Dieses Protokoll ist einfach durchzuführen. Die Klonphase ermöglicht es, eine größere Anzahl von T-Klonen aus frischen Proben zu gewinnen. Darüber hinaus können der Phänotyp und die Funktion von T-Zellen leicht analysiert werden.
Das Verfahren wird Mary Christopher, eine Doktorandin aus meinem Labor, demonstrieren. Um das Klonen von T-Zellen zu induzieren, verwenden Sie den Beutelspike mit dem nadelfreien Ventil, um einen bestrahlten Buffy-Coat-Beutel in einer Laminar-Flow-Haube zu öffnen. Bis zu 50 Milliliter Blut aus dem Beutel in einen T-150-Kolben geben und 70 Milliliter PBS in den Kolben geben.
Schichten Sie vorsichtig 30 Milliliter des verdünnten Blutes auf 20 Milliliter Dichtegradient in jedem der vier 50 Milliliter konischen Röhrchen und trennen Sie die Zellen durch Dichtegradientenzentrifugation. Saugen Sie den Überstand vorsichtig ab und übertragen Sie das PBMC von jedem Rohr in ein einziges neues 50-Milliliter-Rohr. Verwenden Sie PBS, um das Endvolumen auf 50 Milliliter zu bringen und das PBMC durch Zentrifugation zu sammeln.
Nach einer zweiten Wäsche unter den gleichen Bedingungen werden die isolierten Feederzellen zur Zählung in 10 Milliliter Zellkulturmedium suspendiert und 25 Milliliter eines 70 Milliliter Zellkulturmediums, ergänzt mit 50 Einheiten IL-2-Lösung, in jeweils zwei 50-Milliliter-Röhrchen gegeben. Dann fügen Sie Feederzellen zu einem Röhrchen mit einer 2 x 10 bis 6. Zelle pro Milliliter Zellkulturmedium hinzu, ergänzt mit IL-2-Konzentration. Um eine T-Lymphozytenkultur einzurichten, poolen Sie den T-Zell-Klon, der Überstände aus dem stenotischen Klappenprobenkolben enthält, in einem einzigen 50-Milliliter-Röhrchen und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation.
Waschen Sie das Pellet dreimal in 50 Milliliter PBS pro Wäsche, bevor Sie die Zellen in 1 Milliliter Zellkulturmedium zur Zählung wiederverwenden. Verdünnen Sie die Zellen auf eine Konzentration von 1 x 10 bis 3. Zellen pro Milliliter und geben Sie 500 Mikroliter Zellen in das Röhrchen aus Zellkulturmedium, das mit IL-2 ohne Feederzellen ergänzt wird. Geben Sie die Feederzellensuspension in eine 100 x 15 Milliliter große Petrischale aus Kunststoff und geben Sie 100 Mikroliter Feederzellen zu jeder Vertiefung der entsprechenden Anzahl von U-Bottom-96-Well-Platten für das Experiment hinzu.
Dann geben Sie die T-Zellen in eine Petrischale und fügen Sie 100 Mikroliter T-Zellen zu jeder Feederzelle hinzu, die für eine einwöchige Inkubation im Zellkultur-Inkubator gut ergänzt wird. Die PBMC-Isolierung ist entscheidend für die Gewinnung von Feederzellen und ermöglicht den Nachweis und die Charakterisierung von infiltrierenden Leukozyten in Aortenklappenproben. Nach zwei Wochen Inkubation kann eine Klon-T-Zell-Population erhalten werden.
Hier wird das Gating-Schema zur Analyse von T-Zell-Subpopulationen bei Patienten mit kalzifischer Aortenklappenerkrankung gezeigt. Wie bei diesem Patienten beobachtet, gab es mehr CD4+T-Zellen als CD8+T-Zellen. Die durchflusszytometrische Analyse von nicht geklonten T-Zellen bestätigt, dass die gleichen T-Zell-Marker sowohl in nativen Klappen- als auch in Klonproben vorhanden sind.
Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass T-Zellen in verkalkten Aortenklappen mit CD45 + Leukozyten vorhanden sind, was darauf hindeutet, dass eine kalzitive Aortenklappenerkrankung mit der Aktivierung des Immunsystems und der Entzündungsaktivität verbunden ist. Diese Methode ist sehr vielseitig. Es kann auf verschiedene Protokolle angewendet werden, für die Forscher in der Lage sein müssen, Zellen aus einem Gewebe für die funktionelle Charakterisierung zu isolieren.
Denken Sie daran, dass es wichtig ist, unter sterilen Bedingungen zu arbeiten, um eine Kontamination zu vermeiden und die Zellen unter dem Mikroskop kritisch zu beobachten.
