Forschung an der SNU wird unterstützt durch die National Research Foundation (NRF) von MEST Korea für Tumor Mikroumgebung Global Core Research Center (GCRC) Zuschuss, [Grant-Nummer 2011-0030001]; von der Seoul National University Research Grant und Gehirn Korea (BK21) PLUS Programm.

(1) Kolonie Bildung Assays
<ol><li>Kultur A549 Zellen in einer Konzentration von 20.000 Zellen/cm2 in 15 mL RPMI1640 Zelle Kulturmedium ergänzt mit 10 % FBS (fetale Rinderserum) und 1 % Antibiotika in einem 75 cm2 Kolben in eine CO2 Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2.</li>
	<li>Am Tag des Experiments bestimmen Sie die Zellkonzentration mithilfe eines Hemocytometer. Sammeln Sie 50.000 Zellen durch Zentrifugation bei 400 X g für 7 min in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und auszusetzen Sie Zellen in 100 µL 1 X sterile PBS (Phosphat gepufferte Kochsalzlösung) in 1,5 mL Röhrchen wieder.</li>
	<li>1,1 mL halbfeste Methylcellulose-basierte Medium (MCBM) in 15 mL Tuben mit einer Multipipette zu verzichten. Bereiten Sie eine Röhre für jede Bedingung.</li>
	<li>1,1 mL MCBM mit einer Mikropipette P200 fügen Sie 110 µL FBS hinzu.</li>
	<li>Samen Zellen bei 1.000 Zellen/mL. 2.4 µL Zellsuspension aus der Stammlösung (50.000 Zellen in 100 µL 1 X PBS) sammeln mit Hilfe einer Mikropipette P2 und hinzufügen auf 1,1 mL MCBM ergänzt mit 10 % FBS.</li>
	<li>Nach dem Hinzufügen der Zellen Wirbel die Röhren für 1 min, hielt sie vertikal mit der höchsten Geschwindigkeit MCBM und Zellen gut mischen.</li>
	<li>Fügen Sie Testverbindungen (OT48 allein oder in Kombination mit A1210477). Bereiten Sie einen separaten Schlauch als Steuerelement für das Lösungsmittel verwendet (hier Dimethyl Sulfoxid (DMSO)). Abhängig von der Konzentration der Verbindungen und die Lautstärke für jede Bedingung hinzugefügt beinhaltet das Lösungsmittel-Steuerelement die höchste Konzentration an Lösungsmittel verwendet für die Verdünnungen der Testverbindung für Beeinträchtigungen durch das Lösungsmittel zu bewerten.</li>
	<li>Vortex-Rohre für 1 Minute.</li>
	<li>Fügen Sie für jede Probe 1 mL der Mischung mit einer Mikropipette P1000 auch ein 12-Well Zellplatte Kultur Zentrum hinzu.</li>
	<li>Füllen Sie leere Brunnen mit 1 mL sterilem Wasser oder 1 X PBS, Luftfeuchtigkeit zu stabilisieren.</li>
	<li>10 Tage im Brutschrank bei 37 ° C und 5 % CO2inkubieren Sie Kultur Platten.</li>
	<li>Fügen Sie nach 10 Tagen Inkubation 200 µL der Stammlösung ein MTT-(Methylthiazolyldiphenyl-Tetrazolium Bromid) (5 mg/mL) in jede Vertiefung, eine Endkonzentration von 1 mg/mL zu erreichen.</li>
	<li>Inkubieren Sie 10 min. im Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2. Tragfähige Kolonien schaltet sich violett.</li>
	<li>Erfassen Sie das Abbild mit einer Digitalkamera mit der weiße Hintergrundplatte (LAS weißen Dia Tray). Verwenden Sie die folgenden Einstellungen: Methode, zu digitalisieren; Exposition Art, Präzision; Belichtungszeit, Handbuch, 1 Sekunde; Empfindlichkeit/Auflösung, hohe Auflösung. Speichern Sie das Bild im TIFF-Format.</li>
	<li>Quantifizieren Sie tragfähige Kolonien mit ImageJ-Software. Menü "Auswahl" "Bild | Typ | 8-Bit". Menü "Auswahl" "Adjust | Threshold". Festlegen Sie Schwellenwert, zu kontrollieren und halten Sie für alle Bedingungen konstant zu; Menü "Auswahl" "Analyze | Analysieren Sie Partikel". Daten speichern und analysieren mit einer Statistik-Software für grafische Darstellung.</li>
</ol>(2) Sphäroid Bildung Assay
<ol><li>Kultur A549 Zellen in einer Konzentration von 20.000 Zellen/cm2 in 75 cm2 Fläschchen mit 15 mL RPMI 1640 Medium mit 10 % FBS und 1 % Antibiotika ergänzt.</li>
	<li>Am Tag des Experiments, bereiten eine 96 gut U-Bodenplatte.</li>
	<li>Platte 10.000 Zellen in einen Brunnen, der bereits die Verbindung von Interesse (hier 50 µM der OT48) bzw. 20 µM A1210477 enthält. Die letzte Lautstärke zu 100 µL Zellkulturmedium. Die Anzahl der Zellen, die einheitliche Sphäroide mit eine intakte äußere Begrenzung gilt als ausreichend, um Form Sphäroide.</li>
	<li>3 Tage im Brutschrank bei 37 ° C und 5 % CO2inkubieren.</li>
	<li>Nach 3 Tagen Inkubation die Aufnahmen von der Sphäroide mit einem Lichtmikroskop mit 4 X Vergrößerung.</li>
</ol>(3) Zebrafisch Xenograft-Assay
Hinweis: Dieser technische Ansatz ist als ein Schaltplan (Abbildung 1) visualisiert.
<ol><li>
Vorbereitung der Lager Reagenzien
	<ol>
<li>Bereiten Sie 1 L 30 x Danieaus Lösung: 1740 mM NaCl, KCl 21 mM, 12 mM MgSO4∙7H2O, 18 mM Ca (NO3)2und 150 mM HEPES. Der pH-Wert des Puffers bis 7.6 mit dem pH-Meter passen.</li>
		<li>Bereiten Sie 1 % (50 X) Tricaine Lösung: 20 mg Ethyl-3-Aminobenzoate-Methanesulfonate (Tricaine) in 2 mL destilliertem Wasser auflösen.</li>
		<li>Bereiten Sie 1 % Phenol Red-PBS-Lösung: Add 2 µL Phenol rot Natrium-Salz-Lösung zu 198 µL sterilisierte PBS-Lösung in einem 1,5 µL Rohr.</li>
		<li>3 % Methylcellulose vorbereiten: 100 mL 1 x Danieaus Lösung 3 g von Methylcellulose hinzufügen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Zebrafisch-Ei-Produktion und Inkubation
	<ol>
<li>Trennen eines weiblichen und eines männlichen Zebrafisch in eine Partition Tank gefüllt mit UV-sterilisiert und gefiltertes Leitungswasser bei 28,5 ° C im Dunkeln. Nach 24 Stunden der Trennung mix Fisch beider Geschlechter, Paarung zu initiieren. Übertragen Sie befruchtete Eier aus der Paarung Tank auf einer Petrischale mit 5 mL frischem Danieau Lösung.</li>
		<li>Waschen Sie Eier dreimal mit 5 mL Danieau Lösung. Aspirieren Sie für das Waschen sorgfältig die Eier mit einer Pipette und Transfer zum 5 mL frische Lösung. 8 h bei 28,5 ° c inkubieren<ol>
<li>Ändern Sie nach 8 h Inkubation in Danieau Lösung in Danieau Lösung mit 0,03 % 1-Phenyl-2-Thioharnstoff (PTU), Pigmentierung zu hemmen. Aussortieren von undurchsichtigen Eier (unbefruchtete oder mit unbebauten Embryonen) um Verunreinigungen zu verhindern.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Embryo-dechorionation
	<ol>
<li>24 h post Düngung (hpf), Dechorionate Zebrafisch-Embryonen mit scharfen Pinzette. Schraffur Embryonen in Danieau Lösung mit 0,03 % inkubieren PTU bei 28,5 ° C bis 48 hpf.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Verbindung-behandelten Zellen Vorbereitung
	<ol>
