Name: a cancer cell spheroid assay to assess invasion in a 3d setting
Uploaded: 2015-11-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 34 s
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Supportato dal NIH sovvenzioni P30 CA051008 e T32 CA009686 (ATR).

1. Generazione di Spheroids <ol><li> Preparare cella singola sospensione per appendere le culture goccia staccando colture di cellule di cancro aderenti del ~ 70% di confluenza con un PBS lavaggio seguito da esposizione a 0,05% soluzione di tripsina-EDTA. <ol><li> Neutralizzare la soluzione di tripsina con colture cellulari e contare le cellule utilizzando una aliquota della sospensione cellulare. Nota: I mezzi di coltura cellulare specifico dipenderà dalla linea cellulare in fase di test. Seguire ATCC raccomandazioni dei media, dove i media di coltura cellulare è tipicamente DMEM + 10% FBS. Ulteriori informazioni si possono trovare nella tabella dei materiali. </li><li> Eseguire una diluizione per consentire la semina di 500-1.000 cellule per 20 microlitri goccia di colture cellulari. </li></ol></li><li> Acquisire 10 centimetri piatto e aggiungere 5 ml di PBS sterile fino in fondo. Nota: Questo passaggio protegge l&#39;impiccagione scende da evaporazione. A costi inferiori &quot;batteriologiche grade&quot; piatti può essere utilizzato al posto di piatti di coltura cellulare di grado, come le cellule non sarà contagire sulla superficie cultura. </li><li> Utilizzare una pipetta multicanale per trasferire 20 gocce microlitri della sospensione cellulare diluita alla superficie interna del coperchio. <ol><li> Pipettare 40 gocce (5 righe di 8 gocce) sul coperchio del piatto 10 cm. </li></ol></li><li> Capovolgere il coperchio e posizionare sopra la capsula di Petri. Incubare le culture goccia che pendono a 37 ° C per 72 ore per generare sferoidi. <ol><li> Capovolgere il coperchio in un fiducioso, ancora modo controllato. Nota: Inversione il coperchio troppo veloce o troppo lento può causare le goccioline a spostare. Alcune linee cellulari possono formare sferoidi in 48 ore o meno, mentre altri possono richiedere più di 72 ore per la produzione di aggregati compatti. </li></ol></li></ol> 2. Integrazione di Spheroids in 3D Matrix <ol><li> Scongelare una aliquota di crescita seminterrato materiali per membrane fattore ridotto a 4 ° C per una notte prima di incorporare sferoidi. <ol><li> Opzionale: pozzi di livello con ECM in anticipo per evitare una possibile interazione con il sferoide cultu tessutire di superficie. <ol><li> Pipettare 200 ml di ECM per pozzetto su una piastra da 24 pozzetti. </li><li> La piastra di assicurare che l&#39;ECM copre l&#39;intera superficie ben. </li><li> Rimuovere con cura l&#39;eccesso ECM con una pipetta. </li><li> Incubare la piastra fino a pozzi sono asciutti: 3 ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C. </li></ol></li></ol></li><li> Raccogliere sferoidi inclinando il coperchio del piatto di coltura tissutale e condivisione del media. Trasferire i media con sferoidi in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. </li><li> Lasciare 10 min per sferoidi di depositarsi sul fondo della provetta. Spheroids dovrebbero essere visibili ad occhio. </li><li> Mescolare 100 ml di materiali membrana basale con 100 ml di freddo (4 ° C), collagene di tipo I in un tubo di pre-raffreddata separata. Tenere la miscela a 4 ° C per prevenire o gel dalla solidificazione prematuramente. <ol><li> Utilizzare puntali pre-refrigerati se il trasferimento di piccoli volumi. </li><li> Dare attenzione quandomescolando il tipo di materiali membrana basale e collagene che per evitare la formazione di bolle d&#39;aria. Nota: Le bolle d&#39;aria possono ostacolare