1-0464 unterstützt.

<ol>
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A., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+droplet+interface+bilayers.">Asymmetric droplet interface bilayers.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 5878-5879 (2008).</li><li>Bayley, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+interface+bilayers.">Droplet interface bilayers.</a> MOL BIOSYST. 4, 1191-1208 (2008).</li><li>White, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+torus+surrounding+planar+lipid+bilayer+membranes.">Analysis of the torus surrounding planar lipid bilayer membranes.</a> BIOPHYS J. 12, 432 (1972).</li><li>Tien, H. T., Ottova, A. 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J., Kung, C., Sachs, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetic+and+Spatial+Parameters+for+Gating+of+the+Bacterial+Large+Conductance+Mechanosensitive+Channel,+MscL.">Energetic and Spatial Parameters for Gating of the Bacterial Large Conductance Mechanosensitive Channel, MscL.</a> J GEN PHYSIOL. 113, 525-540 (1999).</li><li>Deplazes, E., Louhivuori, M., Jayatilaka, D., Marrink, S. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+MscL+homolog+from+Mycobacterium+tuberculosis:+a+gated+mechanosensitive+ion+channel.">Structure of the MscL homolog from Mycobacterium tuberculosis: a gated mechanosensitive ion channel.</a> Science. 282, 2220-2226 (1998).</li><li>Steinbacher, S., Bass, R., Strop, P., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+the+prokaryotic+mechanosensitive+channels+MscL+and+MscS.">Structures of the prokaryotic mechanosensitive channels MscL and MscS.</a> Mechanosensitive Ion Channels, Part A. , 1-24 (2007).</li><li>Sukharev, S., Durell, S. R., Guy, H. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light-actuated+nanovalve+derived+from+a+channel+protein.">A light-actuated nanovalve derived from a channel protein.</a> Science. 309, 755-758 (2005).</li><li>Najem, J., Dunlap, M., Sukharev, S., Leo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensitive+Channels+Activity+in+a+Droplet+Interface+Bilayer+System.">Mechanosensitive Channels Activity in a Droplet Interface Bilayer System.</a> MRS Proceedings. 1621, (2014).</li><li>Fox, R. O., Richards, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+voltage-gated+ion+channel+model+inferred+from+the+crystal+structure+of+alamethicin+at+1.5-&#8491;+resolution.">A voltage-gated ion channel model inferred from the crystal structure of alamethicin at 1.5-&#8491; resolution.</a> Nature. 300, 325-330 (1982).</li><li>Iwamoto, M., Oiki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact+Bubble+Bilayers+with+Flush+Drainage.">Contact Bubble Bilayers with Flush Drainage.</a> Sci Rep. 5, (2015).</li><li>Barriga, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+interface+bilayer+reconstitution+and+activity+measurement+of+the+mechanosensitive+channel+of+large+conductance+from+Escherichia+coli.">Droplet interface bilayer reconstitution and activity measurement of the mechanosensitive channel of large conductance from Escherichia coli.</a> J R Soc Interface. 11, 20140404 (2014).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Mechanosensation bedeutet eine der ersten sensorischen Übertragungswegen, die in lebenden Organismen entwickelt. Mit diesem Phänomen für das Studium und das Verständnis der mechanisch-elektrischen Eigenschaften der DIB, ist ein entscheidender Schritt in Richtung Funktions Anregungen reagierende Materialien. Es geht um die Einbeziehung und Aktivierung eines mechanosensitive Kanal, MscL, in der DIB als mechanoelektrische Wandler und einem Dehnungsmessstreifen zu spannen Erhöhung der Lipid-Doppelschicht-Schnittstelle zu erkennen. Auf einer anderen Note könnte die Funktion der MS Kanäle, durch die Grundmaterialeigenschaften des Lipiddoppelschichten einschließlich der Dicke, intrinsische Krümmung und Kompressibilität geregelt werden. Im Lichte des zuvor erwähnt, stellt die Mikropipette eine Technik hilfreich, da die Forscher die Fähigkeit, MS Kanäle in DIB untersuchen und Einblicke in die Struktur der Lipid-Doppelschicht, wie auch die Lipid-Protein-Wechselwirkungen. In den vergangenen drei Jahrzehnts, Patch-Clamp war der primäre Methode, um MS-Kanälen zu untersuchen, da sie eine Klemm sowohl Spannung und Anspannung. , Patch-Clamp erfordert jedoch sperrige Ausrüstung und nicht für eine Miniaturisierung, eine Eigenschaft für das Engineering von sensorischen und Umwandlungsvorrichtungen erforderlich geeignet. DIB aufgrund ihrer Einfachheit, Stabilität und Kompaktheit stellen eine geeignete Umgebung, um die Aktivität MscL studieren. Hier haben wir erstrecken vorherigen Fortschritte in den DIB Bildungstechniken, indem sie eine Mikropipette Technik, mit der Fähigkeit, die Größe der Tröpfchen und Doppelschicht-Schnittstelle, die chemische Zusammensetzung von jedem Tröpfchen und die Spannung an der Grenzfläche durch dynamische Stimulation steuern. Die Technik besteht aus Verankerungs wässrigen Tröpfchen, enthaltend Proteoliposomen zu den Spitzen der koaxial gegenüberliegenden Glaskapillaren. Die Tröpfchen werden in ein Bad aus organischem Lösungsmittel gegeben und bei Kontakt gebracht einer Lipiddoppelschicht bildet sich an der Schnittstelle. Die Mikropipetten sind p angebrachtiezoelectric Oszillatoren ermöglicht die horizontale Verschiebung der Tröpfchen. Dynamisch Komprimieren der Tröpfchen führt zu einer Erhöhung der Grenzflächenspannung an der Wasser-Öl-Grenzfläche und damit eine Erhöhung der Doppelschichtspannung. Zwei wichtige Aspekte zu differenzieren diese Methode von der ähnlichen und vor kurzem veröffentlichten Kontaktdaten Blase Doppelschicht (CBB) Technik 37. Verwendung der Technik hierin dargestellt, wird die Größe der Bilayer kontrollierte Verwendung von Mikromanipulatoren und damit die Volumen der Tröpfchen konstant bleiben, im Gegensatz zu dem CBB-Methode. Darüber hinaus fordert der CBB Technik zur Druckpumpen, die nicht in der in dieser Veröffentlichung macht es einfacher und leichter zu bauen stellten Verfahren notwendig sind. Wir sind in der Lage, zu integrieren und zu stimulieren bakteriellen MscL erstmals ohne Verwendung eines Patch-Pipette oder chemische Modifikationen 38. Da das System erleichtert die Bildung von robusten asymmetrische Lipid-Doppelschichtmembranen, es ahmt den lIPID Asymmetrie in biologischen Membranen gefunden. Dies erlaubt uns, die Wirkung von gesteuerten Membranzusammensetzung oder Asymmetrie auf die Aktivität MscL studieren. Zusätzlich wird durch Bildverarbeitungstechniken, hilft diese Methode schätzen die Spannung an der Doppelschicht-Schnittstelle. Diese Technik hilft beim Verständnis der Prinzipien der Umwandlung zwischen der Masse und Oberflächenkräfte im DIB erleichtert die Messungen der Grundmembraneigenschaften und verbessert das Verständnis MscL Reaktion auf Spannung Membran. Obwohl dieses Verfahren führt einen Schritt näher zu einer biomolekularen stimuliresponsive Materialsystems und zu einer anderen physiologischen Umgebung zu MscL untersuchen, gibt es Einschränkungen für das System. Spannung in diesem System kann wegen der Gegenwart der Lipidreservoir in der Form von Liposomen in jedem Tröpfchen, die Spannung an der Öl / Wasser-Grenzfläche zu entlasten neigt geklemmt werden. Daher wird derzeit mechanosensitive Kanäle stimuliert werdenin DIB nur im dynamischen Betrieb. Das Vorhandensein von Luftblasen in dem System beeinflusst die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Experimente. In der Hydrogele Luftblasen könnten Verlust, wenn die elektrische Verbindung zur Folge haben. Während wir beschreiben die Verwendung der Mikropipette basiertes Verfahren für die Stimulation der MscL könnte die Technik verwendet, um andere Arten von MS Kanäle zu untersuchen und das Potential hat, die von Forschern verwendet, um eine Vielzahl von Biomolekülen zu untersuchen. Zum Beispiel hat ähnliche Einstellung in unserem Labor verwendet, um die mechanoelektrische Antwort eines Kanals freien Tröpfchengrenzfläche Bilayermembran studieren. Verschiedene Proteine ​​konnte wieder hergestellt werden und aktiviert mit diesen stark kontrollierten Setup unter Berücksichtigung, dass die Rekonstitution Umgebungen jedes Biomolekül variieren. Die in diesem Artikel beschriebenen Verfahren berührt eine wesentlich breitere Anwendung Potenzial, das nur für die Phantasie des Forschers begrenzt.

