Dies funktioniert, wurde durch Zuschüsse aus den Natur- und Ingenieurwissenschaften Research Council of Canada (RGPIN 238.382-2011) und Canadian Institutes of Health Research (MOP115076) unterstützt. Heather Paul wurde von einem Natur- und Ingenieurwissenschaften Research Council of Canada Postgraduierten-Stipendium und einem Alberta Innovates Health Solutions Stipendium unterstützt. Megan Hallam wurde von einem Natur- und Ingenieurwissenschaften Research Council Postgraduate Stipendium, ein Frederick Banting und Charles Best Kanada Graduate Scholarship und ein Kinderkrankenhaus Alberta Research Institute Trainingspreis in Genetics, Child Development und Health.

Dieses Protokoll wurde von der University of Calgary Animal Care Committee genehmigt und angepasst an den Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren. 1. Separate Dam von Offspring <ol><li> Trennen Sie die Staumauer aus ihren Nachwuchs für mindestens 5 Minuten vor dem Melken 12. HINWEIS: Der Damm kann bis zu 5-6 Stunden nach der Trennung 1,6,13 gemolken werden jedoch Zeiten der Trennung länger als 4 Stunden kann die Zusammensetzung der Milch 14 zu ändern. Während Trennzeit scheint nicht zu beeinflussen Milchsammelvolumen 12, ist es ratsam, dass eine konsequente Trennung der Zeit während der Studie beibehalten werden. Milchzusammensetzung kann während der Stillzeit 15 zu ändern, daher sollte versucht werden, den Tag des Milchsammel konsistent zu halten ist. Maximale Milchproduktion wird vorgeschlagen, auf Still Tag 14 12 erfolgen. </li><li> Unter Verwendung einer Wärmekammer, sicherzustellen, dass die Welpen sind in der Lage, die richtige Körper temperatu pflegenre ohne die Anwesenheit der Mutter für die Dauer des Melkvorganges. HINWEIS: In der Studie wie folgt dar, Melken wurde bei der Entwöhnung, wenn die Dämme waren etwa 22 Wochen alt, und die Nachkommen 21 Tage alt durchgeführt, daher keine Wärmekammer verwendet wurde. </li></ol> 2. Aufbau und Vorbereitung <ol><li> Sammeln Sie alle für den Melkvorgang benötigten Materialien. HINWEIS: Alle Materialien können in den Materialien und Geräte Tabelle. </li><li> Legen Sie ein Heizkissen auf der Bank, wo Melken stattfinden wird und decken Sie das Pad mit einem saugfähigen Bank unter-Pad. </li><li> Einrichten des Narkosesystem. Sicherzustellen, dass das System über ausreichend Sauerstoff und Isofluran vor Beginn. Befestigen Sie den Narkosemaske, die für die erste Narkose an der Maschine verwendet werden. Legen Sie die Maske, die für die Anästhesie Wartung der Nähe, wenn anders als die ersten Narkosemaske verwendet wird. </li><li> Befestigen Sie eine 25 G Nadel in eine 1 ml Spritze für OxytocinInjektion unter aseptischen Bedingungen. </li><li> Einschalten des Heizkissen sodass mütterlichen Körpertemperatur während des Melkvorgangs erhalten bleibt. HINWEIS: Überwachen Sie die Temperatur des Heizungsauflage, um das Kissen zu gewährleisten nicht zu heiß werden und Verbrennungen verursachen. Alternativ können Sie auch eine Wärmequelle, wie einen beheizten Operationstisch, die auf eine bestimmte Temperatur eingestellt werden kann. </li></ol> 3. Anesthetize den Dam Mit Isofluran <ol><li> Öffnen Sie den Sauerstofftank und schalten den Strom auf 1 l (1.000 cc) pro min. Schalten Sie den Fluss von Isofluran und auf 5% eingestellt. ACHTUNG: Vermeiden Sie direkte Inhalation von Narkosemittel und verhindern, dass Anhäufung von Narkosedämpfen. </li><li> Betäuben den Damm. </li><li> Schalten Sie um auf die Wartungsmaske, falls erforderlich, indem die Staumauer in Rückenlage auf dem absorbierenden Pad Bank. Anesthetization Bestätigen fehlende Pedalreflex. </li><li> Reduzieren Sie den Fluss von Isofluran auf 2-3% für Aufrechterhaltung von Narkosen. Damm während des gesamten Verfahrens kontinuierlich zu überwachen, um sicherzustellen, depression der Atmung nicht auftritt. HINWEIS: Nachdem unter