l&#39;imaging più tardi nel protocollo, se esse sono incorporati nel gel. </li></ol></li><li> Aspirare sferoidi dal 40 microlitri porzione di fondo della provetta, e si combinano con il materiale della membrana basale / collagene di tipo I miscela. Fare attenzione per evitare la formazione di bolle d&#39;aria in fase di missaggio. Nota: La soluzione contenente 100 microlitri materiali membrana basale, 100 ml di tipo collagene I, e 40 ml di sferoidi creerò materiale sufficiente per 4 culture 3D indipendenti. Questo può essere scalata su o giù. </li><li> Pipettare 40 gocce microlitri della miscela viscosa in centri di pozzetti in una piastra da 24 pozzetti. Mantenere il livello piastra per evitare che il composto scorre verso il lato del pozzo. Nota: Una singola colonna a 24 pozzetti - 4 pozzi - è consigliato per ogni condizione da testare. </li><li> Posizionare la piastra di intoa 37 ° C incubatore e lasciare riposare per 30 minuti. La cultura 3D dovrà polimerizzare durante questo periodo. </li><li> Lentamente immergere le culture 3D in 1 ml di coltura cellulare multimediale. <ol><li> Assicurarsi che il supporto è caldo quando aggiungerlo nei pozzetti per promuovere ulteriormente il gel di polimerizzazione. </li><li> PUNTO CRITICO: aggiungere delicatamente il supporto alle culture 3D. Pipettaggio i media troppo in fretta nei pozzetti può portare al distacco delle culture 3D dalla superficie coltura di tessuti. </li></ol></li></ol> 3. Monitoraggio e analisi Spheroid Invasion <ol><li> Invasione Immagine da sferoidi nella matrice 3D circostante a punti temporali decisi dallo sperimentatore. Acquisire fotografie utilizzando un microscopio invertito con la lente dell&#39;obiettivo 20x. Nota: ideali punti temporali variano a seconda della linea cellulare in fase di test. Linee cellulari più invasive inizieranno la loro uscita dagli sferoidi poco dopo la placcatura e, di conseguenza, prendere fotografia iniziales entro un paio d&#39;ore dopo la placcatura. In generale, le fotografie sono prese a 0 ore (dopo la placcatura), 24 ore e 48 ore. Invasione conclude tipicamente 24-48 ore dopo la placcatura. </li><li> Quantificare la capacità invasiva utilizzando il software di analisi di immagine come immagine J. <ol><li> Analizzare invasione come la distanza cella dal bordo dello sferoide. <ol><li> Utilizzare lo strumento Disegna Dritto per segnare il raggio e / o massima distanza invasivo. </li><li> Fai clic su &quot;Analizza&quot; nel menu in alto, e quindi fare clic su &quot;Misura&quot; per visualizzare la misura della lunghezza. </li></ol></li><li> Analizzare invasione come l&#39;area totale invasivo al di fuori della sferoide. <ol><li> Utilizzare lo strumento Disegno a mano libera per tracciare il confine dello sferoide e / o area totale invasivo. </li><li> Fai clic su &quot;Analizza&quot; nel menu in alto, e quindi fare clic su &quot;Misura&quot; per visualizzare la misura dell&#39;area. </li></ol></li><li> Utilizzare un plugin come ROI Manager Tools per creare misure per una pila di immagini. </li></ol>
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	<li>Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastasis:+Dissemination+and+growth+of+cancer+cells+in+metastatic+sites.">Metastasis: Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites.</a> Nat Rev. Cancer. 2 (8), (2002).</li><li>Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tissue-specific+signaling+and+organ+function+in+three+dimensions.">Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions.</a> J Cell Sci. 116 (12), 2377-2388 (2003).</li><li>Yamada, K. 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The authors declare that they have no competing financial interests.