In den letzten zehn Jahren, wobei die Anordnung der künstlichen Lipid-Doppelschichten wurde wesentlich durch die Entwicklung der Tröpfchengrenzfläche Bilayer Verfahren vorgerückt. Bekannt als stabil und robust, verhängt DIBs sich als alternative Modellsysteme zur klassischen gemalt (Mueller) und gefaltet (Montal-Müller) planare Doppelschichten 1. Obwohl die Idee der Verwendung von Tröpfchen auf Lipiddoppelschichten zu erstellen geht zurück auf die 1960er Jahre 2, es war nicht bis vor kurzem Popularität gewonnen. Der erste erfolgreiche Versuch wurde von der Takeushi Gruppe 3, gefolgt von mehreren Studien, die Doppelschichtbildung unter Verwendung eines Netzwerks von Tröpfchen durch die Bayley Gruppe 4-6 berichtet. In jüngerer Zeit wurden Verkapselungstechniken vom Leo-Gruppe 7-9, der das Konzept der Verwendung von DIBs als Bausteine ​​neuartige Stimuli reagierende Materialsysteme 10 Pionierarbeit vorgeschlagen. In früheren Studien wurden DIB ihre Fähigkeit, an elektrische 9,11, chem reagieren erwiesenschen 10,12 und optische Reize 13. Verschiedene Biomolekülen mit unterschiedlichen Funktionalitäten stimuliresponsive wurden effektiv stimuliert, wenn in der DIB 10,14 rekonstituiert. Angesichts dieser erfolgreichen Versuche eine wichtige Frage aufgeworfen: könnte die DIB reagieren auf mechanische Reiz, wenn geeignete Biomoleküle eingebaut? Die auf einem DIB wirkenden Grenzflächenkräfte unterscheiden sich von denen in anderen Zweischichtsystem 15,16. Daher konnte die Spannung in der Doppelschicht von den Tröpfchen gehalten durch Regulieren Spannung an den Wasser-Lipid-Öl-Schnittstellen gesteuert werden; ein Konzept, nicht mit den lackierten oder gefaltete Doppelschicht-Systeme anwendbar. MscL Kanälen, die weithin als Osmolyt Freigabeventile und Grundelemente der bakteriellen Cytoplasmamembran bekannt ist, reagieren auf erhöhte Membranspannung 17,18. Im Falle einer hypoosmotischen Schocks, mehrere Kanäle, die in der Membran einer kleinen Zelle 19 kann eine mas erzeugensive Durchlässigkeit als Reaktion auf schnell los Ionen und kleinen Molekülen, spart Bakterien aus der Lyse 20. Biophysikalisch wird MscL gut untersucht und vor allem durch die herausragende Patch-Clamp-Technik 21-23 gekennzeichnet. Zuverlässige Strukturmodelle erklären Gating-Mechanismus 24,25 MscL ist vorgeschlagen auf die seines Homologen Kristallstruktur 26,27, Modellierung 28, und die Ergebnisse der umfangreiche Experimente 24,29-31 basiert. Unter einer angelegten Spannung von ~ 10 mN / m, der geschlossene Kanal, der von einem engen Bündel von Transmembran-Helices besteht, verwandelt sich in einen Ring der stark geneigten Helices Bildung einer ~ 28 einen mit Wasser gefüllten leitenden Poren 21,24,32. Es wurde auch festgestellt, daß die Hydrophobie des hermetischen Durchlaß, an der Kreuzung der inneren TM1 Domänen angeordnet ist, bestimmt die Aktivierungsschwelle des Kanals 33. Entsprechend wurde festgestellt, dass durch Verringerung der Hydrophobizität des Gate, die tension Schwellen konnte abgesenkt 22 werden. Diese Eigenschaft der MscL möglich das Design der verschiedenen steuerbaren Ventile 34 hergestellt, in erster Linie für Drug-Delivery-Zwecke. Für alle oben genannten Eigenschaften und auf der Grundlage ihrer grundlegenden Rolle der Übersetzung Zellmembran übermäßigen Spannungen in elektrophysiologischen Aktivitäten, macht MscL eine großartige Passform als mechanoelektrische Wandler in DIBs. In diesem Artikel präsentieren wir eine ursprüngliche Mikropipette-basierte Methode, um DIBs bilden und messen die Aktivität der einge MscL Kanäle unter mechanischer Stimulation. Wir berichten zum ersten Mal, die Reaktion der DIBs zu mechanischen Reiz und der funktionellen Wiederherstellung des V23T niedrigschwelligen Mutante MscL in DIBs 35. Die Versuchsanlage besteht aus Lipid-umhüllten wässrigen Tröpfchen auf die Spitzen der zwei gegenüberliegende Glasmikropipetten verankert Borosilikatglas. Wenn Tröpfchen in Kontakt gebracht einer Lipiddoppelschicht-Schnittstelle ist foRMED. Diese Technik bietet Kontrolle über die chemische Zusammensetzung und die Grße jedes Tröpfchens (bulk) sowie die Abmessungen der Doppelschicht-Schnittstelle. Zusätzlich könnte asymmetrische Membranen mit verschiedenen Lipidzusammensetzungen in jeder Broschüre leicht gebildet werden. Mit einer der Mikropipetten, um eine harmonische piezoelektrischen Aktuator angeschlossen ist, bietet die Möglichkeit, eine vorprogrammierte Einzelzyklus oder Schwing Reiz anzuwenden. Spannung wird auf den künstlichen Membran, durch die Kompression der beiden Tröpfchen stütz geliefert. Als Ergebnis der Tröpfchenverformung, die Bereiche Wasser-Lipid-Öl-Schnittstellen erhöhen, und gleichzeitig wird der Winkel zwischen den Tröpfchen verringert, was zu einer Erhöhung der Membranspannung und transiente MscL Aktivierung. Durch Analyse der Formen der Tröpfchen während der Verformung könnte die Spannung an der Grenzfläche erzeugt geschätzt werden. Auch wenn der Schwerpunkt in diesem Artikel ist auf den mechanisch-Übertragungseigenschaften des DIB wir auch betonen, dass andere Arten von Bio-Moleküle, wie Alamethicin, kann durch dieses multifunktionale Plattform aktiviert werden. Wir stellen hier alle technischen Aspekte der Herstellung, der Montage und Durchführung von Messungen mit diesem neuen Verfahren in einem Schritt-für-Schritt-Weise.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diphytanoy-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850356P</td>
			<td>Purchased as lyophilized powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>34-gauge microfil</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF24G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 mL Centrifuge bottels</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>3141</td>
