Diese Arbeit wurde durch ein Promotionsstipendium an der Universität von Antwerpen nach VA unterstützt; ein Promotionsstipendium der flämischen Science Foundation (FWO, 11ZI916N) zu KS; Projektzuschüsse von der FWO (G0D0514N); eine konzertierte Forschungstätigkeit (GOA) Forschungsstipendium: &quot;Ein systembiologischer Ansatz der Blatt Morphogenese&quot; von der Forschungsgemeinschaft der Universität Antwerpen; und das Interuniversitäre Anziehungsschwerpunkte (IUAP VII / 29, MARS), &quot;Mais und Arabidopsis Wurzel und Sprosswachstum&quot; von der Föderale Wissenschaftspolitik (BELSPO) zu GTSB Han Asard, Bulelani L. Sizani und Hamada Abdelgawad alle zum Video beigetragen .

HINWEIS: Das folgende Protokoll für kinematische Analyse gilt nur für Blätter im stationären Zustand Wachstum. Dies impliziert eine stabile Blattdehnungsrate und räumlichen Muster der Zellenlänge und Expansion in einem Blatt während eines Zeitraums von mehreren Tagen 6. 1. Pflanzenwachstum und die Messungen der Blattdehnungsrate (LER) <ol><li> Wählen Sie ein Blatt im Steady-State-Wachstum und eine Entwicklungsphase von Interesse. HINWEIS: Es gibt einen Unterschied zwischen Steady-State-Wachstum und repetitive Wachstum, das auf aufeinanderfolgenden Blättern auf der gleichen Achse ähnliche räumliche Muster impliziert. Während der frühen Stadien der Sämlingwachstum wachsen sukzessive Blätter typischerweise immer schneller durch die zunehmende Größe der Wachstumszone 7. Obwohl einige höhere Blattpositionen ein ähnliches Wachstumsmuster 8 haben kann, ist dies eine Übergangsphase , die durch Behandlungen zu untersuch beeinträchtigt werden kann. Es ist daher wichtig zu vergleichen Linien und tr<html> eatments streng auf der gleichen Blattposition, auch wenn es zu einer anderen Zeit entwickeln kann. Selbst bei einer konstanten Dehnungsrate, ist die Wachstumsrate Profil nicht notwendigerweise gleich in verschiedenen Entwicklungsstadien. Daher ist es wichtig , Blätter an der gleichen Entwicklungsstufe 8 zu analysieren, in der Regel durch die Anzahl der Tage nach dem Auflaufen definiert. </li><li> Um eine vollständige kinematische Analyse des Blattwachstums in Monokotyledonen zuführen, wachsen mindestens 15 Pflanzen für jede Behandlung und Genotyp unter kontrollierten Bedingungen in einem Wachstumsraum. </li><li> Zu der Zeit , das Blatt von Interesse erscheint (Austritt aus dem Quirl der umliegenden Blätter), starten Sie die Länge der Blattmess täglich mit einem Lineal , bis das Blatt vollständig erweitert ist (Abbildung 1 i). Blattlänge bedeutet die Länge vom Bodenniveau bis zur Spitze des Blattes. Achten Sie darauf, das Blatt zu brechen oder beschädigt werden, da dies möglicherweise sein Wachstum zu verändern. </li></ol>re 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54887 / 54887fig1.jpg &quot;/&gt; Abb . 1: Schematische Darstellung einer kinematischen Analyse von Maisblättern Das Blatt von Interesse wird mit einem Lineal gemessen an drei aufeinanderfolgenden Tagen das Blatt Dehnungsrate (LER) zu berechnen. Danach wird das Blatt geerntet und drei Zentimeter Segment für die Bestimmung der Meristem-Größe verwendet. Dies wird durch Messen der Länge von der Basis bis zu dem distalsten mitotische Figur nach DAPI-Färbung durchgeführt. (A) Beispiele für proliferative Mitosen und (B) gestaltende Mitosen. Die ersten elf Zentimeter von der Blattunterseite auf der anderen Seite der Mitte Vene verwendet 1001 Zentimeter Segmente für die Zelllängenmessungen zu schneiden. Diese Messungen bilden die Grundlage für die Erstellung der Zellenlänge Profil, das die reife Zelllänge (l mat) und die Länge der Zellen , so dass die Meristem (l div) zu bestimmen dient. Das <em&gt; LER und l Matte verwendet , um die Zellproduktionsrate (P) zu berechnen, während l div und L mer verwendet , um die Anzahl der Zellen im Meristem (N - mer) zu berechnen. Wiederum P und N mer verwendet , um die durchschnittliche Zellenteilungsrate (D) zu berechnen, die die Umkehrung der Zellzyklusdauer (T c). Pfeile in der gleichen Farbe zeigen Parameter, die die Parameter folgende auf diese Pfeile werden verwendet, um zu berechnen. Maßstabsbalken = 40 um. Römische Zahlen werden verwendet , um bestimmte experimentelle Verfahren in der beschriebenen Protokoll zu beziehen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54887/54887fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54887/54887fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 2. Ernte <ol><li> In der Entwicklungsphase von Interesse (zB, am dritten Tag nach dem Schlüpfen), wählen Sie mindestens fünf Vertreter pMittelführerinnen aus dem Ansatz, auf dem die kinematische Analyse durchzuführen. Wodurch der Rest der Pflanzen messen, wie in Schritt 1.3 erläutert die endgültige Blattlänge zu bestimmen. </li><li> Schneiden