Questo studio ha valutato le prestazioni di un pannello di linee cellulari di cancro in un saggio di invasione sferoide (Tabella 1). Generalmente, troviamo che la formazione sferoide è migliorata in più linee cellulari epiteliali cercando, dove la presenza di giunzioni cellula-cellula promuove la formazione di un&#39;architettura sferoide-like. Linee cellulari noti che hanno subito una transizione epitelio-mesenchimale, come MDA-MB-231 cellule non formano sferoidi nella cultura goccia appeso molto pro...

È accertato che la motilità delle cellule tumorali è predittiva di potenziale metastatico, dato che tale comportamento facilita l&#39;invasione attraverso la membrana basale e l&#39;ingresso nel sistema circolatorio 1. Maggior parte delle ricerche sulla motilità si è concentrata su come le cellule si comportano in un ambiente bidimensionale (2D), anche se sta diventando ampiamente riconosciuto che il movimento delle cellule in una tridimensionale (3D) matrice è più rappresentativo di come queste stesse cellule saranno effettivamente comportarsi in vivo 2. Sistemi di coltura 3D sono sempre più utilizzati per studiare i comportamenti cellulari che vanno dalla morfologia delle cellule, di cinetica di crescita e sensibilità ai farmaci 3. Il desiderio di controllare l&#39;invasione delle cellule del cancro nel contesto di un ambiente 3D ha portato alla sintesi di tecniche precedentemente stabilito che comportano la generazione di aggregati di cellule 3D (sferoidi) tramite il metodo di coltura goccia pendente 4, seguita da incorporare questi sferoidi in un extracellulare 3D matrice (ECM), composto di collagene e membrana basale materiali 5. Questo metodo cerca di migliorare queste tecniche precedentemente stabiliti fornendo un approccio semplificato che può essere facilmente utilizzato per confrontare invasione sotto una varietà di condizioni sperimentali. Altri modi tradizionali per valutare la motilità cellulare in vitro sono il saggio di graffi ferita e il dosaggio transwell 6. Il primo test raffigura motilità cellulare in un ambiente 2D, ed è quindi indipendente di una varietà di caratteristiche critiche per l&#39;invasione in vivo, ad esempio attività della proteasi 7. Il test può transwell invasione delle cellule modello migliore quando gli inserti e sono rivestiti con i substrati ECM, ma solo un unico parametro, cioè la comparsa di cellule sulla superficie della membrana opposta è misurata, e molte sfumature di invasione delle cellule non sono così facilmente osservabile. In contrasto con queste tecniche, il saggio delle cellule del cancro invasione sferoide (Figura 1 &lt;/ strong&gt;) permette per il monitoraggio in tempo reale di invasione delle cellule in un ambiente che non è solo fisiologicamente rilevanti, ma permette anche importanti caratteristiche specifiche della linea di cellule per essere visualizzati, come la migrazione delle cellule individuale contro collettiva 8. Questo metodo permette anche vantaggi rispetto ai saggi di crescita della cultura 3D standard. La generazione di aggregati cellulari tramite il metodo goccia appeso limita inizialmente il movimento delle cellule, in modo che le cellule saranno incentivati ​​ad invadere dopo questo vincolo viene sollevato. Inoltre, una volta che vincolo viene sollevato, l&#39;uscita cella procederà in una direzione uniforme, che può quindi essere quantificata convenientemente. I materiali ECM più popolari utilizzati per cellulari tumorali sferoidi test sono Matrigel e collagene di tipo I, dove ognuna di queste componenti ha ruoli importanti e distinti a influenzare il comportamento metastatico. Matrigel è una miscela di secreto proteine ​​prodotte da cellule di sarcoma Engelbreth-Holm Sciame di topo, e si arricchisce in basemeproteine ​​di membrana nt quali laminina, entactina, e collagene di tipo IV 9. Per questo motivo Matrigel è seguito definita come &quot;materiali della membrana basale.&quot; Questi materiali forniscono membrana basale ligandi essenziali necessari per integrina adesione durante l&#39;invasione delle cellule del cancro 10 oltre a molte altre proteine ​​che esercitano una gamma di effetti sul comportamento cellulare 11. In confronto, collagene di tipo I, comunemente preparato da acido digest di tendini e altre strutture collagene dense 12, è un materiale di matrice molto più semplice che serve come un importante elemento strutturale dei tessuti e stroma sostegno tessuti connettivi ed organi del corpo. È stato dimostrato che le caratteristiche fisiche di collagene possono regolare un numero di caratteristiche di motilità cellulare; per esempio, l&#39;allineamento delle fibrille di collagene all&#39;interfaccia tumore stromale permette alle cellule tumorali di migrare successivamente lungo queste fibrille quando invadere nel stroma 13. Nel saggio qui presentato, sia di tipo I collagene e di materie membrana basale sono utilizzate come strumenti per studiare le interazioni cellula-stroma cancro 3D. L&#39;effetto di inibizione o stimolazione di vie che controllano invasione può essere monitorato dopo le cellule sono stati incorporati nella matrice 3D. Le celle possono essere pretrattati durante la crescita in gocce sospese o al momento del trasferimento alla cultura 3D, a seconda che un trattamento prolungato sarà richiesto per modulare invasione. Per i trattamenti brevi, si raccomanda che il farmaco essere miscelato con la sospensione sferoide dopo la raccolta, così come i mezzi che circonderà le culture 3D, per facilitare un&#39;adeguata esposizione al farmaco alle cellule. Successivamente, le cellule stromali normali o tumore-associati possono essere mescolati con il materiale di matrice per valutare il loro ruolo nel modulare l&#39;invasione delle cellule tumorali, o per determinare come il comportamento paracrino e autocrino cellule influenze segnalazione. Questa idea è stata mostrata in uno studio in cui la coculture di colsul cancro e le cellule endoteliali in appesi gocce portato ad una rete vascolare all&#39;interno sferoidi 14. Infine, i costituenti ECM possono anche essere modificati, come l&#39;invasione delle cellule tumorali è influenzata da diversi substrati 15. Il metodo presentato qui di seguito vi offre pertanto un quadro per la valutazione invasione delle cellule di cancro in una varietà di condizioni. In generale, si è riscontrato che non tutte le linee cellulari creeranno sferoidi nelle gocce appesi e linee cellulari epiteliali cercando tipicamente formare sfere regolare.