			<td>Nalgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Function/Arbitrary Waveform Generator, 20 MHz</td>
			<td>Keysight Technologies</td>
			<td>33220A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillian</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP1760</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti&#174; Mini-Extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Scope.A1</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioCam HSm</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B Amplifier&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>Pierce&#160;</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BK Precision 4017B 10 MHz DDs Sweep/Function Generator</td>
			<td>Digi-Key</td>
			<td>BK4017B-ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>7 Spectra/Por</td>
			<td>132113</td>
			<td>MWCO 8000, 7.5 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DigiData 1440A system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPhPC</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850356C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-625 PZT Servo-Controller&#160;</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>E-526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPLC System</td>
			<td>Pharmacia Biotech</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9535-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadecane, 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>544-76-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homoginizer</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357426</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>17886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRGACURE&#174; 2959</td>
			<td>IRGACURE&#174;</td>
			<td>555047962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopore Membrane Filters&#160;</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>VCTP02500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl Alcohol</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>BDH1133-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>7100</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimble-Chase</td>
			<td>Kontes</td>
			<td>420401-1515</td>
			<td>Flex-Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED-100 UV Spot Curing System</td>
			<td>Electro-Lite, corp.</td>
			<td>81170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Patch-Clamp Micromanipulators</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PCS-520N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M33</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Holder&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MEH1S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS, minimum 99.5% titration</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Gas</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>UN1066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0420-1</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni NTA agarose beads</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1000632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optically Clear Cast Acrylic Tube, 2-1/2&#34; OD x 2&#34; ID</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8486K545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-601 PiezoMove Flexure-Guided Linear Actuator</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>P-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>456-9033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M&#174; All-Purpose Laboratory Film</td>
			<td>Parafilm&#174;</td>
			<td>PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)1000 dimethacrylate</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>15178-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate (PCTE) Membrane Filters, Black, 0.4 Micron, 25mm, 100/Pk</td>
			<td>Sterlitech Corporation</td>
			<td><a href="http://www.sterlitech.com/filters/membrane-disc-filters/polycarbonate-membranes/hydrophilic-polycarbonate-membrane-filters/hydrophilic-polycarbonate-membrane-filter-pctb0425100.html">PCTB0425100</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powder Free Soft Nitrile Examination Gloves&#160;</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>CA89-38-272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replacement Gasket 1.0mm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>GO1-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire</td>
			<td>GoodFellow</td>
			<td>147-346-94</td>
			<td>Different diameters could be used depending on the application&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>21610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14-961-27</td>
			<td>12 x 130 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP1421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracal 30K</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC803024</td>
			<td>Amicore Ultra 30 MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Light-Duty Tissue Wipers</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82003-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Scientific 50D Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>13089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Purifier</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td>D11931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP1422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-octylglucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>O311S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multifunctional, micropipette-based method for incorporation and stimulation of bacterial mechanosensitive ion channels in droplet interface bilayers