Sie das oberirdische Teil der Pflanze. Damit die meristematic Teil intakt, schneiden Sie so nah wie möglich an die Wurzeln (Abbildung 1II). </li><li> Ausgehend von den äußeren Blättern, entfernen Sie alle Blätter auf dem Blatt von Interesse, indem sie sanft eins nach dem anderen Abrollen. Entfernen Sie ggf. ein paar zusätzliche Millimeter von der Basis, um die Blätter zu lösen. Entfernen Sie auch die Spitze und kleine Blätter durch die Blatt von Interesse (Abbildung 1III) eingeschlossen. </li><li> Schneiden Sie ein 3 cm-Segment, von der Basis auf einer Seite der mittleren Ader beginnen, und bewahren Sie sie in einem 1,5 ml-Röhrchen mit 3 gefüllt: 1 (v: v) absolutem Ethanol: Essigsäure-Lösung (ACHTUNG: Handschuhe tragen) bei 4 ° C für 24 Stunden bis zu mehreren Monaten (Abb 1IV). Dieses Segment wird später verwendet werden, um die Länge des Meristem zu bestimmen. </li><li> Von demandere Seite der Vene, ein 11 cm - Segment von der Basis (1 v) geschnitten und in einem 15 ml Röhrchen mit absolutem Ethanol bei 4 ° C für mindestens 6 h gefüllten Pigmente (1 vi) zu entfernen. HINWEIS: Später, wenn Sie nur die ersten 10 cm der Zellenlänge Profil (siehe Diskussion) zu bestimmen. </li><li> Erneuern Sie die absolute Ethanol für eine weitere Runde von mindestens 24 Stunden bei 4 ° C Reinigung (Abbildung 1vi). </li><li> Schließlich ersetzen die absolute Ethanol mit reinem Milchsäure (ACHTUNG: Handschuhe tragen) für die Reinigung und Lagerung bei 4 ° C für 24 Stunden oder bis zur weiteren Verwendung (Abbildung 1vi). </li></ol> 3. Meristem Längenmessungen <ol><li> Bereiten Sie eine Spülung Puffer, der 50 mM Natriumchlorid (NaCl), 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA; ACHTUNG: Handschuhe tragen) und 10 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethan-Salzsäure (TRIS-HCl, pH 7). </li><li> Nehmen Sie die 3 cm Segment aus dem Abschnitt 2.4 und soak es in dem Puffer für 20 min (Abbildung 1vii). </li><li> Während des Wartens, verwenden Sie den Spülpuffer ein 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Färbelösung von 1 ug / ml herzustellen, es auf Eis und im Dunkeln zu halten. </li><li> Stain die Kerne durch das meristem Segment für 2-5 min in der DAPI-Färbelösung platzieren. Die Arbeiten auf dem Eis und in der Dunkelheit (Abbildung 1vii). </li><li> Prüfen Sie, ob Fluoreszenzsignal durch schnell das Segment auf einem Mikroskopie Glasmontage und Abdecken mit einem Deckglas. Die epidermalen Zellen sollten Fluoreszenz zeigen, während die zugrunde liegenden Zellschichten sollten nicht. </li><li> Wenn die Färbung nicht ausreichend ist, legte das Segment wieder in den DAPI-Färbung Lösung für einige zusätzliche Minuten. </li><li> Um die Färbung zu stoppen, montieren Sie die Segmente in einem Tropfen Pufferspülung auf einer Mikroskopie Objektträger und Deck mit einem Deckglas. </li><li> Verwenden Sie ein Mikroskop mit UV-Fluoreszenz bei einer 20-facher Vergrößerung ausgestattet, so dass für die Visualisierung von rund 1.000 epidermal-Zellen auf einmal. Blättern Sie im gesamten Segment und sucht proliferative Mitosefiguren (Metaphase, Anaphase, Telophase und Zytokinese), aber vermeiden prägenden Zellteilung der Entwicklung Stomata (Abbildung 1viii) 9. Definieren Sie, wo die am weitesten distal gelegene Mitose befindet. </li><li> Bestimmen die Länge des Meristem durch den Abstand zwischen der Basis des Blattes gemessen wird und die distalste epidermal mitotische Figur. Verwenden Sie eine Bildanalyse - Software (zB ImageJ) über die volle Länge des Bildrahmens zu messen. <ol><li> Zählen Sie die Anzahl der Bilder , die die volle meristem Länge (von der Blattbasis zu dem am weitesten entfernten Mitose) und multiplizieren Sie diese Zahl durch die Länge eines Rahmens decken die gesamte meristem Länge (Abbildung 1ix) zu erhalten. </li></ol></li></ol> 4. Zell Länge Profil <ol><li> Nehmen Sie das Segment, das in Milchsäure (Schritt 2.5) und vorsichtig auf der Bank gespeichert. Schneiden Sie die Segmente Witzha Skalpell in 10 Segmente von 1 cm jeweils (Abbildung 1x). </li><li> Montieren der aufeinanderfolgenden Blattsegmente auf einem Mikroskopie Schieber in einem kleinen Tropfen Milchsäure. Stellen Sie sicher, konsequent auf einen Blick auf die adaxial oder abaxial Seite nach oben. Im Prinzip gibt es keine Präferenz für eine bestimmte Seite. </li><li> Verwenden Sie ein Mikroskop mit differentiellen Interferenzkontrast (DIC) Optik ausgestattet, um die Segmente zu analysieren, von der Blattbasis beginnen. Messung mit einer Bildanalysesoftware, die Länge von mindestens 20 replicate Epidermiszellen in Dateien unmittelbar neben der Stomata Dateien, um konsequent die gleichen Zelltyp auszuwählen. <ol><li> Tun Sie dies in gleich beabstandeten Positionen entlang jedes der Segmente (4 Positionen pro Segment