<table><tbody><tr><td>Matrigel Growth Factor Reduced</td><td>Corning</td><td>CB-40234</td><td></td></tr><tr><td>Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg</td><td>Millipore</td><td>08-115</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-12</td><td></td></tr><tr><td>100 mm TC-treated Dishes</td><td>Corning Incorporated</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>24-well TC-treated Plates</td><td>NEST Biotechnlology</td><td>702001</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX-71 Inverted Microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and LNCaP cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a cancer cell spheroid assay to assess invasion in a 3d setting

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential. Most traditional assays, however, do not examine these invasive features in a three-dimensional environment and the resulting data suffer from reduced biological applicability. Here an approach is presented to visualize the invasive ability of cell lines in a physiologically relevant setting. The cancer cell spheroid invasion assay first utilizes gravity to generate spheroids within drops of media that hang from the lid of a cell culture dish. Next, these spheroids are embedded in a 3D matrix consisting of a mixture of basement membrane materials and type I collagen. Cancer cell egression from the spheroids into the surrounding matrix is then monitored over time. The method described here can be modified to examine invasion after coculture of different cell types, inclusion of drugs/inhibitors, or alterations in extracellular matrix (ECM) constituents.

Usando il saggio di invasione sferoide (figura 1), un pannello di linee cellulari di tumore è stato testato per la loro capacità di formare sferoidi, così come per la quantità di fuoriuscita di cellule esposte dopo l&#39;impianto in una matrice 3D costituiti da materie membrana basale e collagene di tipo I (Tabella 1). Questi risultati dimostrano che non ogni linea cellulare di tumore creerà sferoidi ben formate, dove le linee cellulari che possiedono una morfologia epiteliale ...

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A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting

This method evaluates cancer cell invasion from spheroids into a surrounding 3D matrix. Spheroids are generated via the hanging drop culture method and then embedded in a matrix comprised of basement membrane materials and type I collagen. Invasion out of the spheroids is subsequently monitored.