<li>Samen A549 Zellen bei 20.000 Zellen/cm2 in 25 cm2 Kulturflaschen. Nach 24 Stunden der Aussaat Verbindungen hinzufügen (hier OT48 bei 50 µM und/oder A1210477 bei 20 µM) für 24 Std. im Brutschrank bei 37 ° C und 5 % CO2. Richten Sie die Behandlungszeit für jede Verbindung die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten, sondern in Richtung Zelltod zu begehen. Dieser Zeitpunkt muss individuell anhand der Zellviabilität, Morphologie und molekulare Marker eingerichtet werden.</li>
		<li>2 h vor dem Ende der Behandlung, Farbstoff Fleck Zellen mit 4 µM fluoreszierende Zelle Tracker CM-Dil bei 37 ° C und 5 % CO2. Nach 2 h Inkubation trypsinize Zellen mit 0,05 % Trypsin-EDTA und 106 Zellen in 50 µL Phenol Red-PBS-Lösung vor der Injektion zu verdünnen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mikro-Injektion von Krebszellen für Xenograft-Bildung
	<ol>
<li>Zebrafisch eine 0,02 % Tricaine Lösung für 5 min zu betäuben, bis sie auf einer nährbodenplatte niederzulassen.</li>
		<li>Ziehen Sie eine 1,0 mm (außen Durchmesser (OD) Glas Kapillare) von einer Mikropipette Abzieher (Programm-Einstellungen: P: 300, Hitze: 260, ziehen: 60, VEL: 50 und Zeit: 200). Schneiden Sie die Microcapillary mit einer Spritze, eine scharfe Kante zu produzieren. Laden mikrokapillaren mit 20 µL der Zelle/Phenol Red-PBS-Lösung. Einspritzdruck und Uhrzeit einstellen, um zu verzichten, 2 nL pro Injektion.</li>
		<li>Injizieren von 100 – 200 Zellen in dem Dottersack durch Injektion 6 bis 10 nL über 3 bis 5 Injektionen. Können Sie nach der Injektion Fisch für 10 bis 30 min in 5 mL frisches Danieau Lösung mit PTU Lösung wiederherstellen. Versand Fische in 24-Well-Platten mit 1 mL Danieau Lösung mit PTU Lösung und 72 h bei 28,5 ° c inkubieren</li>
		<li>Nach 72 h Inkubationszeit Fisch in einer 0,02 % Tricaine Lösung zu betäuben und auf einem Objektträger mit einem Rückgang von 3 % Methylcellulose zu immobilisieren. 5 X fotografieren durch Fluoreszenzmikroskopie bei einer Wellenlänge von 620 bis 750 nm.</li>
		<li>Quantifizieren Sie die Größe des fluoreszierenden Tumoren von ImageJ-Software. Menü "Auswahl" "Analyze | Maßnahme". Speichern von Werten entspricht das Fluoreszenzsignal und analysieren mit einer Statistik-Software für grafische Darstellung.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Giancotti, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deregulation+of+cell+signaling+in+cancer.">Deregulation of cell signaling in cancer.</a> FEBS Letters. 588 (16), 2558-2570 (2014).</li><li>Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioprinting+for+cancer+research.">Bioprinting for cancer research.</a> Trends in Biotechnology. 33 (9), 504-513 (2015).</li><li>Santo, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+in+3D+in+vitro+tumor+models:+overcoming+current+pitfalls+of+efficacy+read-outs.">Drug screening in 3D in vitro tumor models: overcoming current pitfalls of efficacy read-outs.</a> Biotechnology Journal. 12 (1), (2017).</li><li>Tanner, K., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+3D+culture+models+of+cancer.">Beyond 3D culture models of cancer.</a> Science Translational Medicine. 7 (283), 283ps289 (2015).</li><li>Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+cell+culture:+a+review+of+current+approaches+and+techniques.">3D cell culture: a review of current approaches and techniques.</a> Methods in Molecular Biology. 695, 1-15 (2011).</li><li>Talhi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bis(4-hydroxy-2H-chromen-2-one):+synthesis+and+effects+on+leukemic+cell+lines+proliferation+and+NF-kappaB+regulation.">Bis(4-hydroxy-2H-chromen-2-one): synthesis and effects on leukemic cell lines proliferation and NF-kappaB regulation.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 22 (11), 3008-3015 (2014).</li><li>Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonogenic+assay+of+cells+in+vitro.">Clonogenic assay of cells in vitro.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).</li><li>Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Tumor+Models:+Advantages,+Disadvantages,+Variables,+and+Selecting+the+Right+Platform.">In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).</li><li>Lee, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytostatic+hydroxycoumarin+OT52+induces+ER/Golgi+stress+and+STAT3+inhibition+triggering+non-canonical+cell+death+and+synergy+with+BH3+mimetics+in+lung+cancer.">Cytostatic hydroxycoumarin OT52 induces ER/Golgi stress and STAT3 inhibition triggering non-canonical cell death and synergy with BH3 mimetics in lung cancer.</a> Cancer Letters. 416, 94-108 (2018).</li><li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+to+the+soft-agar+assay+that+permits+high-throughput+drug+and+genetic+screens+for+cellular+transformation.">Alternative to the soft-agar assay that permits high-throughput drug and genetic screens for cellular transformation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5708-5713 (2015).</li><li>Spoerri, L., Beaumont, K. A., Anfosso, A., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Cell+Cycle+Imaging+in+a+3D+Cell+Culture+Model+of+Melanoma.">Real-Time Cell Cycle Imaging in a 3D Cell Culture Model of Melanoma.</a> Methods in Molecular Biology. 1612, 401-416 (2017).</li><li>Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, F., Weninger, W., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging-+and+Flow+Cytometry-based+Analysis+of+Cell+Position+and+the+Cell+Cycle+in+3D+Melanoma+Spheroids.">Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53486 (2015).</li><li>Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+cell+culture+techniques+for+cancer+drug+discovery.">Advanced cell culture techniques for cancer drug discovery.</a> Biology (Basel). 3 (2), 345-367 (2014).</li><li>Ji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dialkyl+resorcinol+stemphol+disrupts+calcium+homeostasis+to+trigger+programmed+immunogenic+necrosis+in+cancer.">The dialkyl resorcinol stemphol disrupts calcium homeostasis to trigger programmed immunogenic necrosis in cancer.</a> Cancer Letters. 416, 109-123 (2018).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die Preise der Kolonie Formation mit MCBM erhalten richtet sich nach dem Zelltyp. Für nicht-anhaftende Zellen, wird die Anzahl der Kolonien in der Regel viel höher mit adhärenten Zellen verglichen. Wir beobachteten, dass A549 Zellen nach 10 Tagen 30 bis 40 Kolonien gegründet. Zuvor haben wir für verschiedene Leukämiezellen berichtet, dass die Anzahl der Kolonien zwischen 200 bis 2509ist. Unsere Ergebnisse zeigten, dass OT48 allein keine signifikante Abnahme der Anzahl der Kolonien allein her...