ausreichend), und stellen Sie sicher , die entsprechende Position für jede Messung im gesamten Blatt (Abbildung 1 xi) zu notieren. </li></ol></li><li> Bestimmen Sie die mittlere Zellenlänge an jedem mm entlang der Blattachse durch eine lokale Polynom Glättung p mitERFAHREN, implementiert in einem R-Skript (Abbildung 1xii; Ergänzende Datei 1). HINWEIS: Die R-Skript stellt eine Reihe von Daten mit Glättung erhöht. Die erforderliche Menge der Glättung ist etwas willkürlich und sollte idealerweise nur das lokale Rauschen zu entfernen, aber nicht die gesamte Kurve beeinflussen. Sicherstellen, dass die gleiche Menge an Glättung für alle Proben in einem Experiment zu verwenden. </li><li> Der Mittelwert der Zellenlänge an jeder Position zwischen den Pflanzen und berechnen Sie die Standardfehler eine Zellenlänge Profil entlang der Blattachse zu schaffen. </li></ol> 5. Die Berechnung der kinematischen Parameter (siehe Zusatz Datei 2) <ol><li> Berechne die LER , indem die Änderung in der Blattlänge zwischen zwei aufeinanderfolgenden Zeitpunkten nehmen (beispielsweise 24 Stunden, wie in Schritt 1.3) , und es durch das Zeitintervall dividiert wird . </li><li> Berechnen der Länge der Wachstumszone (L gz) entsprechend der Position distal von der Basis , wo Zellen 95% ihrer reifen ce erreichenll Länge auf der Zelllängenprofil geglättet. <ol><li> Nehmen Sie für jede Position auf der geglättete Zellenlänge Profil 95% des Durchschnitts aller Zellenlängen nach dieser Position (Abbildung 2). </li><li> Vergleichen Sie die geglättete Zellenlängen (Schritt 4.4) mit der berechneten 95% Zelllänge in jeder Position. Ausgehend von der Basis des Blattes endet die Wachstumszone an der Position , wo die tatsächliche Zellenlänge entspricht 95% der folgenden Zelllängen (2; siehe Zusatz Data 2). </li></ol></li></ol><img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54887/54887fig2.jpg" /> Abbildung 2:. Die Bestimmung des Endes der Wachstumszone Meristem: An der Stelle , mit einem roten Stern angegeben, ist die tatsächliche Zellengröße von weniger als 95% (rot gestrichelte Linie) der durchschnittlichen Zellgröße aller in dieser Position folgende Zellen (rot solide Linie). Das Ende der Wachstumszone (L gz, angegeben mit ablue Sterne) liegt dort, wo 95% (gestrichelte blaue Linie) der durchschnittliche Zellgröße aller Zellen im Anschluss an diese Position (durchgezogene blaue Linie) ist gleich der tatsächlichen Zellgröße. Abteilung Zone (D), Dehnungszone (E) und reifen Zone (M). Eine gestrichelte Pfeile , um die Konvergenz zwischen der lokalen Größe und 95% der mittleren Größe über den distalen Teil des Blattes zeigen , wenn sie von den basalen Positionen an der Spitze des Blattes bewegt. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54887/54887fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54887/54887fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol start="3"><li> Berechnen der Länge der Dehnungszone (L EL) als die Differenz zwischen der Länge der Wachstumszone (L gz) und Meristem Größe (L mer; bestimmt in Schritt 3). </li><li> Berechnen Sie die reifen Zelllänge (l mat) als auch die durchschnittliche Zellenlänge in der reifen Zone. </li><li> Teilen Sie die LER von l Matte zu erhalten , dieZellproduktionsrate (P). </li><li> Berechnen der Anzahl von Zellen in der Dehnungszone (N el) als die Differenz zwischen N und N gz mer. Die Anzahl der Zellen in dem Meristem (N mer) gleich der Gesamtzahl der in den Intervallen zu Meristem entsprechenden befindlichen Zellen. Die Anzahl der Zellen in der Wachstumszone (N gz) gleich der Gesamtzahl der in den Intervallen zu der Wachstumszone entsprechenden befindlichen Zellen. </li><li> Berechnen Sie die durchschnittliche Zellteilungsrate (D) als P / N mer. Die Zellzyklusdauer (T c) ist gleich ln (2) / D. </li><li> Berechnen Sie die Zeit in der Dehnungszone (T el) durch Teilen N el durch P. Die Zeit , in der Teilungszone gleich log 2 (N - mer) * T c. Die Länge der Zellen Verlassen des meristem (l div)gleich der Zelle aus dem geglätteten Zellenlänge Profil am Ende der Meristem Länge. </li><li> Berechnen Sie die durchschnittliche Zellexpansionsrate (R el) unter Verwendung folgender Formel: ln (l Matte) -ln (l div)] / T el. </li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Eine vollständige kinematische Analyse auf Maisblättern ermöglicht die Bestimmung der zellulären Basis des Blattwachstums und ermöglicht die Gestaltung effizienter Probenahmestrategien. Obwohl das Protokoll relativ einfach ist, ist eine gewisse Vorsicht in den folgenden kritischen Schritte empfohlen: (1) Es ist wichtig, die jüngeren, geschlossenen Blätter zu lösen (2.3 Schritt), ohne die meristem zu beschädigen, da meristem Längenbestimmung (Schritt 3) erfordert die vollständige meristem vorhanden sein. Einig...

