Este trabajo fue apoyado por una beca de doctorado de la Universidad de Amberes a VA; una beca de doctorado de la Fundación de Ciencias de Flandes (FWO, 11ZI916N) de KS; subvenciones para proyectos de la FWO (G0D0514N); una beca de investigación actividad de investigación concertada (GOA), &quot;Un enfoque de Biología de Sistemas de la hoja de la morfogénesis&quot; del Consejo de Investigación de la Universidad de Amberes; y la atracción Interuniversitario polacos (IUAP VII / 29, MARS), &quot;El maíz y Arabidopsis raíces y brotes de crecimiento&quot; de la Oficina Federal de Bélgica Ciencia Política (BELSPO) para GTSB Han Asard, Bulelani L. Sizani y Hamada Abdelgawad contribuyeron al video .

NOTA: La siguiente protocolo para el análisis cinemático sólo es válida para las hojas durante el crecimiento de estado estacionario. Esto implica una velocidad de alargamiento de la hoja estable y los patrones espaciales de longitud de la célula y la expansión en una hoja durante un período de varios días 6. 1. Crecimiento de las Plantas y mediciones de la hoja Elongación Rate (LER) <ol><li> Elija una hoja en el crecimiento de estado estacionario y una etapa de desarrollo de interés. NOTA: Hay una diferencia entre el crecimiento de estado estacionario y el crecimiento repetitivo, lo que implica patrones espaciales similares en las hojas sucesivas sobre el mismo eje. Durante las primeras etapas de crecimiento de las plántulas, hojas sucesivas en general crecen cada vez más rápido debido al aumento del tamaño de la zona de crecimiento 7. Aunque algunas posiciones de las hojas superiores pueden tener un patrón de crecimiento similar 8, esto es una fase transitoria que puede ser afectada por los tratamientos bajo investigación. Por tanto, es importante comparar las líneas y tr<html> eatments estrictamente en la misma posición de la hoja, a pesar de que puede estar desarrollando en un momento diferente. Incluso a una velocidad de elongación constante, el perfil de la tasa de crecimiento no es necesariamente la misma en las diferentes etapas de desarrollo. Por lo tanto, es importante analizar las hojas en la misma etapa de desarrollo 8, por lo general definido por el número de días después de la emergencia. </li><li> Para realizar un análisis cinemático completo de crecimiento de las hojas en monocotiledóneas, crecerá al menos 15 plantas para cada tratamiento y el genotipo bajo condiciones controladas en una cámara de crecimiento. </li><li> En el momento de la hoja de interés aparece (la salida de la espiral de hojas circundantes), comenzar a medir la longitud de la hoja diaria con una regla hasta que la hoja está completamente expandido (Figura 1i). longitud de la hoja implica la longitud desde el nivel del suelo hasta la punta de la hoja. Tenga cuidado de no romper o dañar la hoja, ya que esto podría alterar su crecimiento. </li></ol>re 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54887 / 54887fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1:. Vista general esquemática de un análisis cinemático de hojas de maíz La hoja de interés se mide con una regla de tres días consecutivos para calcular la elongación de la hoja Rate (LER). A partir de entonces, la hoja se cosecha y un segmento de tres centímetros se utiliza para la determinación del tamaño de meristemo. Esto se hace mediante la medición de la longitud desde la base hasta la cifra mitótico más distal después de la tinción DAPI. (A) Los ejemplos de figuras de mitosis proliferativas y (B) mitosis formativos. Los primeros once centímetros de la base de la hoja en el otro lado de la mitad de la vena se utilizan para cortar diez segmentos de un centímetro para mediciones de la longitud de la célula. Estas mediciones proporcionan la base para crear el perfil de longitud de la célula, que sirve para determinar la longitud madura celular (l mat) y la longitud de las células que salen del meristemo (l div). los <em&gt; LER y l estera se utilizan para calcular la tasa de producción de células (P), mientras que l div y L mer se utilizan para calcular el número de células en el meristemo (mer N). A su vez, P y N mer se utilizan para calcular la tasa media de la división celular (D), que es la inversa de la duración del ciclo celular (T c). Las flechas del mismo color indican los parámetros que se utilizan para calcular el parámetro siguiente en estas flechas. Barras de escala = 40 m. Números romanos se utilizan para referirse a los procedimientos experimentales específicos descritos en el protocolo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54887/54887fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 2. La recolección <ol><li> En la etapa de desarrollo de interés (por ejemplo, el tercer día después de la emergencia), elija al menos cinco representativa plantes del lote en el que para llevar a cabo el análisis cinemático. Continuar midiendo el resto de las plantas, como se explica en el paso 1.3 