Diese Methode beschreibt eine Technik zur Untersuchung des Membranumbaus während der Migration von Neutrophilen beim lebenden Tier mittels intravitaler subzellulärer Mikroskopie. Dieses Protokoll bietet einen einzigartigen Ansatz, um die Membrandynamik während der Tiermigration unter physikalischen Bedingungen zu untersuchen und die Mikroumgebung des Gewebes zu entschlüsseln. Diese Technik kann so angepasst werden, dass sie den Membranumbau und das Zytoskelett, die dynamische Organrepositionierung und den Membrantransport in verschiedenen Zelltypen und wandernden Zellen berücksichtigt.
Zu Beginn fügen Sie den grünen Fluoreszenzfarbstoff zur Neutrophilensuspension hinzu, die von der Wildtyp-Maus in 1,5 Millilitern BSA-beschichtetem Röhrchen gereinigt wurde. 30 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren in einem Röhrchenrotator inkubieren. Geben Sie drei Waschgänge mit HBSS, gefolgt von einer Zentrifugation bei 400 mal G bei Raumtemperatur für fünf Minuten und resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter Hanks'Balanced Salt Solution.
Geben Sie diese Suspension in das BSA-beschichtete Rohr in einem Rohrrotator unter leichtem Rühren bis zum Injektionsvorgang. Vor der Injektion resuspendieren Sie das Zellpellet in Kochsalzlösung, um eine Dichte von 2 bis 5 Millionen Zellen pro 20 Mikroliter zu erreichen. Bringen Sie das betäubte Tier auf ein Wärmekissen mit 37 Grad Celsius, um seine Körpertemperatur zu halten.
Nachdem Sie den Pfotenentzugsreflex getestet haben, entfernen Sie die Haare mit einem feinen Trimmer aus dem Ohr, um die Bildqualität zu optimieren. Legen Sie das Tier auf die Seite, halten Sie den Rand des Ohrs fest und glätten Sie es mit dem chirurgischen Klebeband entlang des Wärmekissens, füllen Sie dann eine Spritze mit einer 33-Gauge-Nadel mit der Neutrophilensuspension und montieren Sie sie auf einen Mikromanipulator. Bewegen Sie die Nadel vorsichtig in Richtung Ohr und stechen Sie langsam in die Haut.
Sobald sich die Nadel in der Haut befindet, drücken Sie langsam auf den Kolben und geben Sie zwei bis drei Mikroliter Zellsuspension ab. Nachdem Sie die Injektion für zwei bis drei verschiedene Bereiche des Ohrs vorsichtig wiederholt haben, entfernen Sie vorsichtig das chirurgische Klebeband und lassen Sie das Tier unter Aufsicht wieder zu Bewusstsein kommen. Lassen Sie das Tier vor der Bildgebung eine Stunde ruhen, damit sich das Gewebe und die Zellen von der Injektion erholen können.
Stellen Sie sicher, dass das Mikroskop eingeschaltet ist und der Tisch und die Linsen auf 37 Grad Celsius vorgeheizt sind, bevor Sie das betäubte Tier auf den Mikroskoptisch legen. Decken Sie das Loch in der Bühne mit einem Glasdeckglas ab. Bewegen Sie das betäubte Tier vorsichtig auf die Bühne.
Wenn die Bildgebung länger als eine Stunde geplant ist, tragen Sie die Augensalbe auf und sichern Sie das auf Flügelinfusionen basierende Perfusionssystem. Geben Sie einen Tropfen Kochsalzlösung auf die Mitte des Deckglases und legen Sie das injizierte Ohr der Neutrophilen darauf. Glätten Sie das Ohr vorsichtig mit einem sterilen Wattestäbchen in der Mitte des Deckglases, um Lufteinschlüsse zu entfernen.
Sichern Sie das Ohr, indem Sie einen Holzstab vorsichtig an die Seite des Ohrs drücken, näher an den Kopf des Tieres, und ihn mit Klebeband verriegeln. Suchen Sie dann mit dem Mikroskop-Okular einen Interessenbereich und wechseln Sie in den Multiphotonen-Erfassungsmodus. Stellen Sie die Wellenlänge der Laseranregung auf 900 bis 930 Nanometer ein, um die gleichzeitige Erfassung von grünem Fluoreszenzfarbstoff, mTomato und Kollagen-I zu ermöglichen.