Wachstumsanalyse hängt von einer Reihe von Werkzeugen, die von Pflanzenwissenschaftler häufig verwendet werden, Genotyp bestimmt Wachstumsunterschiede und / oder phänotypische Reaktionen auf Umweltfaktoren zu beschreiben. Dazu gehören Größe und Gewichtsmessungen der gesamten Anlage oder ein Organ und Berechnungen der Wachstumsraten, die zugrunde liegenden Mechanismen des Wachstums zu erkunden. Organwachstum wird durch Zellteilung und Expansion auf der zellulären Ebene bestimmt. Daher analysiert die Quantifizierung dieser beiden Prozesse in Wachstum einschließlich ist der Schlüssel zum Verständnis der Unterschiede in Vollorganwachstum 1. Folglich ist es wichtig, eine geeignete Methodik haben zellulären Wachstumsparameter zu bestimmen, der relativ leicht von nicht spezialisierten Labors zu verwenden. Kinematic Analyse wurde bereits als Ansatz etabliert 2 einen leistungsstarken Rahmen für die Entwicklung von Organwachstumsmodelle bieten. Die Technik wurde für lineare Systeme optimiert,wie Arabidopsis thaliana Wurzeln und monokotyle Blätter, sondern auch für nichtlineare Systeme, wie dikotyle Blätter 3. Heute wird diese Methode immer mehr, wie genetische Studie verwendet wird, hormonelle, entwicklungs und Umweltfaktoren beeinflussen die Zellteilung und die Expansion in verschiedenen Organen (Tabelle 1). Darüber hinaus bietet sie auch einen Rahmen zelluläre Prozesse auf die ihnen zugrunde liegenden biochemischen, molekularen und physiologischen Bestimmungen (Tabelle 2) zu verbinden, obwohl Einschränkungen können durch Organgröße und räumliche Organisation für Techniken , die höhere Mengen an Pflanzenmaterial erfordern auferlegt werden (zB Metaboliten Messungen, Proteomics, etc.). Monokotylen Blätter, wie beispielsweise Mais (Zea mays) Blatt-, für lineare Systeme , in denen Zellen von der Basis des Blattes gegen die Spitze zu bewegen, der Reihe nach durch die Meristem und Dehnungszone Leiten des reifen zu erreichenZone. Dies macht es zu einem idealen Modellsystem für quantitative Untersuchungen der räumlichen Muster des Wachstums 4. Darüber hinaus haben Maisblätter große Wachstumszonen (Meristem und Dehnungszone über mehrere Zentimeter 5) und in anderen Organisationsebenen Möglichkeiten für Studien. Dies ermöglicht die Untersuchung der (vermeintlichen) Regulationsmechanismen der Zellteilung steuern und Expansion, durch kinematische Analyse durch eine Reihe von molekularen Techniken quantifiziert, physiologische Messungen und Zellbiologie Ansätze (Tabelle 2). Hier stellen wir ein Protokoll für eine kinematische Analyse in monokotylen Blätter durchführt. Zuerst wird erklärt, wie eine richtige Analyse der sowohl die Zellteilung und Zell Dehnung als Funktion der Position längs der Blattachse zu leiten und wie kinematischen Parameter zu berechnen. Zweitens zeigen wir auch, wie diese als Grundlage für die Stichprobenplan verwendet werden können. Hier diskutieren wir zwei Fälle: hochauflösende Abtastung eind konzentriert Probenahme, verbesserte Dateninterpretation und die Einsparung von Zeit / Geld ermöglicht, respectively. Tabelle 1 Übersicht der kinematischen Analysen Methoden zur Quantifizierung der Zellteilung und Expansion in verschiedenen Organen. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Organ </td><td> Referenz </td></tr><tr><td> monokotylen Blätter </td><td> 16, 20, 21, 22 </td></tr><tr><td> Wurzelspitzen </td><td> 2, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 </td></tr><tr><td> dikotylen Blätter </td><td> 21, 30, 31 </td></tr><tr><td> Sprossapikalmeristem </td><td> 32 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1 Übersicht der kinematischen Analysen Methoden zur Quantifizierung der Zellteilung und Expansion in verschiedenen Organen. Tabelle 2 Zusammenhang zwischen zellulärer Prozesse quantifiziert durch die kinematische Analyse auf ihre Regulation auf molekularer Ebene. Verweise auf verschiedene Studien , die die Quantifizierung von zellulären Prozessen zu den Ergebnissen von biochemischen und molekularen Assays in verschiedenen Spezies und Organen. Xyloglucan endotransglucosylase (XET), Malondialdehyd (MDA), Cyclin-abhängigen Kinasen (CDK). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54887/54887table2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54887/54887table2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1670">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Pots</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td style="width:813px;">We use pots with the following measueres, but can be different depending on the treatment/study : bottom diameter: 11cm, opening diameter: 15 cm, height: 12 cm. We grow one maize plant per pot.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Planting substrate</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td>We use potting medium (Jiffy, The Netherlands), but other substrates can be used, depending on treatment/study.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Ruler</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td>An extension ruler that covers at least 1,5 meters is needed to measure the final leaf length of the plants.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Seeds&#160;</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">NA</td>