para determinar la longitud de la hoja final. </li><li> Cortar la parte por encima del suelo de la planta. Para mantener la parte meristemático intacta, corte lo más cerca posible a las raíces (Figura 1ii). </li><li> A partir de las hojas exteriores, retire todas las hojas hasta la hoja de interés por ellos desenrollar suavemente uno por uno. Si es necesario, retire unos pocos milímetros adicionales de la base para separar las hojas. También quite las hojas del ápice y pequeñas encerradas por la hoja de interés (Figura 1III). </li><li> Cortar un segmento de 3 cm, a partir de la base en un lado de mediados de la vena, y almacenarlo en un tubo de 1,5 ml de ensayo lleno de 3: 1 (v: v) de etanol absoluto: solución de ácido acético (PRECAUCIÓN: Use guantes) a 4 ° C durante 24 horas hasta varios meses (Figura 1iv). Este segmento posterior se utiliza para determinar la longitud del meristemo. </li><li> Desde elotro lado de la vena, cortar un segmento de 11 cm de la base (Figura 1 v) y colocarlo en un tubo de 15 ml lleno de etanol absoluto a 4 ° C durante al menos 6 horas para eliminar pigmentos (Figura 1 vi). NOTA: Más adelante, utilizar sólo los primeros 10 cm para determinar el perfil de longitud de la célula (ver Discusión). </li><li> Renovar el etanol absoluto para otra ronda de limpieza a 4 ° C durante al menos 24 horas (Figura 1vi). </li><li> Por último, sustituir el etanol absoluto con ácido láctico puro (PRECAUCIÓN: usar guantes) para la limpieza y el almacenamiento a 4 ° C durante 24 h, o hasta su uso posterior (Figura 1vi). </li></ol> 3. Las mediciones de longitud de meristemas <ol><li> Preparar un tampón de enjuague que contiene 50 mM de cloruro de sodio (NaCl), 5 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA; PRECAUCIÓN: usar guantes) y 10 mM Tris (hidroximetil) aminometano-ácido clorhídrico (Tris-HCl, pH 7). </li><li> Tome el segmento de 3 cm de la sección 2.4 y por loak en el buffer de 20 min (Figura 1vii). </li><li> Mientras espera, utilizar el tampón de enjuague para preparar una solución de tinción 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) de 1 g / ml, manteniéndolo en hielo y en la oscuridad. </li><li> Tinción de los núcleos colocando el segmento de meristemo para 2-5 min en la solución de tinción DAPI. Trabajar en el hielo y en la oscuridad (Figura 1vii). </li><li> Compruebe si hay señal de fluorescencia mediante el montaje de forma rápida el segmento en un vaso de microscopía y lo cubre con una cubierta de vidrio. Las células epidérmicas deben mostrar fluorescencia, mientras que las capas celulares subyacentes no debería. </li><li> Si la tinción no es suficiente, poner el segmento de nuevo en la solución de tinción DAPI para algunos minutos adicionales. </li><li> Para detener la tinción, montar los segmentos en una gota de disolución tampón de enjuague en un portaobjetos de microscopía y cubierta con una tapa de vidrio. </li><li> Use un microscopio equipado con UV en la fluorescencia con un aumento de 20X, lo que permite la visualización de alrededor de 1.000 epidermislas células de Al a la vez. Desplazarse a lo largo del segmento y buscar figuras mitóticas proliferativas (metafase, anafase, telofase y citocinesis), pero evita la división celular formativo de los estomas en desarrollo (Figura 1viii) 9. Definir dónde se encuentra la figura mitótica más distal. </li><li> Determinar la longitud del meristemo mediante la medición de la distancia entre la base de la hoja y el más figura mitótica epidérmica distal. Utilice un software de análisis de imágenes (por ejemplo, ImageJ) para medir la longitud total de la trama de imagen. <ol><li> Contar el número de cuadros que cubren la longitud total de meristemas (desde la base de la hoja de la figura mitótica más distal) y multiplicar este número por la longitud de una trama para obtener la longitud completa de meristemas (Figura 1ix). </li></ol></li></ol> 4. célula de cuerpo entero Perfil <ol><li> Tome el segmento que se almacena en ácido láctico (paso 2.5) y colocarlo cuidadosamente en el banquillo. Cortar el ingenio segmentosja bisturí en 10 segmentos de 1 cm cada una (Figura 1 x). </li><li> Montar los segmentos de hojas sucesivas sobre un portaobjetos de microscopía en una pequeña gota de ácido láctico. Asegúrese de hacer frente a la consistencia, ya sea adaxial o el lado abaxial hacia arriba. En principio, no hay ninguna preferencia por un lado particular. </li><li> Use un microscopio equipado con contraste de interferencia diferencial óptica (DIC) para analizar los segmentos, a partir de la base de la hoja. Medir con un software de análisis de imagen de la longitud de al menos 20 células epidérmicas de duplicados en archivos directamente adyacentes a los archivos de los estomas con el fin de seleccionar siempre el mismo tipo de célula. <ol><li> Para ello, en posiciones equidistantes a lo largo de cada uno de los segmentos (4 posiciones son suficientes por segmento), y