Anästhesie, sollte die Augen des Damms mit einem sterilen Augen Schmiermittel, um die Augen vor dem Austrocknen oder zu verkratzen geschützt werden. </li></ol> 4. Oxytocin Injection <ol><li> Stellen Sie sicher, das Oxytocin (20 USP-Einheiten / ml) hat seine Ablaufdatum überschritten. Desinfizieren Sie die Fläschchen von Oxytocin mit einem sterilen Alkoholtupfer / Alkohol Reinigung Pad. </li><li> Unter aseptischen Bedingungen aufzustellen 2 IE (0,1 ml) von Oxytocin in die Spritze. Verwenden Sie eine neue Nadel und Spritze für jeden Damm, die gemolken wird. HINWEIS: Oxytocin Dosen reichen im Allgemeinen von Einzelinjektionen von 1 bis 5 IU 1,6,12,16. Alternativ kann eine Dosis von 4 IU / kg Körpergewicht verwendet werden 12. Eine Einzeldosis von 2 IU kann einmal wiederholt werden, wenn Schwierigkeiten Melken angetroffen wird. </li><li> Spritzen Sie die Oxytocin intraperitoneal. Führen Sie die Nadel in den unteren rechten Quadranten des Bauches mit der Nadel zeigt in Richtung des Kopfes, in einem Winkelvon 15-30 °, etwa 0,5 cm tief. </li><li> Ziehen Sie am Kolben, um Unterdruck vor der Injektion zu gewährleisten. Wenn eine Flüssigkeit (Blut, Urin, Darminhalt, etc.) in die Spritze angesaugt, entfernen Sie die Nadel und versuchen, die Injektion mit einer neuen Nadel und Spritze. Wenn keine Flüssigkeit angesaugt injizieren die Oxytocin und entsorgen Sie die Nadel und Spritze sofort in einen Behälter für biologischen. </li><li> Warten Sie ca. 5-15 min für die Oxytocin, Milch zu Enttäuschung zu stimulieren. </li></ol> 5. Herstellung von Milking Seiten <ol><li> Wählen Sie die Websites / Zitzen, von denen Milch werden nicht erhoben. Milch kann aus jeder Zitze 12 gesammelt werden. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig das Fell um die Zitzen mit den Trimmern gemolken werden, so Fell kann Schwierigkeiten bei der Probenentnahme führen durch Dochtwirkung der Milch. Seien Sie sanft - die Haut um die Zitzen ist extrem empfindlich und kann trocken sein und als solche ist anfällig für Kratzer und Risse. </li><li> Sterilisation des Zitzen iist nicht notwendig, aber optional, reinigen Sie die Zitze mit lauwarmem Wasser, nachdem das Fell entfernt. Bereiten Sie mindestens zwei Gebiete als mehr als einem Standort kann für Milchsammel erforderlich. HINWEIS: Wenn die Milch Analyse umfasst mikrobielle Profilierung kann der Zitzenbereich Sterilisation mit Jod 5 erforderlich. </li></ol> 6. Milchauffang <ol><li> Drücken Sie leicht den Boden der Zitze, manuell Austreiben der Milch für die Sammlung. HINWEIS: Wenn die Milch Analyse umfasst mikrobielle Profilierung, sollten die ersten paar Tropfen Milch verworfen werden. </li><li> Sammeln der Milchtröpfchen in ein Kapillarröhrchen, Füllen der Kapillare. Kapillaren, die größere Mengen (zB 50 ul) erleichtern den Prozess anzupassen. HINWEIS: Wenn Schwierigkeiten, eine Milch festgestellt wird, kann eine zweite Dosis von Oxytocin verabreicht werden. Es wird empfohlen, die Dosis 4 IU insgesamt nicht überschreiten. </li><li> Abgeben der Milch aus der Kapillare in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen durchBerühren des Endes des Rohres, das verwendet wurde, um die Milch aus der Zitze an die Seite des Mikrozentrifugenröhrchens zu ziehen - zu beobachten, die die Milch durch Kapillarwirkung aus dem Kapillarrohr gezogen. HINWEIS: &quot;ausblasen&quot; die Milch, die nicht in das Rohr unter Verwendung einer 18 G-Nadel in eine 1 ml Spritze befestigt gezogen wird. </li><li> Der Damm auf Anzeichen von Schmerzen oder Atemdepression kontinuierlich zu überwachen und die Strömung von Isofluran entsprechend anzupassen. </li><li> Weiterhin Milch zu sammeln, wie in diesem Abschnitt beschrieben, bis genügend Milch für die gewählte Milchanalyse gesammelt. Für das unten beschriebene creamatocrit und Proteinkonzentrationsbestimmung, sammeln 0,25 ml Milch. HINWEIS: Verwenden Sie einen anderen Melkplatz, wenn Milch letdown verlangsamt oder die gewählte Website nicht ausreichend Milch zu vertreiben. Ein Maximum von ungefähr 2,5 ml Milch pro Tier gesammelt werden 17 oder bis zu 0,5 ml pro Zitze. Die Autoren empfehlen, Gesamtzeit unter Narkose auf ca. 45-60 min begrenzt werden, or 45 min nach dem Melken. </li><li> Sammlung der Milch in einen Mikrohämatokritröhrchen für creamatocrit Messung von Frischmilchproben und abzudichten das Ende des Rohres mit Ton Versiegelung. Beschriften Sie die Mikrohämatokritröhrchen mit dem Damm-ID und die Milchprobe aufrecht zu speichern. </li><li> Beim Melken beendet ist, schalten Sie den Strom von Isofluran und Sauerstoff. Entfernen Sie die Maske von der Staumauer und weiter zu Staumauer bis wach zu überwachen. Es wird empfohlen, wenn nicht bei vollem Bewusstsein, der Damm sollte auf einem absorbierenden Pad Bank während der Erholungsphase gelegt werden, anstatt direkt auf dem Käfig Bettwäsche, die Bettwäsche aus angesaugt oder in die Augen der Mutter Verkratzen während der Wiederherstellung zu verhindern. HINWEIS: Die Staumauer nicht unbeaufsichtigt lassen, bis es ausreichend, das Bewusstsein wiedererlangt, um Brustbeinfestliegen zu halten. </li><li> Wenn keine weitere Analysen erforderlich sind, frieren Milch bei -80 ° C. Andere haben vorgeschlagen, dass die Milch kann für bis zu 3 Stunden bei 4 ° C oder 5 Monate bei -20 ° C 18 gespeichert werden. </li></ol> 7. Creamatocrit Mess <ol><li> Schätzung der Fettgehalt in der Milch, die durch Berechnen der Milch creamatocrit (der Prozentsatz der Creme in der Milchprobe) 19. Hinweis: Messungen mit der Muttermilch haben gezeigt, dass entweder frische oder gefrorene Milch kann für eine creamatocrit Messung verwendet werden, jedoch frischer Milch ist mehr hoch korreliert (r = 0,92 im Vergleich zu r = 0,90) mit Lipidkonzentration 11. Die Verwendung von frischen oder gefrorenen Milch für creamatocrit Messungen sollten in der Studie konsistent gehalten werden, wie es aufgetaut Milch wird mit einem kleinen Rückgang der creamatocrit zugehörigen Werte 11. </li><li> Für Frischmilch, sammeln eine Probe der Milch aus der Zitze in eine Mikrohämatokritröhrchen; füllen Sie mindestens ¾ voll (ca. 15-20 ul). Alternativ ziehen frische Milch von der gesammelten Probe in die Kapillare nach dem Mischen gut. Dichten Sie das Ende mit Lehm Dichtstoff. </li><li> Legen Sie die Kapillare in die Hämatokrit-Spinner, mit derEndverschluß nach außen gerichteten, wodurch die Zentrifuge ausgeglichen ist. </li><li> Beginnen Sie den Hämatokrit Spin (120 sec bei 13.700 xg). HINWEIS: Spin Zeit oder Geschwindigkeit kann je nach dem Modell der Zentrifuge verwendet, ändern. </li><li> Nehmen Sie die Röhre aus der Zentrifuge nach dem Spin abgeschlossen ist, und führen Sie die Messungen für die Berechnung der creamatocrit. Trennung der Probe zu beobachten in eine Creme-Schicht und einer klaren Schicht. </li><li> Messen und aufzeichnen, die Gesamtlänge des Fluids in dem Rohr und der Länge der Fett (Creme) -Schicht mit Bremssätteln oder ein Lineal. HINWEIS: Die creamatocrit ist als der Prozentsatz der Cremeschicht innerhalb der Milchprobe 19, berechnet als (Länge der Creme-Schicht / Gesamtlänge von Milchsäule) x 100 (1A). Berechnen Fettkonzentration und Energiewerte aus dem creamatocrit Messung wie folgt: Fat-Konzentration (g / l) = (creamatocrit (%) - 0,59) /0.146 (1B) 19; Energiewert (kcAl / L) = 290 + (66,8 * creamatocrit (%) (1C) 19. </li></ol> 8. Proteinkonzentationsbestimmung <ol><li> Verwendung von Rinderserumalbumin als Proteinstandard zur Bestimmung des Gesamt- Milchproteinkonzentration unter Verwendung eines Standard-Protein-Assay, wie eine Proteinbestimmung nach Lowry 6. HINWEIS: Die Verdünnung der Milch kann notwendig sein, für die Milchproteinmessungen innerhalb der Standardkurve des Assays fallen. </li></ol>