Krebs wird durch zelluläre Mutationen verursacht und folglich biochemischen Signalwege gestört werden, unkontrollierte Zellteilung und Widerstand zum Zelltod auszulösen. Tumoren stören mit physiologischen Funktionen von Verdauungs, Nervensystem, Herz-Kreislauf-Systems und anschließend benachbarte Gewebe1. Trotz umfangreicher Forschungsbemühungen bleibt Krebs die häufigste lebensbedrohliche Krankheit in der Welt2. Präzisions-Medizin wurde als Grundlage für zukünftige Krebstherapie anerkannt. Neue Wirkstoffe werden routinemäßig getestet in Kombination mit vorhandenen Drogen, klinische Outcome zu verbessern.
Eine erhebliche Einschränkung verbunden mit der Entwicklung der neuen effiziente zielgerichtete Therapien ist jedoch das Scheitern von häufig verwendeten Assays, die genaue biologische Ergebnis der Droge Exposition3zu simulieren. Krebs Wirkstoffforschung stützt sich nach wie vor überwiegend auf testen die Wirksamkeit therapeutischer Wirkstoffe in Krebszelllinien kultiviert in 2D Monolayer-Kulturen, die schwer in klinischen Studien4zu validieren sind. Daher gibt es ein wachsendes Interesse, bessere Krebs Modelle zu entwickeln, die die systemeigene Funktionen von Tumoren in Vivo5besser zu imitieren. In den letzten Jahren führte ein zunehmendes Interesse an 3D Culture Modelle die Entwicklung von verbesserten Methoden, 3D Tumor Modelle5zu produzieren.
Hier stellen wir einen Ansatz mit drei verschiedenen 3D Zelle Kulturtechniken zur Verbesserung des Verständnisses der Potenz des Hydroxycoumarin OT486 in Kombination mit BH3-Mimetika vor mehr in Tiefe in Vivo Tests. Unsere Methode besteht darin, Kolonie und SFAs mit einem in Vivo Tumor Bildung Test basiert auf einem Zebrafisch-Modell weiter bestätigen die Wirksamkeit der Kombination von OT48 und BH3-Mimetika in Lungenkrebszellen und überwachen Krebsentwicklung in einer lebendigen verbinden Organismus.
Kolonie-Bildung-Assays sind routinemäßig zur Wirksamkeit der Anti-Krebs-Agents für solide sowie hämatopoetischen Krebsarten zu beurteilen. Der Test bestimmt die Fähigkeit einer Zelle zu vermehren auf unbestimmte Zeit und bilden Kolonien7. Die Wirkung von Anti-Krebs-Agent auf die koloniebildenden Fähigkeit der Zellen wird durch Abnahme der Anzahl und/oder Größe der Kolonien bestimmt.
Sphäroide vertreten in Vitro Tumormodellen und dienen als eine kostengünstige Screening-Plattform für Anti-Krebs-Agenten. Sphäroide sind Aggregate von Zellen in Suspension wachsen oder in einer 3D Matrix eingebettet. Dieser Ansatz ist für Wirkstoff-Screening und Studien von Tumor Wachstum, Vermehrung und Immune Interaktion8verbreitet.
Um die Eigenschaften eines neuen Medikaments vollständig zu verstehen, gilt es in Vivo Experimente auf Nagetiere durchzuführen. Diese herkömmliche Methode ist jedoch teuer und zeitaufwendig. Zebrafisch (Danio Rerio) wurde in den letzten Jahren ein weit studierte Labor-Organismus, der ist billiger und schneller zu erhöhen. Tumoren entwickelt im Zebrafisch repräsentieren eine 3D Zelle Kultur Ansatz aber innerhalb der in Vivo -Einstellung eines Wirbeltier-9.
Insgesamt verwenden wir hier drei verschiedene 3D Culture Ansätze einschließlich aufgewendete, SFAs und Zebrafisch in Vivo Tumorbildung um die Anti-Krebs der Hydroxycoumarin OT48 in einem Lungenkrebs Krebs A549 Zellmodell in Kombination mit BH3-Mimetika unter Beweis zu stellen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials required for colony formation assays</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-185</td>
			<td>37 C&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>30096</td>
			<td>4 C&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1520-500</td>
			<td>-20 C&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-602E</td>
			<td>-20 C&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask T75</td>
			<td>SPL</td>
			<td>70075</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS solution</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30256.02</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5ml tube</td>
			<td>Extragene</td>
			<td>Tube-170-C</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tube</td>
			<td>Hyundai Micro</td>
			<td>H20015</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plate</td>
			<td>SPL</td>
			<td>30012</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MethoCult</td>
			<td>StemCell technologies</td>
			<td>4230</td>
			<td>-20 C&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT powder)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5622</td>
			<td>4 C&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS4000</td>
			<td>GE Healthcare Technologies</td>
			<td></td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials required for spheroid formation assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-185</td>
			<td>37 C&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>30096</td>
			<td>4 C&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1520-500</td>
			<td>-20 C&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-602E</td>
			<td>-20 C&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask T75</td>
			<td>SPL</td>
			<td>70075</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS solution</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30256.02</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25-300-054</td>
			<td>4 C&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning costar ultra low attachemnt 96 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3474</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TS100</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials required for zebrafish xenografts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-185</td>
			<td>37 C&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>30096</td>
			<td>4 C&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1520-500</td>
			<td>-20 C&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-602E</td>
			<td>-20 C&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask T25</td>
			<td>SPL</td>
			<td>70025</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask T75</td>
			<td>SPL</td>
			<td>70075</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask T175</td>
			<td>SPL</td>
			<td>71175</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5ml tube</td>
			<td>Extragene</td>
			<td>Tube-170-C</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>SPL</td>
			<td>30024</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish</td>
			<td>SPL</td>
			<td>10100</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS solution</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30256.02</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25-300-054</td>
			<td>4 C&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71382</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2773</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium nitrate tetrahydrate (Ca(NO3)2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1396</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0512</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-phenyl-2-thiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM-Dil dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C7001</td>
			<td>-20 C&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW 100F-4</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Shutter instrument, USA</td>
			<td>P-97</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro injector</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV820</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>KOVAX</td>
			<td>1ml</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro loader</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>HSU-1000612</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscopy</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DE/DM 5000B</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preclinical assessment of the bioactivity of the anticancer coumarin ot48 by spheroids, colony formation assays, and zebrafish xenografts