Un Cancer Cell Saggio sferoide valutare Invasion in un Ambiente 3D

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential.  Most traditional assays, however, do not examine these ...

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Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis at later stage1,2. Moreover, TGF-&beta; is frequently overexpressed in breast cancer and its expression correlates with poor prognosis and metastasis 3,4. The mechanisms by which TGF-&beta; induces invasion are not well understood.
TGF-&beta; elicits its cellular responses via TGF-&beta; type II (T&beta;RII) and type I (T&beta;RI) receptors. Upon TGF-&beta;-induced heteromeric complex formation, T&beta;RII phosphorylates the T&beta;RI. The activated T&beta;RI initiates its intracellular canonical signaling pathway by phosphorylating receptor Smads (R-Smads), i.e. Smad2 and Smad3. These activated R-Smads form heteromeric complexes with Smad4, which accumulate in the nucleus and regulate the transcription of target genes5. In addition to the previously described Smad pathway, receptor activation results in activation of several other non-Smad signaling pathways, for example Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathways6.
To study the role of TGF-&beta; in different stages of breast cancer, we made use of the MCF10A cell system. This system consists of spontaneously immortalized MCF10A1 (M1) breast epithelial cells7, the H-RAS transformed M1-derivative MCF10AneoT (M2), which produces premalignant lesions in mice8, and the M2-derivative MCF10CA1a (M4), which was established from M2 xenografts and forms high grade carcinomas with the ability to metastasize to the lung9. This MCF10A series offers the possibility to study the responses of cells with different grades of malignancy that are not biased by a different genetic background.
For the analysis of TGF-&beta;-induced invasion, we generated homotypic MCF10A spheroid cell cultures embedded in a 3D collagen matrix in vitro (Fig 1). Such models closely resemble human tumors in vivo by establishing a gradient of oxygen and nutrients, resulting in active and invasive cells on the outside and quiescent or even necrotic cells in the inside of the spheroid10. Spheroid based assays have also been shown to better recapitulate drug resistance than monolayer cultures11. This MCF10 3D model system allowed us to investigate the impact of TGF-&beta; signaling on the invasive properties of breast cells in different stages of malignancy.

An assay to quantitatively measure Transforming Growth Factor (TGF)-&#x03B2;-induced invasion in 3-dimensional collagen gels is described. This assay takes advantage of the MCF10A series of cell lines, which represent different stages of breast cancer development. This method can be adopted to be used with other cell lines and might be used to investigate other potential activators or inhibitors of invasion.

Saggio sferoide Misura TGF-β-indotta Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

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Medicina

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor microenvironment. To obtain more reliable in vitro results, several three-dimensional (3D) cell culture assays have been introduced. These assays allow cancer cells to interact with the extracellular matrix. This interaction affects cell behavior, such as proliferation and invasion, as well as cell morphology. Additionally, this interaction could induce or suppress the expression of several pro- and anti-tumorigenic molecules. Spheroid invasion assay was developed to provide a suitable 3D in vitro method to study cancer cell invasion. Currently, animal-derived matrices, such as mouse sarcoma-derived matrix (MSDM) and rat tail type I collagen, are mainly used in the spheroid invasion assays. Taking into consideration the differences between the human tumor microenvironment and animal-derived matrices, a human myoma-derived matrix (HMDM) was developed from benign uterus leiomyoma tissue. It has been shown that HMDM induces migration and invasion of carcinoma cells better than MSDM. This protocol provided a simple, reproducible, and reliable 3D human tumor-based spheroid invasion assay using the HMDM/fibrin matrix. It also includes detailed instructions on imaging and analysis. The spheroids grow in a U-shaped ultra-low attachment plate within the HMDM/fibrin matrix and invade through it. The invasion is daily imaged, measured, and analyzed using ilastik and Fiji ImageJ software. The assay platform was demonstrated using human laryngeal primary and metastatic squamous cell carcinoma cell lines. However, the protocol is suitable also for other solid cancer cell lines.