			<td>Seeds can be ordered from a breeder.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Scalpel</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td style="width:813px;">The scalpel is used during leaf harvesting to detach the leaf of interest from its surrounding leaves and right after harvesting to cut a proper sample for cell length and meristem length measurements.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">15 ml falcon tubes</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td style="width:813px;">The 15 ml falcon tubes are used for storing samples used for cell length measurements during sample clearing with absolute ethanol and lactic acid.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Eppendorf tubes</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td style="width:813px;">The eppendorf tubes are used for storing samples used for meristem length measurements in ethanol:acetic acid 3:1 (v:v) solution.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Gloves</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td>Latex gloves, which protect against corrosive reagents.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td style="width:813px;">CAUTION: Corrosive to metals, category 1 Skin corrosion, categories 1A,1B,1C Serious eye damage, category 1; Flammable liquids, categories 1,2,3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Absolute ethanol</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td style="width:813px;">CAUTION: Hazardous in case of skin contact (irritant), of eye contact (irritant), of inhalation. Slightly hazardous in case of skin contact (permeator), of ingestion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Lactic acid &#62;98%</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td>CAUTION: Corrosive to metals, category 1 Skin corrosion, categories 1A,1B,1C Serious eye damage, category 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td style="width:813px;">CAUTION: Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), category 4 Skin irritation, category 2 Eye irritation, category 2 Skin sensitisation, category 1 Specific Target Organ Toxicity &#8211; Single exposure, category 3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride (Tris-HCl)</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td style="width:813px;">This material can be an irritant, contact with eyes and skin should be avoided. Inhalation of dust may be irritating to the respiratory tract.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">4&#8242;,6-Diamidine-2&#8242;-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td style="width:813px;">Cell permeable fluorescent minor groove-binding probe for DNA. Causes skin irritation. May cause an allergic skin reaction. May cause respiratory irritation.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Ice</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">NA</td>
			<td>The DAPI solution has to be kept on ice.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Fluorescent microscope</td>
			<td>AxioScope A1, Axiocam ICm1 from Zeiss or other</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td>Any fluorescent microscope can be used for determining meristem length.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Microscopic slide</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Cover glass</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Tweezers</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td style="width:813px;">Tweezers are needed for unfolding the rolled maize leaf right after harvesting in order to cut a proper sample for cell length and meristem length measurements.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Image-analysis software</td>
			<td>Axiovision (Release 4.8) from Zeiss</td>
			<td style="width:209px;">NA</td>
			<td style="width:813px;">The software can be downloaded at: http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/axiovision.html. Other softwares such as ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) could be used as well.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Microscope equipped with DIC</td>
			<td>AxioScope A1, Axiocam ICm1 from Zeiss or other</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td>Any&#160; microscope, equipped with differential interference contrast (DIC) can be used to measure cell lengths.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">R statistical analysis software</td>
			<td>R Foundation for Statistical Computing</td>
			<td style="width:209px;">NA</td>
			<td>Open source; Could be downloaded at https://www.r-project.org/</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:315px;">R script</td>
			<td style="width:333px;">NA</td>
			<td style="width:209px;">NA</td>
			<td style="width:813px;">We use the kernel smoothing function locpoly of the Kern Smooth package (Wand MP, Jones MC.&#160; Kernel Smoothing: Chapman &#38; Hall/CRC (1995)). The script is available for Mac and Windows upon inquire with the corresponding author. We have versions for Mac and Windows.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