MscL, eine große Leitfähigkeit mechanosensitive Kanal (MSC), ist ein allgegenwärtiges Osmolyt Ablassventil, die Bakterien überleben abrupten hypo-osmotischen Schocks hilft. Es wurde entdeckt, und mit Hilfe der Patch-Clamp-Technik fast drei Jahrzehnte rigoros sucht. Seine grundlegende Rolle übersetzen Spannung auf der Zellmembran in Antwort Permeabilität aufgebracht ist es ein starker Kandidat als mechanoelektrischen Wandlers in künstliche Membran-basierte Biomoleküle wirken. Serving als Bausteine ​​zu solchen Geräten können Tropfenschnittstelle Doppelschichten (DIBs) als neue Plattform für die Einbeziehung und Stimulierung der MscL Kanäle verwendet werden. Hier beschreiben wir eine Mikropipette-basierte Methode, um DIBs bilden und messen die Aktivität der einge MscL Kanäle. Dieses Verfahren besteht aus Lipid-umhüllten wässrigen Tröpfchen auf die Spitzen der zwei gegenüberliegende (koaxial positioniert) Borsilikatglas-Mikro verankert. Als Tropfen in Kontakt gebracht werden, ist ein Lipid-Doppelschicht-Schnittstellegebildet. Diese Technik bietet Kontrolle über die chemische Zusammensetzung und die Größe der einzelnen Tröpfchen sowie die Abmessungen der Doppelschicht-Schnittstelle. Mit einer der Mikropipetten, um eine harmonische piezoelektrischen Aktuator befestigt bietet die Möglichkeit, eine gewünschte oszillierende Impulse zu liefern. Durch Analyse der Formen der Tröpfchen während der Deformation kann die Spannung an der Grenzfläche erzeugt geschätzt werden. Unter Verwendung dieser Technik wird die erste Aktivität MscL Kanäle in einem DIB-System gemeldet. Neben MS-Kanälen können Aktivitäten anderer Arten von Kanälen mit dieser Methode untersucht werden, was beweist, die Multifunktionalität dieser Plattform. Das hier vorgestellte Verfahren ermöglicht die Messung der Grundmembraneigenschaften, eine bessere Kontrolle über die Bildung von symmetrischen und asymmetrischen Membranen, und ist eine Alternative zu stimulieren und zu studieren mechanosensitive Kanälen.