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offen zu legen. Alle Tierversuche wurden gemäß CCAC genehmigten Protokollen durchgeführt.

Investigations into maternal milk components have increased as interest in early life development research rises. As the sole source of nutrition during the neonatal period, the bioactive compounds in milk are essential for ideal growth and development, especially in the context of intestinal and immune health3. The method presented here is a simple, non-invasive method of collecting milk from the lactating rat in amounts sufficient for downstream analysis, such as oligosaccharide profiling6. The me...

Milch ist die einzige Nahrungsquelle für neugeborene Säugetiere, die Bereitstellung von Energie und Nährstoffe für das Kinderwachstum und Entwicklung 1,2. Während Milch besteht hauptsächlich aus Zellen, Lipide und Protein-1, es enthält auch eine Vielzahl von bioaktiven Verbindungen, die frühen Lebens Entwicklung der Nachkommenschaft einschließlich Enzyme, Kohlenhydrate, Hormone, Antikörper, Wachstumsfaktoren, Cytokine, Exosomen, Mikrovesikel und kleinen RNAs wie zu modulieren wie microRNA 1,2. Die grundlegende Rolle der Muttermilch in der Gründung der Nachkommen Immun- und Darmgesundheit 3, verbunden mit dem Nachweis, dass gestillte Kinder sind weniger anfällig für Krankheiten 2, unterstreicht die Bedeutung der Identifizierung der Milchbestandteilen mit Krankheitsprozesse in der frühen Leben verbunden und die molekularen Mechanismen beteiligt in ihren Handlungen. Die Entwicklungs Ratte ist ein beliebtes Modell für die Untersuchung der Wirkung von verschiedenen Ernährungs, physiologischen und chemischen Eingriffen an frühen-life Entwicklung 4. Die Analyse von Rattenmilch kann daher bieten neue Einblicke in mütterlichen und Nachkommen Gesundheit. Aktuelle wissenschaftliche Fortschritte bieten jetzt die Verbesserung der Chancen für eine eingehende Untersuchung der Auswirkungen von bestimmten Milchbestandteilen auf Gesundheit und Krankheit. Beispielsweise wurde die Sequenzierung von Milchbakterienprofile ihre Rolle in der frühen Darmbesiedlung des Säuglings gut 5 erläutert, Massenspektrometrieanalyse Milch-Oligosaccharide haben Einblick in die Veränderung der Milch Oligosaccharid-Profile über die Ernährung der Mutter 6 und tiefe Sequenzierung MikroRNA in sezerniert bereitgestellt die Fettkügelchen der Muttermilch unterstreicht möglichen Rollen in Gen-Transkription, den Stoffwechsel und die Immunfunktion 7. Rattenmodelle stellen eine der im mütterlichen Studien 8,9 verwendet beliebtesten Modellorganismen. Ein Vorteil ist die kurze Schwangerschaft und Stillzeiten von nur approximately 21 Tage je; Daher ist die Gesamtzeit vom Beginn der Schwangerschaft bis Laktation für eine kurze Zeitdauer, in der wichtige Daten erzeugt werden. Die größere Größe von Ratten im Vergleich zu Mäusen, im Zusammenhang mit der Milchsammlung kann einen signifikanten Vorteil in Bezug auf Milchvolumen und Leichtigkeit der Milchsammlung bereitzustellen; Milchproduktion in der Maus, zum Beispiel, scheint abhängig von Gesamtkörpergewicht mit schwereren Mäuse produzieren mehr Milch 10 zu sein. Hier wird eine allgemeine Beschreibung für die manuelle Sammlung von Milch von säugenden Ratten wird. Dieses Protokoll erfordert eine Minimalausstattung ist nicht-invasiv, billig und kann verwendet werden, um eine ausreichende Milchmengen zur weiteren Downstream-Analysen zu sammeln. In Kürze wird der Damm mit Isofluran, Milch Reinfall wird durch Oxytocin stimuliert und Milch wird über manuelle Ausdruck der Milch in Kapillarröhrchen gesammelt. Schließlich wird, wie zwei Hauptkomponenten von Milchfett und Proteine ​​sind, eine kurze description der Schätzung Milchfettgehalt unter Verwendung creamatocrit Messungen 11 und Quantifizierung der Gesamtproteinkonzentration unter Verwendung eines Standard-Protein-Assay wird vorgestellt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="829">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Equipment - Milking</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 ml syringes</td>
			<td style="width:191px;">BD-Canada</td>
			<td style="width:119px;">309602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25 G needles</td>
			<td style="width:191px;">BD-Canada</td>
			<td style="width:119px;">305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">18 G needles</td>
			<td style="width:191px;">BD-Canada</td>
			<td style="width:119px;">305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 ul Microdispenser Capillary Tubes</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">21-169D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oxytocin (20 USP Units/ml)</td>
			<td style="width:191px;">Bimeda-MTC</td>
			<td style="width:119px;">1OXY015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">PPC Vet Isoflurane Inhalation Anesthetic, 250 ml</td>
			<td style="width:191px;">Fresenius Kabi</td>
			<td style="width:119px;">M60302</td>
			<td>Used on the order of a veterinarian</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile Alcohol Prep Pad</td>
			<td style="width:191px;">Dukal</td>
			<td style="width:119px;">853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Absorbent Bench Underpad</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">82020-845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Maxi-Therm Hyper/Hypothermia Blanket</td>
			<td style="width:191px;">Cincinnati Sub-Zero</td>
			<td style="width:119px;">274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Rodent Anesthesia Machine with Vaporizer</td>
			<td style="width:191px;">Benson Medical Industries Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Subject to individual laboratory needs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:353px;">Animal Masks</td>
			<td style="width:191px;">Benson Medical Industries Inc.</td>
			<td style="width:119px;">50100/50102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:191px;">Axygen</td>
			<td style="width:119px;">MCT-060-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ChroMini Professional Trimmer</td>
			<td style="width:191px;">Wahl</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Equipment - Creamatocrit</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">StatSpin SafeCrit Plastic Microhematocrit Tubes (Untreated)</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-274-914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Critoseal Capillary Tube Sealant Tray</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">470161-478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">StatSpin CritSpin Microhematocrit Centrifuge</td>
			<td style="width:191px;">Beckman Coulter, Inc</td>
			<td style="width:119px;">X00-004999-001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