In Vitro und in Vivo prä-klinischen Screening von neuartiger Therapeutika sind ein wesentliches Instrument in der Drogeentdeckung Krebs. Obwohl menschliche Krebszelllinien therapeutischen Verbindungen in 2D (dreidimensionale) Monoschicht Zellkulturen Rechnung zu tragen, wurden 3D Culture Systeme entwickelt, um die Wirksamkeit von Medikamenten in mehr physiologisch relevanten Modelle zu verstehen. In den letzten Jahren verzeichneten ein Paradigmenwechsel in der präklinischen Forschung, die Potenz der neuen Moleküle in 3D Culture Systeme, genauer imitiert den Tumor Mikroumgebung zu validieren. Diese Systeme den Krankheitszustand zu charakterisieren, in gewissem Sinne mehr physiologisch relevanten und helfen, besser mechanistische Einblicke und Verständnis der pharmakologischen Potenz eines bestimmten Moleküls. Darüber hinaus ist mit dem aktuellen Trend in Vivo Krebs Modelle zu verbessern, Zebrafisch entstanden, als ein wichtiges fest gefügten Modell zu bewerten in Vivo Tumorbildung und Studie die Wirkung von therapeutischen Wirkstoffen. Hier untersuchten wir die therapeutische Wirksamkeit des Hydroxycoumarin OT48 allein oder in Kombination mit BH3-Mimetika in Lunge-Krebs-Zell-Linie A549 mithilfe von drei verschiedenen 3D Culture-Systeme einschließlich der Kolonie Bildung Assays (CFA), Sphäroid Bildung Assay (SFA) und in Vivo Zebrafisch Xenotransplantate.