kinematic analysis of cell division and expansion: quantifying the cellular basis of growth and sampling developmental zones in zea mays leaves

Growth analyses are often used in plant science to investigate contrasting genotypes and the effect of environmental conditions. The cellular aspect of these analyses is of crucial importance, because growth is driven by cell division and cell elongation. Kinematic analysis represents a methodology to quantify these two processes. Moreover, this technique is easy to use in non-specialized laboratories. Here, we present a protocol for performing a kinematic analysis in monocotyledonous maize (Zea mays) leaves. Two aspects are presented: (1) the quantification of cell division and expansion parameters, and (2) the determination of the location of the developmental zones. This could serve as a basis for sampling design and/or could be useful for data interpretation of biochemical and molecular measurements with high spatial resolution in the leaf growth zone. The growth zone of maize leaves is harvested during steady-state growth. Individual leaves are used for meristem length determination using a DAPI stain and cell-length profiles using DIC microscopy. The protocol is suited for emerged monocotyledonous leaves harvested during steady-state growth, with growth zones spanning at least several centimeters. To improve the understanding of plant growth regulation, data on growth and molecular studies must be combined. Therefore, an important advantage of kinematic analysis is the possibility to correlate changes at the molecular level to well-defined stages of cellular development. Furthermore, it allows for a more focused sampling of specified developmental stages, which is useful in case of limited budget or time.