milk collection in the rat using capillary tubes and estimation of milk fat content by creamatocrit

Milk, as the sole source of nutrition for the newborn mammal, provides the necessary nutrients and energy for offspring growth and development. It also contains a vast number of bioactive compounds that greatly affect the development of the neonate. The analysis of milk components will help elucidate key factors that link maternal metabolism and health with offspring growth and development. The laboratory rat represents a popular model organism for maternal studies, and rat milk can be used to examine the effect of various maternal physiological, nutritional, and pharmacological interventions on milk components, which may then impact offspring health. Here a simple method of manually collecting milk from the lactating rat that can be performed by a single investigator, does not require specialized vacuum or suction equipment, and provides sufficient milk for subsequent downstream analysis is described. A method for estimating the fat content of milk by measuring the percentage of cream within the milk sample, known as the creamatocrit, is also presented. These methods can ultimately be used to increase insight into maternal-child health and to elucidate maternal factors that are involved in proper growth and development of offspring.

Milch wurde wie bei der Entwöhnung von Wistar Dämme beschrieben gesammelt (ca. 22 Wochen alt, mit einem Gewicht von 350 bis 400 g), das ein Steuerelement, protein verbraucht (AIN-93G-5, n =) (40% Casein wt / wt, n = 5) oder Hoch präbiotische Ballaststoffe (21,6% Gewicht / Gewicht, 1: 1-Verhältnis von Oligofructose und Inulin, n = 4) Ernährung während der Schwangerschaft und Stillzeit. Die Oxytocin-Dosis betrug 2 IU. Milch wurde gesammelt unter Verwendung von Kapillaren und einem Rohr wurde mit einem Hämatokrit Sp...

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Milk Collection in the Rat Using Capillary Tubes and Estimation of Milk Fat Content by Creamatocrit

Milk is a primary source of nutrition for the neonate. Analysis of milk components may provide insight into maternal factors that affect offspring health. This protocol describes a manual method of collecting milk samples from the lactating rat, which can then be used for further downstream analysis.