asegúrese de anotar la posición correspondiente para cada medición a lo largo de la hoja (Figura 1xI). </li></ol></li><li> Determinar la longitud de la célula normal en cada mm a lo largo del eje de la hoja mediante el uso de una suavización polinómica local de pPROCEDIMIENTO, implementado en un R-escritura (Figura 1xii; Archivo 1). NOTA: La secuencia de comandos-R proporciona una serie de datos con el aumento de suavizado. La cantidad de suavizado requerida es algo arbitrario y lo ideal sería que acaba de quitar el ruido local, pero no afectará a la curva en general. Asegúrese de usar la misma cantidad de suavizado para todas las muestras dentro de un experimento. </li><li> Promediar la longitud de la célula en cada posición entre las plantas y calcular el error estándar para crear un perfil de longitud de la célula a lo largo del eje de la hoja. </li></ol> 5. Los cálculos de los parámetros cinemáticos (véase la disposición complementaria 2) <ol><li> Calcular la LER tomando el cambio en la longitud de la hoja entre dos puntos de tiempo sucesivos (por ejemplo, 24 hr, como en el paso 1.3) y dividiéndolo por el intervalo de tiempo. </li><li> Calcular la longitud de la zona de crecimiento (L gz) correspondiente a la posición distal de la base donde las células alcanzan 95% de su ce madurall longitud del perfil de suavizado longitud de la célula. <ol><li> Tomemos, por cada posición en el perfil smoothened longitud de la célula 95% de la media de todas las longitudes de células siguientes esa posición (Figura 2). </li><li> Comparar las longitudes de células smoothened (paso 4,4) con la longitud de la célula 95% calculado en cada posición. Partiendo de la base de la hoja, la zona de crecimiento termina en la posición en la que la longitud de la célula actual es igual a 95% de las siguientes longitudes de células (Figura 2; véase los datos adicionales 2). </li></ol></li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54887/54887fig2.jpg" /> Figura 2:. La determinación de la final de la zona de crecimiento de meristemas: en la posición indicada con una estrella roja, el tamaño de celda actual es menor que 95% (línea roja punteada) del tamaño de celda promedio de todas las células siguientes esta posición (sólido de color rojo línea). El final de la zona de crecimiento (L gz; indicado con abLue estrellas) se encuentra en el 95% (línea punteada azul) del tamaño de celda promedio de todas las células después de esta posición (sólida línea azul) es igual al tamaño real de la celda. zona División (D), zona de elongación (E), y la zona maduro (M). Discontinuas flechas indican la convergencia entre el tamaño local y el 95% del tamaño promedio de la porción distal de la hoja cuando se pasa de las posiciones basales a la punta de la hoja. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54887/54887fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <ol start="3"><li> Calcular la longitud de la zona de elongación (L el) como la diferencia entre la longitud de la zona de crecimiento (L gz) y el tamaño de meristemas (L mer; determinado en el paso 3). </li><li> Calcular la longitud de la célula madura (l mat) como la longitud de celda promedio en la zona maduro. </li><li> Divida la LER por l tapete para obtener eltasa de producción de células (P). </li><li> Calcular el número de células en la zona de elongación (N el) como la diferencia entre N y N gz mer. El número de células en el meristemo (mer N) es igual al número acumulado de células situadas en los intervalos correspondientes a la meristemo. El número de células en la zona de crecimiento (N gz) es igual al número acumulado de células situadas en los intervalos correspondientes a la zona de crecimiento. </li><li> Calcular la tasa de división celular promedio (D) como mer P / N. La duración del ciclo celular (T c) es igual a ln (2) / D. </li><li> Calcular el tiempo en la zona de alargamiento (T el) dividiendo el N por P. El tiempo en la zona de la división es igual a log 2 (N mer) * Tc. La longitud de las células que salen del meristemo (l div)es igual a la longitud de la célula a partir del perfil smoothened longitud de la célula en el extremo del meristemo. </li><li> Calcular la tasa promedio de expansión de células (R el) utilizando la fórmula siguiente: ln (l mat) ln (l div)] / T el. </li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Un análisis cinemático completo en las hojas de maíz permite la determinación de la base celular de crecimiento de la hoja y permite el diseño de estrategias de muestreo eficientes. Aunque el protocolo es relativamente sencillo, algunos se recomienda precaución en los siguientes pasos críticos: (1) Es importante separar las hojas más jóvenes cerrados (paso 2.3) sin dañar el meristemo, ya determinación de la longitud de meristemas (paso 3) requiere la completa meristemo de estar presente. Un poco de práctica de antemano podría ser necesaria. (2) determinación de la