Hier zeigen wir einen Vergleich zwischen gut bewässerten Pflanzen (Kontrolle, 54% Wassergehalt des Bodens, (SWC)) und Pflanzen ausgesetzt Dürre Stressbedingungen (Dürre, 34% SWC) in Bezug auf ihre Blattwachstum. Alle Pflanzen wurden in einer Wachstumskammer unter kontrollierten Bedingungen (16 Stunden Tag / 8 h Nacht, 25 ° C / 18 ° C Tag / Nacht, 300-400 &amp; mgr; Em gewachsen -2 s -1 photosynthetisch aktive Strahlung (PAR). Die Trockenheit bis die richtige SW...

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Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

Quantifying cell division and expansion is of crucial importance to the understanding of whole-plant growth. Here, we present a protocol to calculate cellular parameters determining maize leaf growth rates and highlight the use of these data for investigating molecular growth regulatory mechanisms by directing developmental stage-specific sampling strategies.

Kinematische Analyse der Zellteilung und Expansion: Die Quantifizierung der zellulären Grundlagen der Wachstums- und Sampling Entwicklungszonen in<em&gt; Zea Mays</em&gt; Blätter

Growth analyses are often used in plant science to investigate contrasting genotypes and the effect of environmental conditions. The cellular aspect of ...

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JoVE Journal

Biology

Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

10.8K Aufrufe.  University of Antwerp. Quantifying cell division and expansion is of crucial importance to the understanding of whole-plant growth. Here, we present a protocol to calculate cellular parameters determining maize leaf growth rates and highlight the use of these data for investigating molecular growth regulatory mechanisms by directing developmental stage-specific sampling strategies. 

Serie: Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer software.  Video bioinformatics is a powerful quantitative approach for extracting spatio-temporal data from video images using computer software to perform dating mining and analysis. In this article, we introduce a video bioinformatics method for quantifying the growth of human embryonic stem cells (hESC) by analyzing time-lapse videos collected in a Nikon BioStation CT incubator equipped with a camera for video imaging. In our experiments, hESC colonies that were attached to Matrigel were filmed for 48 hours in the BioStation CT.  To determine the rate of growth of these colonies, recipes were developed using CL-Quant software which enables users to extract various types of data from video images.  To accurately evaluate colony growth, three recipes were created. The first segmented the image into the colony and background, the second enhanced the image to define colonies throughout the video sequence accurately, and the third measured the number of pixels in the colony over time.  The three recipes were run in sequence on video data collected in a BioStation CT to analyze the rate of growth of individual hESC colonies over 48 hours. To verify the truthfulness of the CL-Quant recipes, the same data were analyzed manually using Adobe Photoshop software. When the data obtained using the CL-Quant recipes and Photoshop were compared, results were virtually identical, indicating the CL-Quant recipes were truthful. The method described here could be applied to any video data to measure growth rates of hESC or other cells that grow in colonies. In addition, other video bioinformatics recipes can be developed in the future for other cell processes such as migration, apoptosis, and cell adhesion.  

Video bioinformatics is the automated processing, analysis, understanding, and data mining of biological spatio-temporal data extracted from microscopic videos. The purpose of this article is to demonstrate a method for measuring human embryonic stem cell colony growth using a video bioinformatics method.

Video bioinformatischen Analyse von humanen embryonalen Stammzellen Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Forschung

Biologie

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

Ein System für<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultivierung von embryonalen Pankreas

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Flow cytometry has been widely used to obtain information about DNA content in a population of cells, to infer relative percentages in different cell cycle phases. This technique has been successfully extended to the mitotic tissues of the model organism Drosophila melanogaster for genetic studies of cell cycle regulation in vivo. When coupled with cell-type specific fluorescent protein expression and genetic manipulations, one can obtain detailed information about effects on cell number, cell size and cell cycle phasing in vivo. However this live-cell method has relied on the use of the cell permeable Hoechst 33342 DNA-intercalating dye, limiting users to flow cytometers equipped with a UV laser. We have modified this protocol to use a newer live-cell DNA dye, Vybrant DyeCycle Violet, compatible with the more common violet 405nm laser. The protocol presented here allows for efficient cell cycle analysis coupled with cell type, relative cell size and cell number information, in a variety of Drosophila tissues. This protocol extends the useful cell cycle analysis technique for live Drosophila tissues to a small benchtop analyzer, the Attune Acoustic Focusing Cytometer, which can be run and maintained on a single-lab scale.

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

A protocol for cell cycle analysis of live Drosophila tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer is described. This protocol simultaneously provides information about relative cell size, cell number, DNA content and cell type via lineage tracing or tissue specific expression of fluorescent proteins in vivo.

Live Cell Cycle Analysis von<em&gt; Drosophila</em&gt; Gewebe mit dem Attune Acoustic Fokussierung Cytometer und Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Flow cytometry has  been widely used to obtain information about DNA content in a population of  cells, to infer relative percentages in different cell ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

Die zytologische Analyse der Spermatogenese: Live-und Fest Zubereitungen aus<em&gt; Drosophila</em&gt; Hoden