Milchsammlung in der Ratte Mit Kapillarröhrchen und Schätzung der Milchfettgehalt von Creamatocrit

Milk, as the sole source of nutrition for the newborn mammal, provides the necessary nutrients and energy for offspring growth and development. It also ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.2K Aufrufe.  University of Calgary. Milk is a primary source of nutrition for the neonate. Analysis of milk components may provide insight into maternal factors that affect offspring health. This protocol describes a manual method of collecting milk samples from the lactating rat, which can then be used for further downstream analysis.

Serie: Milk Collection in the Rat Using Capillary Tubes and Estimation of Milk Fat Content by Creamatocrit

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Eine Neuronale und Astrocyte Co-Kultur-Assay für High Content Analyse der Neurotoxizität

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Forschung

Biologie

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Liver fibrosis is defined by the excessive deposition of extracellular matrix by activated myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic myofibroblasts, including hepatic stellate cells, portal fibroblasts and bone marrow derived fibroblasts 1. Hepatic stellate cells have been the best studied, but portal fibroblasts are increasingly recognized as important contributors to the myofibroblast pool, particularly in biliary fibrosis 2. Portal fibroblasts undergo proliferation in response to biliary epithelial injury, potentially playing a key role in the early stages of biliary scarring 3-5. A method of isolating portal fibroblasts would allow in vitro study of this cell population and lead to greater understanding of the role portal fibroblasts play in biliary fibrosis.
Portal fibroblasts have been isolated using various techniques including outgrowth 6, 7 and liver perfusion with enzymatic digestion followed by size selection 8. The advantage of the digestion and size selection technique compared to the outgrowth technique is that cells can be studied without the necessity of passage in culture. Here, we describe a modified version of the original technique described by Kruglov and Dranoff 8 for isolation of portal fibroblasts from rat liver that results in a relatively pure population of primary cells.

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

A technique for isolating portal fibroblasts from rat liver is described. Livers are perfused and digested in situ with collagenase, followed by ex vivo digestion of the liver slurry and size selection of cells. This method provides a pure population of portal fibroblasts without the need for passage in culture.

Isolierung von Ratten-Portal Fibroblasten durch<em&gt; In-situ</em&gt; Leberperfusion

Liver fibrosis is defined  by the excessive deposition of extracellular matrix by activated  myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic ...

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich vascularization and high density of mitochondria. BAT plays a major role in energy expenditure and non-shivering thermogenesis in newborn mammals as well as the adults 1. BAT-mediated thermogenesis is highly regulated by the sympathetic nervous system, predominantly via &beta; adrenergic receptor 2, 3. Recent studies have shown that BAT activities in human adults are negatively correlated with body mass index (BMI) and other diabetic parameters 4-6. BAT has thus been proposed as a potential target for anti-obesity/anti-diabetes therapy focusing on modulation of energy balance 6-8. While several cold challenge-based positron emission tomography (PET) methods are established for detecting human BAT 9-13, there is essentially no standardized protocol for imaging and quantification of BAT in small animal models such as mice. Here we describe a robust PET/CT imaging method for functional assessment of BAT in mice. Briefly, adult C57BL/6J mice were cold treated under fasting conditions for a duration of 4 hours before they received one dose of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG). The mice were remained in the cold for one additional hour post FDG injection, and then scanned with a small animal-dedicated micro-PET/CT system. The acquired PET images were co-registered with the CT images for anatomical references and analyzed for FDG uptake in the interscapular BAT area to present BAT activity. This standardized cold-treatment and imaging protocol has been validated through testing BAT activities during pharmacological interventions, for example, the suppressed BAT activation by the treatment of &beta;-adrenoceptor antagonist propranolol 14, 15, or the enhanced BAT activation by &beta;3 agonist BRL37344 16. The method described here can be applied to screen for drugs/compounds that modulate BAT activity, or to identify genes/pathways that are involved in BAT development and regulation in various preclinical and basic studies.

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

A method of functional imaging of mouse brown adipose tissue (BAT) is described in which cold-stimulated uptake of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG) in BAT is non-invasively assessed with a standardized micro-PET/CT protocol. This method is robust and sensitive to detect differences in BAT activities in mouse models.

Funktionelle Bildgebung Brown Fat in Mäusen mit FDG micro-PET/CT

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose  tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich  vascularization and high ...