In Abbildung 2Lungenkrebs Zelllinie, die A549 in MCBM Form Kolonien nach der Behandlung mit OT48 allein oder in Kombination mit BH3 mimetischen A1210477 in den angegebenen Konzentrationen ausgesät wurde. Die Ergebnisse zeigten, dass die Kombination Anzahl, Größe und Fläche der Kolonien nach 10 Tagen Inkubation deutlich reduziert.
In Abbildung 3A549 Zellen wurden mit...

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Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts

Präklinische Bewertung der Bioaktivität der Anti-Krebs Cumarin OT48 Sphäroide, Kolonie Bildung Assays und Zebrafisch Xenotransplantate

Hier präsentieren wir Ihnen die präklinische Vorführung von krebsbekämpfende Cumarine mit 3D Culture und Zebrafisch.

In vitro and in vivo pre-clinical screening of novel therapeutic agents are an essential tool in cancer drug discovery. Although human cancer cell lines ...

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

8.3K Aufrufe.  Seoul National University. Hier präsentieren wir Ihnen die präklinische Vorführung von krebsbekämpfende Cumarine mit 3D Culture und Zebrafisch.

Serie: Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased understanding of the molecular events that give rise to glioblastomas, this cancer still remains highly refractory to conventional treatment. Surgical resection of high grade brain tumors is rarely complete due to the highly infiltrative nature of glioblastoma cells. Therapeutic approaches which attenuate glioblastoma cell invasion therefore is an attractive option. Our laboratory and others have shown that tumor associated macrophages and microglia (resident brain macrophages) strongly stimulate glioblastoma invasion. The protocol described in this paper is used to model glioblastoma-macrophage/microglia interaction using in vitro culture assays. This approach can greatly facilitate the development and/or discovery of drugs that disrupt the communication with the macrophages that enables this malignant behavior. We have established two robust coculture invasion assays where microglia/macrophages stimulate glioma cell invasion by 5 - 10 fold. Glioblastoma cells labelled with a fluorescent marker or constitutively expressing a fluorescent protein are plated without and with macrophages/microglia on matrix-coated polycarbonate chamber inserts or embedded in a three dimensional matrix. Cell invasion is assessed by using fluorescent microscopy to image and count only invasive cells on the underside of the filter. Using these assays, several pharmacological inhibitors (JNJ-28312141, PLX3397, Gefitinib, and Semapimod), have been identified which block macrophage/microglia stimulated glioblastoma invasion.