Stellen Sie dann die entsprechenden Spiegel- und Filterkombinationen auf die Detektoren ein, um das emittierte Licht zu sammeln. Bestimmen Sie die Einstellung, die für die Hardwarekonfiguration am besten geeignet ist. Auch wenn migrierende Zellen in Intervallen von 30 Sekunden bis zu einer Minute verfolgt werden können, bilden subzelluläre Ereignisse mit einer höheren Geschwindigkeit von mindestens weniger als zehn Sekunden ab.
Verwenden Sie bei der klassischen intravitalen Mikroskopie ein 30-faches Objektiv und einen Galvo-Scanner mit einer Bildgröße von 512 x 512 Pixeln, um die Zellmigration zu verfolgen und das Gewebe der Wirtsmaus zu untersuchen, und stellen Sie die Verschiebung der Z-Achse mit dem motorisierten Tisch mit einer Schrittweite von zwei Mikrometern ein, um die Abbildung eines 30 Mikrometer tiefen Volumens alle 30 Sekunden zu ermöglichen. Verwenden Sie bei der intravitalen subzellulären Mikroskopie ein 40-faches Objektiv und einen Resonanzscanner mit dreifacher Mittelwertbildung, um den hochdynamischen Membranumbau mit höherer Vergrößerung und Auflösung abzubilden. Stellen Sie auch die Verschiebung der Z-Achse mit einem Piezo mit einer Schrittweite von einem Mikrometer ein, der alle vier bis fünf Sekunden eine 20 Mikrometer tiefe Volumenabbildung ermöglicht.
Induzieren Sie eine sterile Laserverletzung, um die Migration von Neutrophilen auszulösen, indem Sie einen Hochleistungs-Anregungslaser 10 Sekunden lang auf einen schmalen Bereich von 20 x 20 Mikrometern fokussieren. Identifizieren Sie laserinduzierte Verletzungen durch ihre starken Autofluoreszenzsignale, die in allen Kanälen auftreten, und durch die daraus resultierende Veränderung der Kollagenanordnung. Speichern Sie die Daten am Ende des Experiments für weitere Analysen.
Die Empfängermaus ermöglichte die Visualisierung struktureller Merkmale im Ohrgewebe wie Blutgefäße, ansässige Zellen und Haarfollikel über einen auf Intravitalmikroskopie basierenden Ansatz. Die laserinduzierten Verletzungen waren aufgrund ihrer starken Autofluoreszenz, die in allen Kanälen nachgewiesen wurde, und aufgrund der Veränderungen der Kollagenanordnung leicht sichtbar. Eine vollständige Ansicht der dreidimensionalen Architektur der Haut und der Lokalisation der injizierten Neutrophilen zeigt einen Z-Stapel der Haut von den äußeren zu den inneren Schichten IN einem dreidimensionalen Volumen-Rendering.
Die Zeitrafferbildgebung zeigte, wie die Neutrophilen die Ohrhaut abtasteten und mit der intrazellulären Matrix und dem Wirtsgewebe interagierten. Mit Hilfe der intravitalen subzellulären Mikroskopie werden der dynamische Umbau der Plasmamembran während der Migration, die Bildung von Membranvorsprüngen an der Vorderkante und die Retraktion der Rückseite der Zellen deutlich sichtbar gemacht. Die Zeitraffersequenzen zeigen die Komplexität der Wechselwirkungen mit der intrazellulären Matrix.
Die lokale Dynamik der Plasmamembran wurde mit Hilfe einer Algorithmus-Pipeline analysiert, die auf der Identifizierung von 100 Grenzpunkten unter der Zelloberfläche basiert. Die Änderungen der lokalen Krümmung und der durch Plasmamembranvorsprünge unterstrichenen Fläche wurden für jeden Grenzpunkt berechnet und für jeden Zeitrahmen als Kymographen berichtet. Sowohl die Vorder- als auch die Rückseite der Zellen behalten eine höhere Krümmung bei als die Seite der Zellen.
Negative Bereichsänderungen sind an der Rückseite der Zellen deutlicher als an der Vorderkante, wo die positiven Bereichsänderungen stärker ausgeprägt sind. Nach der Bildgebung kann Gewebe entnommen, fixiert und für die Färbung aufbereitet werden, um das gewünschte Ziel weiter zu bewerten und die Mechanismen aufzuklären. Dieses Verfahren zur Abbildung der Membrandynamik kann so angepasst werden, dass es umfassendere zellbiologische Fragen in verschiedenen Zelltypen und wandernden Zellen in ihrer jeweiligen Umgebung beantwortet.