longitud meristemático se basa en la interpretación de figuras mitóticas. Por lo tanto, le recomendamos que, dentro de un experimento, la misma persona lleva a cabo estas medidas para reducir la varianza debida al ejecutor. (3) A pesar de que sólo diez centímetros se utiliza para la medición de la longitud real de la celda, es importante incluir once centímetros cuando se cosecha el segmento de mediciones de la longitud de la célula (paso 2.5), debido a que el borde del segmento no hacet siempre sumergir completamente en etanol y / o ácido láctico. Por lo tanto, este centímetro adicional garantiza la limpieza de los primeros diez centímetros de la zona de crecimiento. (4) Al final, es útil para inspeccionar el resultado de todos los parámetros cinemáticos que confirmar que son correctos. En la Tabla 3, por ejemplo, la tasa de producción de células (P) de las plantas a la sequía subrayado se redujo en un 71%, o, en otras palabras, P sequía es 0,29 del control P. Dado que la producción de células depende de la tasa de división celular media (D; -63%) y el número de células en meristemas (N mer; -20%; Figura 3), lo siguiente puede ser utilizado para validar la salida: P (0.29) ≈ mer N (0,8) x D (0,37). El mismo se puede aplicar para la LER = P x I estera. Dependiendo de las instalaciones disponibles, el protocolo puede ser modificado en algunos pasos. (1) A más de unaVANZADO alternativa para las mediciones de la longitud de la hoja manuales diarias (paso 1.3) se basa en la velocidad de desplazamiento lineal (LVDT) transductores 13. Su ventaja es que permite mediciones a una resolución de tiempo mucho mayor, que van desde minutos a segundos. (2) Es fundamental incluir la zona de crecimiento completo durante el muestreo. Sin embargo, las condiciones ambientales, el genotipo, la especie y la etapa de desarrollo examinadas podrían alterar la longitud de la zona de crecimiento. Por lo tanto, es útil para hacer una primera estimación de la longitud de la zona de crecimiento en respuesta a su tratamiento experimento. Este protocolo se basa en la línea consanguínea B73 cultivadas a 25 ° C / 18 ° C (día / noche) a 300-400 μEm -2 s -1 (radiación fotosintéticamente activa - PAR). (3) Con el fin de visualizar las figuras mitóticas (paso 3.8) sin utilizar la fluorescencia, una mancha Fuelgen se puede aplicar 14. (4) El suavizado de los datos también se puede realizar en MS Excel en lugar de R mediante el uso de un qua de cinco puntoscuadrático ajustada con la función &quot;ESTIMACION.LINEAL&quot; 15. Una limitación importante de esta técnica es que toda la zona de crecimiento necesita ser cosechada durante el crecimiento de estado estacionario. Con el fin de asegurar el crecimiento de estado estacionario, las plantas idealmente deben ser cultivadas bajo condiciones de crecimiento controladas, porque las fluctuaciones en la intensidad de la luz, la temperatura o la humedad afectan a la velocidad de alargamiento de la hoja 16. Por esta razón, el análisis cinemático es menos adecuado para las plantas cultivadas en condiciones de campo. Otro inconveniente es que las hojas tienen que ser convertido, lo que hace imposible para examinar las hojas que todavía están encerrados en las hojas más viejas. Finalmente, el protocolo es adecuado para especies monocotiledóneas con grandes zonas de crecimiento que comprenden al menos unos pocos centímetros. Un análisis cinemático en monocotiledóneas más pequeñas (por ejemplo, Poa, arroz), sin embargo, es factible, pero necesita algunas modificaciones en la preparación de la muestra 17,18. Otro uso frecuentemented enfoque para analizar los fenotipos de crecimiento diferenciales es el análisis clásico de crecimiento. Este análisis cuantifica tasas de crecimiento relativo toda la planta y determina la asignación subyacente de carbono derivado fotosintética en una nueva área fotosintética y en otras partes de la planta 19. El análisis cinemático, sin embargo, permite una comprensión más detallada de los procesos celulares subyacentes que están acopladas a los fenotipos de crecimiento basado en la cuantificación de la división celular y la expansión. Por otra parte, la posibilidad de determinar la longitud de cada zona de crecimiento permite la correlación de las mediciones moleculares a lo largo del eje de la hoja a la etapa de desarrollo específico que se ve afectado por el tratamiento en estudio. Esto es fundamental para la interpretación de los datos. Cuando limitada en el tiempo o el presupuesto o cuando interesado en etapas específicas de desarrollo, el resultado de este análisis permite la toma de muestras centrado, reduciendo el número de muestras necesarias para el análisis. En conclusión, el análisis cinemático permites la determinación de parámetros celulares que subyacen a las respuestas al estrés y la variación genética en el crecimiento de las hojas y puede vincularlos con los procesos de regulación aguas arriba (Tabla 2).