Understanding the malignant behavior of cancer requires creating accurate models of how tumor cells interact with components of the tumor microenvironment, such as macrophages. Here we describe two methods to study glioblastoma cell interaction with tumor associated macrophages and microglia where the effect on glioblastoma invasion is assessed.

Cokultur Assays zur Untersuchung Makrophagen und Mikroglia Stimulation von Glioblastom-Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Forschung

Krebsforschung

A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of diagnosis. Metastatic RCC (mRCC) is incurable, with a median survival time of only 18 months. Immune-based interventions (e.g., interferon (IFN) and interleukin (IL)-2) induce durable responses in a fraction of mRCC patients, and multikinase inhibitors (e.g., sunitinib or sorafenib) or anti-VEGF receptor monoclonal antibodies (mAb) are largely palliative, as complete remissions are rare. Such shortcomings in current therapies for mRCC patients provide the rationale for the development of novel treatment protocols. A key component in the preclinical testing of new therapies for mRCC is a suitable animal model. Beneficial features that recapitulate the human condition include a primary renal tumor, renal tumor metastases, and an intact immune system to investigate any therapy-driven immune effector responses and the formation of tumor-induced immunosuppressive factors. This report describes an orthotopic mRCC mouse model that has all of these features. We describe an intrarenal implantation technique using the mouse renal adenocarcinoma cell line Renca, followed by the assessment of tumor growth in the kidney (primary site) and lungs (metastatic site).

Implementation of an orthotopic model of renal cell carcinoma in immunocompetent mice affords the investigator a clinically-relevant system defined by the presence of a primary renal tumor and lung metastases in the same animal. This system can be used to preclinically test a variety of treatments in vivo.

Ein Syngenetische Maus-Modell von metastasierendem Nierenzellkarzinom für Quantitative und Longitudinal Beurteilung der vorklinischen Therapien

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of ...

Immunofluorescence Microscopy of &#947;H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

DNA double-strand breaks (DSB) are serious DNA lesions. Analysis of the formation and repair of DSB is relevant in a broad spectrum of research areas including genome integrity, genotoxicity, radiation biology, aging, cancer, and drug development. In response to DSB, the histone H2AX is phosphorylated at Serine 139 in a region of several megabase pairs forming discrete nuclear foci detectable by immunofluorescence microscopy. In addition, 53BP1 (p53 binding protein 1) is another important DSB-responsive protein promoting repair of DSB by nonhomologous end-joining while preventing homologous recombination. According to the specific functions of &#947;H2AX and 53BP1, the combined analysis of &#947;H2AX and 53BP1 by immunofluorescence microscopy may be a reasonable approach for a detailed analysis of DSB. This manuscript provides a step-by-step protocol supplemented with methodical notes for performing the technique. Specifically, the influence of the cell cycle on &#947;H2AX foci patterns is demonstrated in normal fibroblasts of the cell line NHDF. Further, the value of the &#947;H2AX foci as a biomarker is depicted in x-ray irradiated lymphocytes of a healthy individual. Finally, genetic instability is investigated in CD34+ cells of a patient with acute myeloid leukemia by immunofluorescence microscopy of &#947;H2AX and 53BP1.

This manuscript provides a protocol for the analysis of DNA double-strand breaks by immunofluorescence microscopy of &#947;H2AX and 53BP1.

Immunfluoreszenz-Mikroskopie von γH2AX und 53BP1 für die Analyse der Bildung und Reparatur der DNA Double-Strand Breaks

DNA double-strand breaks (DSB) are serious DNA lesions. Analysis of the formation and repair of DSB is relevant in a broad spectrum of research areas ...

Utilization of Ultrasound Guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts

Preclinical testing of anticancer therapies relies on relevant xenograft models that mimic the innate tendencies of cancer. Advantages of standard subcutaneous flank models include procedural ease and the ability to monitor tumor progression and response without invasive imaging. Such models are often inconsistent in translational clinical trials and have limited biologically relevant characteristics with low proclivity to produce metastasis, as there is a lack of a native microenvironment. In comparison, orthotopic xenograft models at native tumor sites have been shown to mimic the tumor microenvironment and replicate important disease characteristics such as distant metastatic spread. These models often require tedious surgical procedures with prolonged anesthetic time and recovery periods. To address this, cancer researchers have recently utilized ultrasound-guided injection techniques to establish cancer xenograft models for preclinical experiments, which allows for rapid and reliable establishment of tissue-directed murine models. Ultrasound visualization also provides a noninvasive method for longitudinal assessment of tumor engraftment and growth. Here, we describe the method for ultrasound-guided injection of cancer cells, utilizing the adrenal gland for NB and renal sub capsule for ES. This minimally invasive approach overcomes tedious open surgery implantation of cancer cells in tissue-specific locations for growth and metastasis, and abates morbid recovery periods. We describe the utilization of both established cell lines and patient derived cell lines for orthotopic injection. Pre-made commercial kits are available for tumor dissociation and luciferase tagging of cells. Injection of cell suspension using image-guidance provides a minimally invasive and reproducible platform for the creation of preclinical models. This method is utilized to create reliable preclinical models for other cancers such as bladder, liver and pancreas exemplifying its untapped potential for numerous cancer models.