Milk Collection Methods for Mice and Reeves' Muntjac Deer

Animal models are commonly used throughout research laboratories to accomplish what would normally be considered impractical in a pathogen&#8217;s native host. Milk collection from animals allows scientists the opportunity to study many aspects of reproduction including vertical transmission, passive immunity, mammary gland biology, and lactation. Obtaining adequate volumes of milk for these studies is a challenging task, especially from small animal models. Here we illustrate an inexpensive and facile method for milk collection in mice and Reeves&#8217; muntjac deer that does not require specialized equipment or extensive training. This particular method requires two researchers: one to express the milk and to stabilize the animal, and one to collect the milk in an appropriate container from either a Muntjac or mouse model. The mouse model also requires the use of a P-200 pipetman and corresponding pipette tips. While this method is low cost and relatively easy to perform, researchers should be advised that anesthetizing the animal is required for optimal milk collection.

Milk Collection Methods for Mice and Reeves&#039; Muntjac Deer

Milk collection from animal models facilitates various research avenues: understanding passive immunity, identifying pathogens responsible for vertical transmission and, through the use of transgenic mice, even commercial production of proteins found in human breast milk. Here we illustrate a simple method for milk collection in mice and Reeves&#8217; muntjac deer.

Milchauffangmethoden für Mäuse und Reeves Muntjac Deer

Animal models are commonly used throughout research laboratories to accomplish what would normally be considered impractical in a pathogen&#8217;s native ...

Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

The plant phloem is essential for the long-distance transport of (photo-) assimilates as well as of signals conveying biotic or abiotic stress. It contains sugars, amino acids, proteins, RNA, lipids and other metabolites. While there is a large interest in understanding the composition and function of the phloem, the role of many of these molecules and thus, their importance in plant development and stress response has yet to be determined. One barrier to phloem analysis lies in the fact that the phloem seals itself upon wounding. As a result, the number of plants from which phloem sap can be obtained is limited. One method that allows collection of phloem exudates from several plant species without added equipment is the EDTA-facilitated phloem exudate collection described here. While it is easy to use, it does lead to the wounding of cells and care has to be taken to remove contents of damaged cells. In addition, several controls to prove purity of the exudate are necessary. Because it is an exudation rather than a direct collection of the phloem sap (not possible in many species) only relative quantification of its contents can occur. The advantage of this method over others is that it can be used in many herbaceous or woody plant species (Perilla, Arabidopsis, poplar, etc.) and requires minimal equipment and training. It leads to reasonably large amounts of exudates that can be used for subsequent analysis of proteins, sugars, lipids, RNA, viruses and metabolites. It is simple enough that it can be used in both a research as well as in a teaching laboratory.

Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

Knowledge of the composition of the phloem sap as well as the mechanism of its loading and long-distance transport is essential for the understanding of long-distance signaling in plant development and stress/pathogen response and of assimilate transport. This manuscript describes the collection of phloem exudates using the EDTA-facilitated method.

Sammlung und Analyse von<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Phloemexsudaten Mit der EDTA-Methode erleichtert

The plant phloem is essential for the long-distance transport of (photo-) assimilates as well as of signals conveying biotic or abiotic stress. It ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, excessive ROS levels induce a state of oxidative stress, which is accompanied by irreversible oxidative damage to DNA, lipids and proteins. Thus, quantification of ROS provides a direct proxy for cellular health condition. Since mitochondria are among the major cellular sources and targets of ROS, joint analysis of mitochondrial function and ROS production in the same cells is crucial for better understanding the interconnection in pathophysiological conditions. Therefore, a high-content microscopy-based strategy was developed for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, mitochondrial membrane potential (&#916;&#936;m) and mitochondrial morphology. It is based on automated widefield fluorescence microscopy and image analysis of living adherent cells, grown in multi-well plates, and stained with the cell-permeable fluorescent reporter molecules CM-H2DCFDA (ROS) and TMRM (&#916;&#936;m and mitochondrial morphology). In contrast with fluorimetry or flow-cytometry, this strategy allows quantification of subcellular parameters at the level of the individual cell with high spatiotemporal resolution, both before and after experimental stimulation. Importantly, the image-based nature of the method allows extracting morphological parameters in addition to signal intensities. The combined feature set is used for explorative and statistical multivariate data analysis to detect differences between subpopulations, cell types and/or treatments. Here, a detailed description of the assay is provided, along with an example experiment that proves its potential for unambiguous discrimination between cellular states after chemical perturbation.

This paper presents a high-content microscopy workflow for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, as well as mitochondrial membrane potential and morphology &#8211; jointly referred to as mitochondrial morphofunction &#8211; in living adherent cells using the cell-permeant fluorescent reporter molecules 5-(and-6)-chloromethyl-2&#39;,7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester (CM-H2DCFDA) and tetramethylrhodamine methylester (TMRM).