Análisis del crecimiento depende de un conjunto de herramientas que se utilizan comúnmente por los científicos para describir la planta de genotipo determinado las diferencias de crecimiento y / o respuestas fenotípicas a factores ambientales. Incluyen mediciones de tamaño y peso de la planta entera o un órgano y los cálculos de las tasas de crecimiento para explorar los mecanismos subyacentes de crecimiento. el crecimiento de órganos se determina por la división celular y la expansión a nivel celular. Por lo tanto, incluyendo la cuantificación de estos dos procesos en el crecimiento de los análisis es clave para entender las diferencias en el crecimiento conjunto de órganos 1. En consecuencia, es fundamental contar con una metodología adecuada para determinar los parámetros de crecimiento celular que es relativamente fácil de usar por los laboratorios no especializados. Análisis cinemático ya se ha establecido como un enfoque que proporciona un marco de gran alcance para el desarrollo de modelos de crecimiento de órganos 2. La técnica ha sido optimizado para sistemas lineales,como las raíces de Arabidopsis thaliana y las hojas monocotiledóneas, sino también para sistemas no lineales, tales como hojas dicotiledóneas 3. Hoy en día, esta metodología se utiliza cada vez para estudiar cómo genéticos, hormonales, de desarrollo, y los factores ambientales influyen en la división celular y la expansión en varios órganos (Tabla 1). Por otra parte, también proporciona un marco para vincular los procesos celulares a sus regulaciones bioquímicos, moleculares y fisiológicos subyacentes (tabla 2), aunque las limitaciones pueden ser impuestas por el tamaño del órgano y la organización espacial de las técnicas que requieren una mayor cantidad de material vegetal (por ejemplo, metabolitos mediciones, proteómica, etc.). Hojas monocotiledóneas, tales como el maíz (Zea mays) hoja, representan sistemas lineales en los que las células se mueven desde la base de la hoja hacia la punta, pasando secuencialmente a través de la zona de meristemas y la elongación para llegar a la madurazona. Esto hace que sea un sistema modelo ideal para los estudios cuantitativos de los patrones espaciales de crecimiento del 4. Por otra parte, las hojas del maíz tienen grandes zonas de crecimiento (meristemas y zona de elongación que abarcan varios centímetros 5) y ofrezcan posibilidades para estudios en otros niveles de organización. Esto permite la investigación de las (supuestas) mecanismos reguladores que controlan la división celular y la expansión, cuantificado por análisis cinemático a través de una serie de técnicas moleculares, las mediciones fisiológicas, y métodos de biología celular (Tabla 2). A continuación, ofrecemos un protocolo para la realización de un análisis cinemático en las hojas de monocotiledóneas. En primer lugar, explicamos cómo llevar a cabo un análisis adecuado de tanto la división celular y elongación celular como una función de la posición a lo largo del eje de la hoja y la forma de calcular los parámetros cinemáticos. En segundo lugar, también muestran cómo se puede utilizar como base para el diseño de muestreo. A continuación, se discuten dos casos: de alta resolución de un muestreod centró toma de muestras, lo que permite la interpretación de datos mejorada y el ahorro de tiempo / dinero, respectivamente. Tabla 1. Resumen de los análisis cinemático métodos para la cuantificación de la división celular y la expansión en varios órganos. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Organo </td><td> referencia </td></tr><tr><td> hojas de monocotiledóneas </td><td> 16, 20, 21, 22 </td></tr><tr><td> puntas de las raíces </td><td> 2, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 </td></tr><tr><td> hojas dicotiledóneas </td><td> 21, 30, 31 </td></tr><tr><td> disparar meristemo apical </td><td> 32 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Resumen de los análisis cinemático métodos para la cuantificación de la división celular y la expansión en varios órganos. Tabla 2. Relación entre procesos celulares cuantificados por el análisis cinemático para su regulación a nivel molecular. Las referencias a diversos estudios que relacionan la cuantificación de los procesos celulares con los resultados de los ensayos bioquímicos y moleculares en distintas especies y órganos. Endotransglucosylase xiloglucano (XET), malondialdehído (MDA), quinasas dependientes de ciclina (CDK). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54887/54887table2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta tabla.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1670">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Pots</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td style="width:813px;">We use pots with the following measueres, but can be different depending on the treatment/study : bottom diameter: 11cm, opening diameter: 15 cm, height: 12 cm. We grow one maize plant per pot.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Planting substrate</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td>We use potting medium (Jiffy, The Netherlands), but other substrates can be used, depending on treatment/study.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Ruler</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td>An extension ruler that covers at least 1,5 meters is needed to measure the final leaf length of the plants.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Seeds&#160;</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">NA</td>