Here, we present a protocol to utilize ultrasound-guided injection of neuroblastoma (NB) and Ewing's sarcoma (ES) cells (established cell lines and patient-derived tumor cells) at biologically relevant sites to create reliable preclinical models for cancer research.

Nutzung von Ultraschall geführte Gewebe gerichtet zellulären Implantation für die Einrichtung der biologisch relevanten metastasiertem Tumor Xenografts

Preclinical testing of anticancer therapies relies on relevant xenograft models that mimic the innate tendencies of cancer. Advantages of standard ...

Potentiation of Anticancer Antibody Efficacy by Antineoplastic Drugs: Detection of Antibody-drug Synergism Using the Combination Index Equation

Potentiation of hostile monoclonal antibodies (mAb) by chemotherapeutic agents constitutes a valuable strategy for designing effective and safer therapy against cancer. Here we provide a protocol to identify a rational combination at the preclinical step. First, we describe a cell-based assay to assess the synergism between anticancer mAb and cytotoxic drugs, that uses the combination index equation of Chou and Talalay1. This includes the measurement of tumor cell drug- and antibody-sensitivity using an MTT assay, followed by an automated computer analysis to calculate the combination index (CI) values. CI values of &lt;1 indicate synergism between tested mAbs and cytotoxic agents1. To corroborate the in vitro findings in vivo, we further describe a method to assess the combination regimen efficacy in a xenograft tumor model. In this model, the combined regimen significantly delays tumor growth, which results in a significant extended survival in comparison to single-agent controls. Importantly, the in vivo experimentation reveals that the combination regimen is well tolerated. This protocol allows the effective evaluation of anticancer drug combinations in preclinical models and the identification of rational combination to evaluate in clinical trials.

This protocol describes how to assess synergism between an anticancer antibody and antineoplastic drugs in preclinical models by using the combination index equation of Chou and Talalay.

Potenzierung der Anti-Krebs-Antikörper-Wirksamkeit von Zytostatika: Nachweis von Antikörper-Wirkstoff-Synergismus mit der Kombination-Index-Gleichung

Potentiation of hostile monoclonal antibodies (mAb) by chemotherapeutic agents constitutes a valuable strategy for designing effective and safer therapy ...

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A zebrafish xenograft is created by implanting mammalian tumor cells into the perivitelline space of two days-post-fertilization zebrafish embryos, followed by measuring the extent of the angiogenic response observed at an experimental endpoint up to two days post-implantation. The key advantage to this method is the ability to accurately quantitate the zebrafish host angiogenic response to the graft. This enables detailed examination of the molecular mechanisms as well as the host vs tumor contribution to the angiogenic response. The xenografted embryos can be subjected to a variety of treatments, such as incubation with potential anti-angiogenesis drugs, in order to investigate strategies to inhibit tumor angiogenesis. The angiogenic response can also be live-imaged in order to examine more dynamic cellular processes. The relatively undemanding experimental technique, cheap maintenance costs of zebrafish and short experimental timeline make this model especially useful for the development of strategies to manipulate tumor angiogenesis.

The aim of this method is to generate an in vivo model of tumor angiogenesis by xenografting mammalian tumor cells into a zebrafish embryo that has fluorescently-labelled blood vessels. By imaging the xenograft and associated vessels, a quantitative measurement of the angiogenic response can be obtained.

In Vivo Bildgebung und Quantifizierung der Angiogenreaktion des Wirts bei Zebrafischtumor Xenografts

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically stable, thereby preserving molecular, genetic, and histological features, as well as heterogeneity of the original tumor. However, using these models to perform a multitude of experiments, including drug screening, is prohibitive both in terms of cost and time. Three-dimensional (3D) culture systems are widely viewed as platforms in which cancer cells retain their biological integrity through biochemical interactions, morphology, and architecture. Our team has extensive experience culturing PDX cells in vitro using 3D matrices composed of hyaluronic acid (HA). In order to separate mouse fibroblast stromal cells associated with PDXs, we use rotation culture, where stromal cells adhere to the surface of tissue culture-treated plates while dissociated PDX tumor cells float and self-associate into multicellular clusters. Also floating in the supernatant are single, often dead cells, which present a challenge in collecting viable PDX clusters for downstream encapsulation into hydrogels for 3D cell culture. In order to separate these single cells from live cell clusters, we have employed density step gradient centrifugation. The protocol described here allows for the depletion of non-viable single cells from the healthy population of cell clusters that will be used for further in vitro experimentation. In our studies, we incorporate the 3D cultures in microfluidic plates which allow for media perfusion during culture. After assessing the resultant cultures using a fluorescent image-based viability assay of purified versus non-purified cells, our results show that this additional separation step substantially reduced the number of non-viable cells from our cultures.