Die Figuren 1 und 2 zeigen die Versuchsanordnung und Einrichtungen verwendet, um die Proteinaktivität im Verlauf der mechanischen Stimulation der Lipiddoppelschichtmembran aufzuzeichnen. Um elektrische Störungen in unsere Messungen zu minimieren, wird die Arbeitsstation innerhalb einer im Labor hergestellten Faradayschen Käfig gelegt, geerdet, um eine Masseverbindung über die Axopatch 200 B-Verstärker. Bildung einer stabilen isolierenden Lipiddoppelschicht ist ein wichtiger Schritt in dieser Studie. In dieser Anordnung sammelt eine Lipidmonoschicht an der Öl / Wasser-Grenzfläche der wässrigen Tröpfchen in einem Bad aus einem organischen Lösungsmittel getaucht. Wenn Tröpfchen in Kontakt gebracht wird überschüssiges Öl beseitigt, und die gegnerische Lipidmono dünn auf ein Zwei Molekül dicke Lipiddoppelschicht. Die am weitesten verbreitete Technik in Doppelschichtcharakterisierung verwendeten Voltage-Clamp. Mit Spannungsklemmen, wird die Spannung über die Doppelschicht auf einem konstanten Wert gehalten, während der Strom gemessen wird, Fig. 4 </strong&gt; schildert einen typischen Echtzeit-Stromaufnahme des ursprünglichen Doppelschichtbildung. Kenntnis der spezifischen Kapazität (~ 0,6 &amp; mgr; F / cm 2) 5 des DPhPC Lipiddoppelschicht, kann der Bereich der gebildeten Doppelschicht berechnet werden. Die Doppelschichtbereich könnte durch Änderung der Position der Tröpfchen (4A) gesteuert werden. Verwendung des piezoelektrischen Aktuators, könnten verschiedene Arten von Wellenformen (sinusförmig, quadratisch, dreieckig, etc.) Bei verschiedenen Frequenzen, Amplituden und Tastverhältnissen an die Tröpfchen horizontal aufgebracht werden und axial oszillieren sie und damit Doppelschichtspannung und die Fläche verändert werden konnte (4B). Wenn die DIB mechanisch stimuliert wird, während eine konstante DC-Potential über die Membran eine niedrigschwellige (gain-of-function) V23T Mutante MscL erzeugt zuverlässig Aktivitäten, einschließlich vor allem Unter leitenden Zustand und gelegentlich vollständige Öffnung Ereignisse (Abbildung 5) . Diese events sind identisch mit denen erfasst unter Verwendung der Patch-Clamp-Technik aus intakten inneren E. coli Membranen und Liposomen, die mit dem gereinigten V23T MscL rekonstituiert. Die Ergebnisse in 5 zeigen, dass Gating tritt in Antwort auf einen Anstieg in der Spannung, da alle Stromspitzen bei der Spitzenkompression beobachtet. Bei der Spitzenkompression ist die relative Flächenausdehnung der Tröpfchen maximal und daher ist die Spannung an der Grenzfläche maximal. Alamethicin, einem spannungsgesteuerten Ionenkanal und eine der am besten untersuchten Peptide, erhöht die Durchlässigkeit der Membran, wenn eine Gleichspannung an die Membran 36 angelegt. Die Fähigkeit der Lipiddoppelschicht-Schnittstelle, um Transmembranproteine ​​und Peptide Host wird auch durch Ausführen Spannungsanschnitt aktuellen Aufnahmen mit Alamethicin Peptid getestet. Alamethicin ist mit der Phospholipidlösung zu einer Endkonzentration von 100 ng / ml gemischt. 6 zeigt die Strommessungen unter<html> Spannungsklemme (115 mV). Die Tröpfchen in diesem Experiment sind voneinander um kleine Doppelschicht-Schnittstelle und damit eine höhere Widerstandsfähigkeit und kleinere Kapazität erreichen gezogen. Die Torschaltung Verhalten der Alamethicin Peptid wird durch die diskreten Schritte Strom (Figur 6) gezeigt. Das Histogramm auf der rechten Seite des Diagramms zeigt die Änderungen in der Leitfähigkeit von der Basisebene (0,0962 ns), die im Grunde ist der erste Leitfähigkeitspegel des Kanals selbst. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig1.jpg" /> Abb. 1: Eine schematische die Hauptteile und die Abmessungen der Ölbehälter der Beschreibung Der Ölbehälter ist an der Maschinenhalle an der Virginia Tech gefertigt. Es besteht aus einem maschinell bearbeiteten zylindrischen Acrylröhre auf die Oberfläche einer Acrylfolie verklebt. Die Abmessungen und die Konstruktion kann modifiziert werden, um verschiedene Anwendungen oder mehr als zwei Mikrozubringen./53362/53362fig1large.jpg &quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig2.jpg" /> Abb. 2: Versuchsaufbau und Mikropipetten Zubereitung (A) Die Standardarbeitsplatz zur Bildung mechanisch stimulierende und Charakterisierung der Schnittstelle Doppelschichten umfasst ein Mikroskop, 3-Achsen-Manipulatoren, eine Digitalkamera, piezoelektrischen Oszillator, Schwingungsisolation Tisch und einen Faradayschen Käfig (nicht gezeigt). (B) Der Versuchsaufbau besteht aus zwei gegenüberliegenden PEG-DMA Hydrogel gefüllten Mikro horizontal in ein Bad aus Hexadecan Öl positioniert sind. Jeder der Mikropipetten enthält eine Ag / AgCl-Elektrode, um eine elektrische Verbindung bereitzustellen. Eine dritte Mikropipette mit Proteoliposom Lösung gefüllt wird verwendet, um die Tröpfchen an der Spitze der anderen Mikro bilden. (C) Das DIB Stromantwort gemessen werden konnteVerwendung einer Kombination aus dem Pflaster Verstärker und dem rauscharmen Datenerfassungssystem. (D) Eine geschlossene up-Bild, das die wässrigen Tröpfchen an der Spitze der Mikropipetten gebildet. (E) Ag / AgCl-Elektroden, indem die Spitze von zwei 250 um Silberdrähten in Bleiche hergestellt. Die Elektroden werden dann durch zwei Borosilikatglas Kapillaren mit PEG-DMA-Hydrogel, das mit UV-Licht gehärtet wird zur Verfestigung gefüllt zugeführt. Eine gerade Mikroelektrodenhalter mit Stiftstecker wird verwendet, um eine der Mikropipetten auf die heads des Patches Verstärker anschließen. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig3.jpg" /> Abb. 3: Bilder, welche die Bildung von Doppelschichten Tröpfchengrenzfläche (A) Eine 10 &amp; mgr; m-Mikropipette mit Proteo gefüllt ist unter dem Mikroskop in der Nähe der Mikropipettenspitzen positioniert ist. Unter Verwendung einer Spritze zu der Mikropipette verbunden ist, verzichtet werden kleine Voluminader Proteoliposomen zu kugelförmigen Tröpfchen auf das gewünschte Volumen zu bilden. Lassen Sie die Monoschicht bilden, indem die Tröpfchen zu zehn Minuten sitzen. Bringt die Tröpfchen in Kontakt; die Doppelschicht bilden, nachdem das gesamte Öl an der Grenzfläche eliminiert wird. (B) Während die Doppelschicht gebildet wird, kann die chemische Zusammensetzung bei beiden Seiten der Grenzfläche durch die Injektion gewünschten Chemikalien unter Verwendung eines mikrofeinen Mikro gesteuert werden. (C) Die Tröpfchen im Augenblick der ersten Berührung. (D) Die Tröpfchen, wenn die Lipid-Doppelschicht gebildet wird. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig4.jpg" /> Abbildung 4: Echtzeit-Messungen zeigen, sowohl für den ersten Verdünnung und anschließende Expansion der Schnittstelle (A) Strom im Verlauf der Doppelschicht durch das Anlegen einer Dreiecks elektrischen Potential gemessen.. Der Betrag des gemessenen Stroms ist direkt proportional zu der capaciAbstand und somit der Bereich der Doppelschicht-Schnittstelle. Je näher sich die Tröpfchen zusammengeführt werden, desto größer ist die Fläche der Grenzfläche, und umgekehrt. (B) Bei Anwendung mechanischer Erregung, der Bereich der Doppelschicht-Schnittstelle Zunahmen und Abnahmen bei der gleichen Frequenz wie das Anregungssignal. <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig5.jpg" /> Abb. 5: Echtzeit-Messungen zeigen die Reaktion der Doppelschicht gegen mechanische Anregung als auch die Ansteuerung der V23T Mutante MscL Die Form des Stromantwort ist sinusförmig, was zu einer sinusförmigen Veränderung infolge betrifft in Doppelschicht-Kapazität die Doppelschicht Bereich zu ändern. Die Stromspitzen an der Spitze jedes Zyklus auftritt, geben Teilleitfähigkeit Gating des V23T Mutante. Ein Polardiagramm zeigt an, dass weitere Gating zu Spitzenkompression, die eine Erhöhung der Spannung bei der Doppelschicht-Interface spiegelt auftritt. Abb. 6: Aktuelle Messungen unter Spannungsklemme und entsprechende Histogramm der Leitfähigkeitsniveaus für Gating-Aktivität der einge Alamethicin Kanäle Der Gating-Verhalten des Alamethicin Peptid wird durch die diskreten stufenweisen Anstieg der kurzfristigen gezeigt. Die Leitfähigkeitsniveaus entsprechen sehr gut mit früheren Messungen von unserer Arbeitsgruppe an der Virginia Tech 7 durchgeführt.