			<td>Seeds can be ordered from a breeder.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Scalpel</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td style="width:813px;">The scalpel is used during leaf harvesting to detach the leaf of interest from its surrounding leaves and right after harvesting to cut a proper sample for cell length and meristem length measurements.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">15 ml falcon tubes</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td style="width:813px;">The 15 ml falcon tubes are used for storing samples used for cell length measurements during sample clearing with absolute ethanol and lactic acid.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Eppendorf tubes</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td style="width:813px;">The eppendorf tubes are used for storing samples used for meristem length measurements in ethanol:acetic acid 3:1 (v:v) solution.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Gloves</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td>Latex gloves, which protect against corrosive reagents.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td style="width:813px;">CAUTION: Corrosive to metals, category 1 Skin corrosion, categories 1A,1B,1C Serious eye damage, category 1; Flammable liquids, categories 1,2,3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Absolute ethanol</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td style="width:813px;">CAUTION: Hazardous in case of skin contact (irritant), of eye contact (irritant), of inhalation. Slightly hazardous in case of skin contact (permeator), of ingestion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Lactic acid &#62;98%</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td>CAUTION: Corrosive to metals, category 1 Skin corrosion, categories 1A,1B,1C Serious eye damage, category 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td style="width:813px;">CAUTION: Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), category 4 Skin irritation, category 2 Eye irritation, category 2 Skin sensitisation, category 1 Specific Target Organ Toxicity &#8211; Single exposure, category 3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride (Tris-HCl)</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td style="width:813px;">This material can be an irritant, contact with eyes and skin should be avoided. Inhalation of dust may be irritating to the respiratory tract.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">4&#8242;,6-Diamidine-2&#8242;-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td style="width:813px;">Cell permeable fluorescent minor groove-binding probe for DNA. Causes skin irritation. May cause an allergic skin reaction. May cause respiratory irritation.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Ice</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">NA</td>
			<td>The DAPI solution has to be kept on ice.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Fluorescent microscope</td>
			<td>AxioScope A1, Axiocam ICm1 from Zeiss or other</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td>Any fluorescent microscope can be used for determining meristem length.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Microscopic slide</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Cover glass</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Tweezers</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td style="width:813px;">Tweezers are needed for unfolding the rolled maize leaf right after harvesting in order to cut a proper sample for cell length and meristem length measurements.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Image-analysis software</td>
			<td>Axiovision (Release 4.8) from Zeiss</td>
			<td style="width:209px;">NA</td>
			<td style="width:813px;">The software can be downloaded at: http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/axiovision.html. Other softwares such as ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) could be used as well.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Microscope equipped with DIC</td>
			<td>AxioScope A1, Axiocam ICm1 from Zeiss or other</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td>Any&#160; microscope, equipped with differential interference contrast (DIC) can be used to measure cell lengths.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">R statistical analysis software</td>
			<td>R Foundation for Statistical Computing</td>
			<td style="width:209px;">NA</td>
			<td>Open source; Could be downloaded at https://www.r-project.org/</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:315px;">R script</td>
			<td style="width:333px;">NA</td>
			<td style="width:209px;">NA</td>
			<td style="width:813px;">We use the kernel smoothing function locpoly of the Kern Smooth package (Wand MP, Jones MC.&#160; Kernel Smoothing: Chapman &#38; Hall/CRC (1995)). The script is available for Mac and Windows upon inquire with the corresponding author. We have versions for Mac and Windows.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

kinematic analysis of cell division and expansion: quantifying the cellular basis of growth and sampling developmental zones in zea mays leaves

Growth analyses are often used in plant science to investigate contrasting genotypes and the effect of environmental conditions. The cellular aspect of these analyses is of crucial importance, because growth is driven by cell division and cell elongation. Kinematic analysis represents a methodology to quantify these two processes. Moreover, this technique is easy to use in non-specialized laboratories. Here, we present a protocol for performing a kinematic analysis in monocotyledonous maize (Zea mays) leaves. Two aspects are presented: (1) the quantification of cell division and expansion parameters, and (2) the determination of the location of the developmental zones. This could serve as a basis for sampling design and/or could be useful for data interpretation of biochemical and molecular measurements with high spatial resolution in the leaf growth zone. The growth zone of maize leaves is harvested during steady-state growth. Individual leaves are used for meristem length determination using a DAPI stain and cell-length profiles using DIC microscopy. The protocol is suited for emerged monocotyledonous leaves harvested during steady-state growth, with growth zones spanning at least several centimeters. To improve the understanding of plant growth regulation, data on growth and molecular studies must be combined. Therefore, an important advantage of kinematic analysis is the possibility to correlate changes at the molecular level to well-defined stages of cellular development. Furthermore, it allows for a more focused sampling of specified developmental stages, which is useful in case of limited budget or time.