Tumor microenvironment is an essential part of cancer growth and invasion. To mimic carcinoma progression, a biologically relevant human matrix is needed. This protocol introduces an improvement for the in vitro three-dimensional spheroid invasion assay by applying a human leiomyoma-based matrix. The protocol also introduces a computer-based cell invasion analysis.

Matrice a base di tumore umano in un saggio di invasione sferoide tridimensionale

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Ricerca sul cancro

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor stroma, host fibroblasts are stimulated by cancer cells to differentiate. Thus, they acquire a phenotype that contributes to the tumor microenvironment and supports tumor progression. By using the spheroid model, we have set up such a 3D in vitro model system, in which we analyzed the role of laminin-332 and its receptor integrin &#945;3&#946;1 in this differentiation process. This spheroid model system not only reproduces the tumor microenvironment conditions in a more accurate way, but also is a very versatile model since it allows different downstream studies, such as immunofluorescent staining of both intra- and extracellular markers, as well as deposited extracellular matrix proteins. Moreover, transcriptional analyses by qPCR, flow cytometry and cellular invasion can be studied with this model. Here, we describe a protocol of a spheroid model to assess the role of CAFs&#39; integrin &#945;3&#946;1 and its ectopically deposited ligand, laminin-332, in differentiation and in supporting the invasion of pancreatic cancer cells.

The goal of this protocol is to establish a 3D in vitro model to study the differentiation of cancer-associated fibroblasts (CAFs) in a tumor bulk-like environment, which can be addressed in different analysis systems, such as immunofluorescence, transcriptional analysis and life cell imaging.

Un modello esplosivo 3D come sistema più fisiologico per la differenziazione dei fibroblasti associati al cancro e gli studi sull'invasione in vitro

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited number of assays allow for direct monitoring and mechanistic insights into the interactions between tumor and immune cells, amongst which, T-cells play a significant role in executing the cytotoxic response of the adaptive immune system to cancer cells. Most assays are based on two-dimensional (2D) co-culture of cells due to the relative ease of use but with limited representation of the invasive growth phenotype, one of the hallmarks of cancer cells. Current three-dimensional (3D) co-culture systems either require special equipment or separate monitoring for invasion of co-cultured cancer cells and interacting T-cells.
Here we describe an approach to simultaneously monitor the invasive behavior in 3D of cancer cell spheroids and T-cell cytotoxicity in co-culture. Spheroid formation is driven by enhanced cell-cell interactions in scaffold-free agarose microwell casts with U-shaped bottoms. Both T-cell co-culture and cancer cell invasion into type I collagen matrix are performed within the microwells of the agarose casts without the need to transfer the cells, thus maintaining an intact 3D co-culture system throughout the assay. The collagen matrix can be separated from the agarose cast, allowing for immunofluorescence (IF) staining and for confocal imaging of cells. Also, cells can be isolated for further growth or subjected to analyses such as for gene expression or fluorescence activated cell sorting (FACS). Finally, the 3D co-culture can be analyzed by immunohistochemistry (IHC) after embedding and sectioning. Possible modifications of the assay include altered compositions of the extracellular matrix (ECM) as well as the inclusion of different stromal or immune cells with the cancer cells.

The presented approach simultaneously evaluates cancer cell invasion in 3D spheroid assays and T-cell cytotoxicity. Spheroids are generated in a scaffold-free agarose multi-microwell cast. Co-culture and embedding in type I collagen matrix are performed within the same device which allows to monitor cancer cell invasion and T-cell mediated cytotoxicity.