Watch this Scientific Journal Video about Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers at JoVE.

Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers

Bakterielle mechanosensitive Kanäle können als mechanoelektrische Wandler in biomolekularen Geräten verwendet werden. Tropfenschnittstelle Doppelschichten (DIBs), Zell-inspirierten Bausteine ​​für solche Geräte, stellen neue Plattformen zu integrieren und zu stimulieren mechanosensitive Kanäle. Hier zeigen wir, einen neuen Mikropipette Verfahren zur Bildung DIB, die die Untersuchung mechanosensitiver Kanäle unter mechanischer Stimulation.

Multifunktionale, Mikropipette-basierte Methode für den Einbau und Stimulation der bakteriellen mechanosensitiven Ionenkanäle in Droplet Schnittstelle Bilayers

MscL, a large conductance mechanosensitive channel (MSC), is a ubiquitous osmolyte release valve that helps bacteria survive abrupt hypo-osmotic shocks. ...

multifunctional-micropipette-based-method-for-incorporation

Research

JoVE Journal

Biology

10.7K Aufrufe.  Virginia Polytechnic Institute and State University.  Bakterielle mechanosensitive Kanäle können als mechanoelektrische Wandler in biomolekularen Geräten verwendet werden. Tropfenschnittstelle Doppelschichten (DIBs), Zell-inspirierten Bausteine ​​für solche Geräte, stellen neue Plattformen zu integrieren und zu stimulieren mechanosensitive Kanäle. Hier zeigen wir, einen neuen Mikropipette Verfahren zur Bildung DIB, die die Untersuchung mechanosensitiver Kanäle unter mechanischer Stimulation. 

Serie: Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI-Probenvorbereitung: Die Ultra Thin-Layer-Methode

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Forschung

Biologie

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Patch Clamp Recording von Ionenkanälen in Xenopus Oozyten exprimiert

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse.   To mimic the interactions between lymphocytes and antigen presenting cells, we use Ni2+-chelating lipids to anchor recombinant cell adhesion and MHC proteins to the upper leaflet of a bilayer with poly-histidine tags. Planar bilayers are generated by preparing lipid, treating the glass surfaces where the bilayer will form, and then forming the bilayer in a specialized chamber containing a flow-cell where the lymphocytes will be added.  Then, bilayers are charged with Ni and his-tagged recombinant proteins are added.  Finally,  lymphocytes are injected into the flow cell and TIRF microscopy can be used to image synapse formation and the mechanisms that control T cell locomotion, sites of receptor sorting,  and sites of receptor degradation.

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse. Here, we show methods for anchoring cell adhesion proteins known to modulate synapse formation to the upper leaflet of the lipid bilyer and visualize synapse formation using TIRF microscopy.

Unterstützte Planar-Membranen für die Bildung von Study of immunologischen Synapsen und Kinapse

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse.   To mimic the interactions ...

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can be used for many different studies, such as the characterization of membrane-active peptides, the reconstitution of ion channels or investigations on how changes in lipid bilayer properties alter the function of bilayer-spanning channels.  Here, we show how to form a planar bilayer and how to isolate small patches from the bilayer, and in a second video  will also demonstrate a procedure for using gramicidin channels to determine changes in lipid bilayer elastic properties.   We also demonstrate the individual steps needed to prepare the bilayer chamber, the electrodes and how to test that the bilayer is suitable for single-channel measurements.

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. Here, we demonstrate the individual steps needed to prepare the bilayer chamber, the electrodes and how to test that the bilayer is suitable for single-channel measurements.

Herstellung künstlicher Doppelschichten für Elektrophysiologie Experimente

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenese und funktionale Analyse von Ionenkanälen heterolog in Säugerzellen exprimierten

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch-Clamp-und Perfusion Techniken zur Untersuchung von Ionenkanälen ausgedrückt in Xenopus Oozyten

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) is a ubiquitous research strategy. HEK-293T cells must be plated onto glass coverslips at low enough density so that they are not in contact with each other in order to allow for electrophysiological recording without confounding effects due to contact with adjacent cells. Transfected channels must also express with high efficiency at the plasma membrane for whole-cell patch clamp recording of detectable currents above noise levels. Heterologous ion channels often require long incubation periods at 28&deg;C after transfection in order to achieve adequate membrane expression, but there are increasing losses of cell-coverslip adhesion and membrane stability at this temperature. To circumvent this problem, we developed an optimized strategy to transfect and plate HEK-293T cells. This method requires that cells be transfected at a relatively high confluency, and incubated at 28&deg;C for varying incubation periods post-transfection to allow for adequate ion channel protein expression. Transfected cells are then plated onto glass coverslips and incubated at 37&deg;C for several hours, which allows for rigid cell attachment to the coverslips and membrane restabilization. Cells can be recorded shortly after plating, or can be transferred to 28&deg;C for further incubation. We find that the initial incubation at 28&deg;C, after transfection but before plating, is key for the efficient expression of heterologous ion channels that normally do not express well at the plasma membrane. Positively transfected, cultured cells are identified by co-expressed eGFP or eGFP expressed from a bicistronic vector (e.g. pIRES2-EGFP) containing the recombinant ion channel cDNA just upstream of an internal ribosome entry site and an eGFP coding sequence. Whole-cell patch clamp recording requires specialized equipment, plus the crafting of polished recording electrodes and L-shaped ground electrodes from borosilicate glass. Drug delivery to study the pharmacology of ion channels can be achieved by directly micropipetting drugs into the recording dish, or by using microperfusion or gravity flow systems that produce uninterrupted streams of drug solution over recorded cells.

Reliable method for highly efficient in vitro expression and subsequent electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T).