Aquí, se muestra una comparación entre las plantas bien regadas (control, el contenido de agua del suelo 54%, (SWC)) y plantas sometidas a condiciones de estrés hídrico (sequía, el 34% de CSA) en términos de su crecimiento de las hojas. Todas las plantas se cultivaron en una cámara de crecimiento bajo condiciones controladas (16 horas día / 8 horas por la noche, 25 ° C / 18 ° C día / noche, 300-400 μEm -2 s -1 de radiación fotosintéticamente activa (PAR). Las condiciones de sequía fueron establecidos por el agua reteniendo hasta que el SWC correcta se alcanzó y luego se mantuvo aún más. En un estudio preliminar, se definió que la quinta hoja es la primera en surgir y desarrollarse bajo esta condición de estrés. por lo tanto, fue elegida como la hoja de interés. la longitud de la hoja final (LL) de las plantas afectados por la sequía fue 40% más baja que la de las plantas bien regadas, lo cual fue debido a una menor LER (Tabla 3). para entender las bases celulares de la LEAf respuesta de crecimiento, se realizó un análisis cinemático. En general, la tasa de alargamiento de la hoja es una función de la producción de células en el meristemo y el tamaño de célula madura determinado en la zona de elongación (Figura 3). Por lo tanto, el acortamiento de la hoja debe ser debido a los efectos sobre uno o ambos de estos parámetros. Nuestros resultados muestran que mientras que la longitud de la célula madura (l mat) no se vio afectada, la tasa de producción de células (P) se redujo en un 71% (Tabla 3). L estera depende de la longitud de las células que salen del meristemo (l div) , el tiempo de estas células pasan en la zona de elongación (T el), y la tasa de expansión celular relativa (R el). No se observó efecto de l div, mientras que R EL se redujo en un 67% en las condiciones de sequía. Este efecto fue compensado por la casi triplicación de T EL, lo que resultó en la misma l mat &lt;/ Sub&gt; como en las condiciones de control. La disminución de la tasa de producción de células, a su vez, causada por tanto una menor tasa de celdas medio de división (D) y un menor número de células en el meristemo (mer N). Duración del meristemo (L mer) se redujo en contraste con la longitud de la zona de crecimiento (L gz), que no fue afectada significativamente. En conclusión, estos resultados muestran que en este caso, el número de células, a diferencia de tamaño de la celda, tenía un papel importante en la determinación de tamaño de la hoja. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> parámetros cinemáticos </td><td> do </td><td> re </td><td> % De cambio de CD </td><td> p-valor </td></tr><tr><td> LL </td><td> 727 ± 15 </td><td> 436 ± 23 </td><td> -40 </td><td> 0.000 </td></tr><tr><td> LER (mm / h) </td><td> 2,8 ± 0,1 </td><td> 0.8 ± 0.0 </td><td> -73 </td><td> 0.000 </td></tr><tr><td> l mat (m) </td><td> 140 ± 3 </td><td> 130 ± 6 </td><td> -7 </td><td> NS </td></tr><tr><td> P (células / h) </td><td> 20 ± 1 </td><td> 6 ± 0 </td><td> -71 </td><td> 0.000 </td></tr><tr><td> D (células · célula -1 · h -1) </td><td> 0,028 ± 0,003 </td><td> 0,010 ± 0,001 </td><td> -63 </td><td> 0.000 </td></tr><tr><td> Tc (h) </td><td> 26 ± 3 </td><td> 71 ± 7 </td><td> 173 </td><td> 0.000 </td></tr><tr><td> Div T (h) </td><td> 249 ± 27 </td><td> 656 ± 71 </td><td> 164 </td><td> 0.000 </td></tr><tr><td> L mer (mm) </td><td> 15 ± 1 </td><td> 11 ± 1 </td><td> -25 </td><td> 0,010 </td></tr><tr><td> N mer </td><td> 740 ± 31 </td><td> 590 + 20 </td><td> -20 </td><td> 0.000 </td></tr><tr><td> R EL (m · m <sup&gt; -1 · h -1) </td><td> 0,043 ± 0,002 </td><td> 0,014 ± 0,001 </td><td> -67 </td><td> 0.000 </td></tr><tr><td> l div (m) </td><td> 24 ± 2 </td><td> 23 ± 2 </td><td> -4 </td><td> NS </td></tr><tr><td> T el (h) </td><td> 42 ± 2 </td><td> 125 ± 11 </td><td> 199 </td><td> 0.000 </td></tr><tr><td> N EL </td><td> 844 ± 54 </td><td> 735 ± 65 </td><td> -13 </td><td> NS </td></tr><tr><td> L g z (mm) </td><td> 68 ± 1 </td><td> 61 ± 5 </td><td> -11 </td><td> NS </td></tr><tr><td> N g z </td><td> 1584 ± 33 </td><td> 1326 ± 66 </td><td> -dieciséis </td><td> 0,010 </td></tr></tbody></table> Tabla 3. Análisis cinemático en la división celular y la expansión celular durante el crecimiento en estado estacionario de la quinta hoja de. las plantas y las plantas bien regadas sometidas a estrés de sequía datos son medias ± error estándar (n = 5, por LL: n = 10). Se utilizó la prueba t de Student como un análisis estadístico. Parámetros: longitud de la hoja (LL), tasa de elongación de la hoja (LER), longitud de la célula madura (l tapete), la tasa de producción de células (P), las tasas de división celular (D), la duración del ciclo celular (Tc), tiempo en zona de división ( T div), longitud del meristemo (L mer), el número de células en el meristemo (mer N), la tasa de elongación celular relativa (R el), la longitud de las células que salen del meristemo (l div), el tiempo en la zona de elongación (T el), el número de células en la zona de elongación (N el), la longitud de la zona de crecimiento (L gz), el número de células en la zona de crecimiento (N gz), condiciones de buen riego (C), el estrés por sequía ( D), una<html> D no significativa (NS). <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54887/54887fig3.jpg" /> Figura 3:. Relación entre los parámetros cinemáticos la longitud final de la hoja (LL) depende de la elongación de la hoja Rate (LER), que a su vez depende de la producción de