Cellular Redox Profiling mit hochauflösender Mikroskopie

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

Determination of Sialic Acids in Liver and Milk Samples of Wild-type and CMAH Knock-out Mice.

CMAH (cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase) is responsible for the oxidation of cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acids in mammals. However, humans cannot oxidize cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid to cytidine monophosphate-N-glycolylneuraminic acid due to a primary exon deletion of the CMAH gene. To understand the effects and implications of the lack of CMAH activity in more detail, a Cmah knock-out model in mice is of keen interest in basic and applied research. The analysis method to determine the phenotype of this mouse model is herein described in detail, and is based on the detection of both N-acetylneuraminic acid and N-glycolylenuraminic acid in the liver and milk of wild-type and Cmah knock-out mice. Endogenous sialic acids are released and derivatized with o-phenylenediamine to generate fluorogenic derivatives, which can be subsequently analyzed by HPLC. The presented protocol can be also applied for the analysis of milk and tissue samples from various other origins, and may be of use to investigate the nutritional and health effects of N-glycolylneuraminic acid.

Determination of Sialic Acids in Liver and Milk Samples of Wild-type and CMAH Knock-out Mice.

We describe a HPLC-based method for the determination of N-acetylneuraminic acid and N-glycolylenuraminic acid in mouse liver and milk.

Bestimmung von Sialinsäuren in Leber- und Milchproben von Wildtyp und<em&gt; CMAH</em&gt; Knock-out Mäuse.

CMAH (cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase) is responsible for the oxidation of cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acids in ...

Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body

Autophagy is a cellular self-digestion process. It delivers cargo to the lysosomes for degradation in response to various stresses, including starvation. The malfunction of autophagy is associated with aging and multiple human diseases. The autophagy machinery is highly conserved-from yeast to humans.&#160;The larval fat body of Drosophila melanogaster, an analog for vertebrate liver and adipose tissue, provides a unique model for monitoring autophagy in vivo. Autophagy can be easily induced by nutrient starvation in the larval fat body. Most autophagy-related genes are conserved in Drosophila. Many transgenic fly strains expressing tagged autophagy markers have been developed, which facilitates the monitoring of different steps in the autophagy process. The clonal analysis enables a close comparison of autophagy markers in cells with different genotypes in the same piece of tissue. The current protocol details procedures for (1) generating somatic clones in the larval fat body, (2) inducing autophagy via amino acid starvation, and (3) dissecting the larval fat body, aiming to create a model for analyzing differences in autophagy using an autophagosome marker (GFP-Atg8a) and clonal analysis.

Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body

The present protocol describes the induction of autophagy in the Drosophila melanogaster larval fat body via nutrient depletion and analyzes changes in autophagy using transgenic fly strains.

Analyse der Hunger-induzierten Autophagie in der Drosophila melanogaster-Larve des Fettkörpers

Autophagy is a cellular self-digestion process. It delivers cargo to the lysosomes for degradation in response to various stresses, including starvation. ...

Quantifizierung der Fettinfiltration der Skelettmuskulatur durch Dezellularisierung

Decellularization-Based Quantification of Skeletal Muscle Fatty Infiltration

Fatty infiltration is the accumulation of adipocytes between myofibers in skeletal muscle and is a prominent feature of many myopathies, metabolic disorders, and dystrophies. Clinically in human populations, fatty infiltration is assessed using noninvasive methods, including computed tomography (CT), magnetic resonance imaging (MRI), and ultrasound (US). Although some studies have used CT or MRI to quantify fatty infiltration in mouse muscle, costs and insufficient spatial resolution remain challenging. Other small animal methods utilize histology to visualize individual adipocytes; however, this methodology suffers from sampling bias in heterogeneous pathology. This protocol describes the methodology to qualitatively view and quantitatively measure fatty infiltration comprehensively throughout intact mouse muscle and at the level of individual adipocytes using decellularization. The protocol is not limited to specific muscles or specific species and can be extended to human biopsy. Additionally, gross qualitative and quantitative assessments can be made with standard laboratory equipment for little cost, making this procedure more accessible across research laboratories.

Autor im Rampenlicht: Dezellularisierungsbasierte Quantifizierung der Fettinfiltration der Skelettmuskulatur  

The present study describes decellularization-based methodologies for visualizing and quantifying intramuscular adipose tissue (IMAT) deposition through intact muscle volume, as well as quantifying metrics of individual adipocytes that comprise IMAT.