Optimierte Transfektion Strategie für Expression und elektrophysiologische Ableitung von rekombinantem Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T-Zellen

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

In vitro models using human primary epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory epithelium in the context of microbial infections or inhaled agents. Direct comparisons of cells obtained from diseased populations allow us to characterize different phenotypes and dissect the underlying mechanisms mediating changes in epithelial cell function. Culturing epithelial cells from the human tracheobronchial region has been well documented, but is limited by the availability of human lung tissue or invasiveness associated with obtaining the bronchial brushes biopsies. Nasal epithelial cells are obtained through much less invasive superficial nasal scrape biopsies and subjects can be biopsied multiple times with no significant side effects. Additionally, the nose is the entry point to the respiratory system and therefore one of the first sites to be exposed to any kind of air-borne stressor, such as microbial agents, pollutants, or allergens. 
Briefly, nasal epithelial cells obtained from human volunteers are expanded on coated tissue culture plates, and then transferred onto cell culture inserts. Upon reaching confluency, cells continue to be cultured at the air-liquid interface (ALI), for several weeks, which creates more physiologically relevant conditions. The ALI culture condition uses defined media leading to a differentiated epithelium that exhibits morphological and functional characteristics similar to the human nasal epithelium, with both ciliated and mucus producing cells. Tissue culture inserts with differentiated nasal epithelial cells can be manipulated in a variety of ways depending on the research questions (treatment with pharmacological agents, transduction with lentiviral vectors, exposure to gases, or infection with microbial agents) and analyzed for numerous different endpoints ranging from cellular and molecular pathways, functional changes, morphology, etc. 
In vitro models of differentiated human nasal epithelial cells will enable investigators to address novel and important research questions by using organotypic experimental models that largely mimic the nasal epithelium in vivo.

Nasal epithelial cells, obtained through superficial scrape biopsy of human volunteers, are expanded and transferred onto tissue culture inserts. Upon reaching confluency, cells are grown at air liquid interface, yielding cultures of ciliated and non-ciliated cells. Differentiated nasal epithelial cell cultures provide viable experimental models for studying the respiratory mucosa.

Die Kultivierung der menschlichen Nasen Epithelzellen an der Air flüssig-Grenzfläche

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers such as epithelia also form a barrier that separates the inside from the outside or different compartments of multicellular organisms. A key feature of these barriers is the differential distribution of ions across cell membranes or cell layers. Two properties allow this distribution: 1) membranes and epithelia display selective permeability to specific ions; 2) ions are transported through pumps across cell membranes and cell layers. These properties play crucial roles in maintaining tissue physiology and act as signaling cues after damage, during repair, or under pathological condition. The ion-selective self-referencing microelectrode allows measurements of specific fluxes of ions such as calcium, potassium or sodium at single cell and tissue levels. The microelectrode contains an ionophore cocktail which is selectively permeable to a specific ion. The internal filling solution contains a set concentration of the ion of interest. The electric potential of the microelectrode is determined by the outside concentration of the ion. As the ion concentration varies, the potential of the microelectrode changes as a function of the log of the ion activity. When moved back and forth near a source or sink of the ion (i.e. in a concentration gradient due to ion flux) the microelectrode potential fluctuates at an amplitude proportional to the ion flux/gradient. The amplifier amplifies the microelectrode signal and the output is recorded on computer. The ion flux can then be calculated by Fick&#8217;s law of diffusion using the electrode potential fluctuation, the excursion of microelectrode, and other parameters such as the specific ion mobility. In this paper, we describe in detail the methodology to measure extracellular ion fluxes using the ion-selective self-referencing microelectrode and present some representative results.

Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

Die Messung der extrazellulären Ionenflüsse Verwendung der ionenselektiven selbst verweisMikroElektroden-Technik

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these multi-spanning transmembrane proteins, with or without change in channel gating, is often postulated to contribute significantly in this process. It has thus become critical to develop a method to quantify the change of the relative cell surface expression of cardiac ion channels on a large scale. Herein, a detailed protocol is provided to determine the relative total and cell surface expression of cardiac L-type calcium channels CaV1.2 and membrane-associated subunits in tsA-201 cells using two-color fluorescent cytometry assays. Compared with other microscopy-based or immunoblotting-based qualitative methods, flow cytometry experiments are fast, reproducible, and large-volume assays that deliver quantifiable end-points on large samples of live cells (ranging from 104 to 106 cells) with similar cellular characteristics in a single flow. Constructs were designed to constitutively express mCherry at the intracellular C-terminus (thus allowing a rapid assessment of the total protein expression) and express an extracellular-facing hemagglutinin (HA) epitope to estimate the cell surface expression of membrane proteins using an anti-HA fluorescence conjugated antibody. To avoid false negative, experiments were also conducted in permeabilized cells to confirm the accessibility and proper expression of the HA epitope. The detailed procedure provides: (1) design of tagged DNA (deoxyribonucleic acid) constructs, (2) lipid-mediated transfection of constructs in tsA-201 cells, (3) culture, harvest, and staining of non-permeabilized and permeabilized cells, and (4) acquisition and analysis of fluorescent signals. Additionally, the basic principles of flow cytometry are explained and the experimental design, including the choice of fluorophores, titration of the HA antibody and control experiments, is thoroughly discussed. This specific approach offers objective relative quantification of the total and cell surface expression of ion channels that can be extended to study ion pumps and plasma membrane transporters.

Inherited cardiac arrhythmias are often caused by mutations that alter the surface delivery of one or more ion channels. Here, we adapt flow cytometry assays to provide a quantification of the relative total and cell surface protein expression of recombinant ion channels expressed in tsA-201 cells.

Bestimmung der relativen Zelloberfläche und Total Expression rekombinanter Ionenkanäle Mit Flow Cytometry

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these ...