Monitoraggio dell'invasione delle cellule tumorali e della citotossicità delle cellule T nella cultura 3D

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

Modelli 3D in Biologia del Cancro: Dinamiche di Invasione negli Eterosferoidi

Alternative Strategy to Analyze In Vitro Cell Invasion of 3D Cultures

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) cultures. Invasion is a cellular outcome of utmost interest in cancer biology. In this protocol, we have devised an alternative strategy for evaluating cancer cell invasion in vitro, employing heterospheroids comprised of oral squamous cell carcinoma (OSCC), cancer-associated fibroblasts (CAF), and monocytes. These heterospheroids aim to mimic the tumor microenvironment (TME), including two relevant non-neoplastic cell types alongside the cancer cells. Each cell type was labeled with vital fluorescent markers emitting in distinct wavelengths before spheroid formation. Once formed, heterospheroids were seeded onto a layer of human leiomyoma-derived extracellular matrix in the upper compartment of a microporous membrane. Invasion was assessed in the z-axis using confocal microscopy. Digital images were obtained in the corresponding fluorescent channels at 10 &#181;m intervals, covering a depth of 90 &#181;m in the z-axis. Analysis was performed using freeware image software by calculating the integrated fluorescence intensity in each image and fluorescence channel. This approach enables a more dynamic analysis of cell invasion patterns in a multilayered context, as well as the examination of spatial co-localization of different cell types during invasion.

Autore in primo piano: Decifrare il crosstalk tra cancro e cellule immunitarie durante la progressione del cancro della testa e del collo

Invasion is a major biological phenomenon in the development and progression of cancer. This process is influenced by non-neoplastic cells and components of the tumor microenvironment. The purpose of this study is to describe an alternative method for analyzing tumor cell invasion in vitro using three-dimensional (3D) cultures.

Strategia alternativa per analizzare l'invasione cellulare in vitro di colture 3D

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Tridimensionale (3D) Tumore Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

<meta charset="utf8"></head><body>Esame delle interazioni macrofagi-sferoidi tumorali in una configurazione di matrice di collagene 3D

A Macrophage-Tumor Spheroid Co-Invasion Assay

The interaction of immune and cancer cells and their respective impact on metastasis represents an important aspect of cancer research. So far, only a few protocols are available that allow an in vitro approximation of the in vivo situation. Here, we present a novel approach to observing the impact of human macrophages on the invasiveness of cancer cells, using tumor spheroids of H1299 non-small cell lung carcinoma cells embedded in a three-dimensional (3D) collagen I matrix. With this co-cultivation setup, we tested the impact of small interfering RNA (siRNA)-based depletion of regulatory factors in macrophages on the 3D invasion of cancer cells from the tumor spheroid compared to controls. This method allows the determination of different parameters, such as spheroid area or the number of invading cancer cells, and thus, to detect differences in cancer cell invasion. In this article, we present the respective setup, discuss the subsequent analysis, as well as the advantages and potential pitfalls of this method.

<meta charset="utf8"></head><body>Un test di co-invasione di macrofagi-tumori sferoidi

Here, we present a protocol to investigate the interaction of primary human monocyte-derived macrophages with a tumor spheroid in a three-dimensional (3D) collagen I matrix, with the possibility to compare the impact of soluble and physical properties of the microenvironment on cell invasion.

Un test di co-invasione di macrofagi-tumori sferoidi

The interaction of immune and cancer cells and their respective impact on metastasis represents an important aspect of cancer research. So far, only a few ...

Un Cancer Cell Saggio sferoide valutare Invasion in un Ambiente 3D

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Saggio sferoide Misura TGF-β-indotta Invasion

Matrice a base di tumore umano in un saggio di invasione sferoide tridimensionale

Un modello esplosivo 3D come sistema più fisiologico per la differenziazione dei fibroblasti associati al cancro e gli studi sull'invasione in vitro

Monitoraggio dell'invasione delle cellule tumorali e della citotossicità delle cellule T nella cultura 3D

Strategia alternativa per analizzare l'invasione cellulare in vitro di colture 3D

Strategia alternativa per analizzare l'invasione cellulare in vitro di colture 3D

Strategia alternativa per analizzare l'invasione cellulare in vitro di colture 3D

Tridimensionale (3D) Tumore Spheroid Invasion Assay

Un test di co-invasione di macrofagi-tumori sferoidi

Un test di co-invasione di macrofagi-tumori sferoidi