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force used to pump blood. Individual cardiomyocytes were first isolated over 40 years ago in order to better study the physiology and structure of heart muscle. Techniques have rapidly improved to include enzymatic digestion via coronary perfusion. More recently, analyzing the contractility and calcium flux of isolated myocytes has provided a vital tool in the cellular and sub-cellular analysis of heart failure. Echocardiography and EKGs provide information about the heart at an organ level only. Cardiomyocyte cell culture systems exist, but cells lack physiologically essential structures such as organized sarcomeres and t-tubules required for myocyte function within the heart. In the protocol presented here, cardiomyocytes are isolated via Langendorff perfusion. The heart is removed from the mouse, mounted via the aorta to a cannula, perfused with digestion enzymes, and cells are introduced to increasing calcium concentrations. Edge and sarcomere detection software is used to analyze contractility, and a calcium binding fluorescent dye is used to visualize calcium transients of electrically paced cardiomyocytes; increasing understanding of the role cellular changes play in heart dysfunction. Traditionally used to test drug effects on cardiomyocytes, we employ this system to compare myocytes from WT mice and mice with a mutation that causes dilated cardiomyopathy. This protocol is unique in its comparison of live cells from mice with known heart function and known genetics. Many experimental conditions are reliably compared, including genetic or environmental manipulation, infection, drug treatment, and more. Beyond physiologic data, isolated cardiomyocytes are easily fixed and stained for cytoskeletal elements. Isolating cardiomyocytes via perfusion is an extremely versatile method, useful in studying cellular changes that accompany or lead to heart failure in a variety of experimental conditions.

Individual cardiomyocytes from wild type and mutant mice can be isolated from the heart in order to study their contractility and calcium transients. This allows characterization of the contribution of cellular dysfunction to heart dysfunction from any cause.

Isolation und physiologische Analyse von Maus Kardiomyozyten

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

Rekonstitution von β-Catenin-Abbau in<em&gt; Xenopus</em&gt; Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here protocols are presented for preparing embryos and adult C. elegans animals for short- and long-term time-lapse microscopy and methods for tracking and quantification of developmental processes. The methods presented are all based on C. elegans strains available from the Caenorhabditis Genetics Center and on open-source software that can be easily implemented in any laboratory independently of the microscopy system used. A reconstruction of a 3D cell-shape model using the modelling software IMOD, manual tracking of fluorescently-labeled subcellular structures using the multi-purpose image analysis program Endrov, and an analysis of cortical contractile flow using PIVlab (Time-Resolved Digital Particle Image Velocimetry Tool for MATLAB) are shown. It is discussed how these methods can also be deployed to quantitatively capture other developmental processes in different models, e.g., cell tracking and lineage tracing, tracking of vesicle flow.

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.

Tracking und Quantifizierung von Entwicklungsprozessen in<em&gt; C. elegans</em&gt; Verwendung von Open-Source-Werkzeuge

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

A Morphometric and Cellular Analysis Method for the Murine Mandibular Condyle

The temporomandibular joint (TMJ) has the capacity to adapt to external stimuli, and loading changes can affect the position of condyles, as well as the structural and cellular components of the mandibular condylar cartilage (MCC). This manuscript describes methods for analyzing these changes and a method for altering the loading of the TMJ in mice (i.e., compressive static TMJ loading). The structural evaluation illustrated here is a simple morphometric approach that uses the Digimizer software and is performed in radiographs of small bones. In addition, the analysis of cellular changes leading to alterations in collagen expression, bone remodeling, cell division, and proteoglycan distribution in the MCC is described. The quantification of these changes in histological sections - by counting the positive fluorescent pixels using image software and measuring the distance mapping and stained area with Digimizer - is also demonstrated. The methods shown here are not limited to the murine TMJ, but could be used on additional bones of small experimental animals and in other regions of endochondral ossification.

This manuscript presents methods for analyzing morphometric and cellular changes within the mandibular condyle of rodents.

Eine morphometrische und zelluläre Analysemethode für das Murine mandibulares Kondylus

The temporomandibular joint (TMJ) has the capacity to adapt to external stimuli, and loading changes can affect the position of condyles, as well as the ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

Analyse der Beta-Zellfunktion mit einzelligen Auflösung Kalzium Imaging im Zebrafisch Inselchen

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, host-symbiont interactions, speciation, and venom synthesis. Despite the availability of several molecular tools, including CRISPR/Cas9, functional genetic studies are still limited in this organism. The major limitation of applying CRISPR/Cas9 technology in N. vitripennis stems from the challenges of embryonic microinjections. Injections of embryos are particularly difficult in this organism and in general in many parasitoid wasps, due to small embryo size and the requirement of a host pupa for embryonic development. To address these challenges, Cas9 ribonucleoprotein complex delivery into female&#160;ovaries by adult injection, rather than embryonic microinjection, was optimized, resulting in both somatic and heritable germline edits. The injection procedures were optimized in pupae and female wasps using either ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) or BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). These methods are shown to be effective alternatives to embryo injection, enabling site-specific and heritable germline mutations.

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Here, we describe methods for efficient pupal and adult injections in Nasonia vitripennis as accessible alternatives to embryo microinjection, enabling functional analysis of genes of interest using either RNA-silencing via RNA interference (RNAi) or gene knockout via CRISPR/Cas9 genome editing.

Puppen- und Erwachseneninjektionen zur RNAi- und CRISPR-Genbearbeitung bei Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...