This protocol demonstrates methods to enable extended in vitro culture of patient-derived xenografts (PDX). One step enhances overall viability of multicellular cluster cultures in 3D hydrogels, through straightforward removal of non-viable single cells. A secondary step demonstrates best practices for PDX culture in a perfused microfluidic platform.

Verbesserte Lebensfähigkeit für Ex vivo 3D Hydrogelkulturen von patientenabgeleiteten Xenografts in einer perfused Microfluidic Platform

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the standard in the field, but zebrafish have emerged as an alternative model with several advantages, including the ability for high-throughput and low-cost drug screening. Zebrafish also allow for in vivo drug screening with large replicate numbers that were previously only obtainable with in vitro systems. The ability to rapidly perform large scale drug screens may open up the possibility for personalized medicine with rapid translation of results back to clinic. Zebrafish xenograft models could also be used to rapidly screen for actionable mutations based on tumor response to targeted therapies or to identify new anti-cancer compounds from large libraries. The current major limitation in the field has been quantifying and automating the process so that drug screens can be done on a larger scale and be less labor-intensive. We have developed a workflow for xenografting primary patient samples into zebrafish larvae and performing large scale drug screens using a fluorescence microscope equipped imaging unit and automated sampler unit. This method allows for standardization and quantification of engrafted tumor area and response to drug treatment across large numbers of zebrafish larvae. Overall, this method is advantageous over traditional cell culture drug screening as it allows for growth of tumor cells in an in vivo environment throughout drug treatment, and is more practical and cost-effective than mice for large scale in vivo drug screens.

Zebrafish xenograft models allow for high-throughput drug screening and fluorescent imaging of human cancer cells in an in vivo microenvironment. We developed a workflow for large scale, automated drug screening on patient-derived leukemia samples in zebrafish using an automated fluorescence microscope equipped imaging unit.

Arzneimittel-Screening von Primärpatienten abgeleitetTumor Xenografts in Zebrafischen

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly visualizing the response to anti-cancer therapies (chemo, radiotherapy, and biologicals), angiogenesis and metastasis with single cell resolution, places the zebrafish xenograft model as a top choice to develop preclinical studies.

The zebrafish larval xenograft assay presents several experimental advantages compared to other models, but probably the most striking is the reduction of size scale and consequently time. This reduction of scale allows single cell imaging, the use of a relatively low number of human cells (compatible with biopsies), medium-high-throughput drug screenings, but most importantly enables a significant reduction of the time of the assay. All these advantages make the zebrafish xenograft assay extremely attractive for future personalized medicine applications.

Many zebrafish xenograft protocols have been developed with a wide diversity of human tumors; however, a general and standardized protocol to efficiently generate zebrafish larval xenografts is still lacking. Here we provide a step-by-step protocol, with tips to generate xenografts and guidelines for tumor behavior analysis, whole-mount immunofluorescence, and confocal imaging quantification.

Here, we provide a step-by-step protocol, with tips to generate xenografts and guidelines for tumor behavior analysis, whole-mount immunofluorescence, and confocal imaging quantification.

Generation von Zebrafischen Larval Xenografts und Tumorverhaltensanalyse

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly ...

Monitoring Breast Cancer Growth and Metastatic Colony Formation in Mice using Bioluminescence

Breast cancer is a frequent heterogeneous malignancy and the second leading cause of mortality in women, mainly due to distant organ metastasis. Several animal models have been generated, including the widely used orthotopic mouse models, where cancer cells are injected into the mammary fat pad. However, these models cannot help monitor tumor growth kinetics and metastatic colonization. Cutting-edge tools to monitor cancer cells in real time in mice will significantly advance the understanding of tumor biology. 
Here, breast cancer cell lines stably expressing luciferase and green fluorescent protein (GFP) were established. Specifically, this technique contains two sequential steps initiated by measuring the luciferase activity in vitro and followed by the implantation of the cancer cells into mammary fat pads of nonobese diabetic-severe combined immunodeficiency (NOD-SCID) mice. After the injection, both the tumor growth and metastatic colonization are monitored in real time by the noninvasive bioluminescence imaging system. Then, the quantification of GFP-expressing metastases in the lungs will be examined by fluorescence microscopy to validate the observed bioluminescence results. This sophisticated system combining luciferase and fluorescence-based detection tools evaluates cancer metastasis in vivo, which has great potential for use in breast cancer therapeutics and disease management.

Here, we describe a noninvasive monitoring method involving luciferase and green fluorescent protein expression in various breast cancer cell lines. This protocol provides a technique to monitor tumor formation and metastatic colonization in real time in mice.

Überwachung des Brustkrebswachstums und der metastasierenden Koloniebildung bei Mäusen mittels Biolumineszenz

Breast cancer is a frequent heterogeneous malignancy and the second leading cause of mortality in women, mainly due to distant organ metastasis. Several ...