células (P) y la longitud de célula madura (l mat). El número de células en el meristemo (mer N) y la tasa de división celular (D) junto determinar P, con una duración del ciclo celular (T c) como la inversa de D. Tiempo en la zona de alargamiento (T el), la longitud de las células que salen del meristemo (l div), y la tasa de expansión celular relativa (R el) determinar la longitud de la célula madura (l mat). El número de células en la zona de elongación (N el)..jove.com / archivos / ftp_upload / 54887 / 54887fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Además de su aplicación como un análisis detallado de crecimiento de los órganos, el análisis cinemático ofrece un mapa de crecimiento de las hojas y la localización de la zona permite el muestreo con una resolución de subzona molecular y análisis bioquímicos 4,10,11. Como ejemplo, la Figura 4A muestra malondialdehído cuantificación (MDA) a lo largo de la zona de crecimiento de la hoja de maíz en plantas sometidas a las mismas condiciones que anteriormente. MDA es un metabolito secundario formado durante la peroxidación de lípidos por ROS y refleja los niveles de daño oxidativo 12. MDA se midió en cada centímetro de la hoja, a partir de su base, lo que permitió el análisis de los cambios de concentración a lo largo del gradiente de crecimiento 11. Como el tratamiento de sequía causó 40% de acortamiento de la hoja, la longitud de las zonas de desarrollo (meritallo, zona de elongación, y la zona madura) en las plantas de control no coinciden con la longitud de las mismas zonas en las que la sequía las plantas estresadas (Figura 4B). Como se ve en la figura 4B, el meristemo en las plantas de control fue de alrededor de 1.5 cm de largo, y la zona de elongación se extendió desde 1,5 a 6,8 cm de la base de la hoja. En las plantas estresadas, el meristema se localizó entre 0 y 1,1 cm y la zona de elongación de 1,1 a 6,1 cm. Los niveles de MDA y toda la zona de crecimiento se incrementaron en las plantas afectados por la sequía en comparación con el tratamiento de control. Con la ayuda de la análisis cinemático, podemos concluir que el contenido de MDA se aumentó particularmente en la zona maduro para ambos tratamientos de control y la sequía. Sin conocer los tamaños de las zonas de desarrollo, llegamos a la conclusión de que, en condiciones de sequía, los aumenta el contenido de MDA en una etapa de desarrollo temprano que en las plantas de control, lo que sería incorrecto, ya que no tiene en cuenta el desplazamiento de las zonas debido a tque el acortamiento de la hoja. Por lo tanto, la realización de análisis cinemático antes de las mediciones bioquímicas de crucial importancia para la interpretación de los datos correctamente. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54887/54887fig4.jpg" /> Figura 4: Ejemplo de mediciones bioquímicas de alta resolución y toma de muestras para el análisis centrado malonaldehıdo (MDA) concentraciones (A) medidos a lo largo de la zona de crecimiento de las hojas de maíz (dividido en diez segmentos) de plantas cultivadas condición en bien regado y plantas sometidas a la sequía. tratamiento 10. Los datos son medias ± error estándar (n = 5). ANOVA de dos vías se utilizó como un análisis estadístico, y los valores de p se presentan al lado del panel gráfico (factores: la sequía (d) y el segmento (s)); FW: peso fresco. (B) La visualización de las diferentes zonas de crecimiento en el control y las plantas a la sequía estresado. zona División (D), zona de elongación (E), yzona maduro (M). Las células se magnifican 125 veces. (C) el perfil de la célula de longitud de control y las plantas a la sequía tratada. Los datos son medias ± error estándar (n = 5). (D) Las diferencias en el muestreo centrado tanto en las plantas a la sequía tratado de control y. Los cuadros azules indican la posición de muestreo para comparar la misma etapa de desarrollo en ambos tratamientos. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54887/54887fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Además de ofrecer la posibilidad de comparar las mismas zonas de desarrollo en los estudios de alta resolución, el análisis cinemático también podría utilizarse como base para los análisis más centrado, en los que se toman sólo las muestras de zonas específicas que contienen células en la misma etapa de desarrollo. Se compararon los perfiles de longitud celular, proporcionados por la suavización de las medidas de la longitud de células microscópicas, en los diez primeros centimeters de la base de la hoja de control y las plantas a la sequía estresado. La Figura 4C muestra que, utilizando el perfil de longitud de la célula, se podría determinar la longitud de las zonas de desarrollo y también podría seguir la dinámica tasa de crecimiento tanto en las plantas a la sequía subrayado control y. Esto permitió el muestreo específico de la proliferación de células en el meristemo (antes de la fuerte aumento), la expansión de las células en la zona de alargamiento (en el medio de la fuerte aumento) y las células maduras jóvenes en la zona madura (comienzo de la meseta). Nuestros resultados muestran que, debido al acortamiento de la hoja en respuesta a la sequía, estas zonas no se correspondían en el control y en las plantas estresadas. Con el fin de probar la proliferación, en expansión, y las células maduras jóvenes en las plantas de control, necesitábamos el primero, quinto y noveno centímetro de la base de la hoja, respectivamente. Sin embargo, en las plantas estresadas, estos segmentos corresponden a la primera, cuarta y octava centímetro, respectivamente. Este tipo de más centradomuestreo ha demostrado ser útil en el caso de los estudios más laboriosos, caros, o requieren mucho tiempo, tales como ARN de la secuencia, la proteómica, la metabolómica, etc. Archivo 1:. R-guión de procedimiento de suavización polinómica <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54887/Supplementary_Data_1.docx" target="_blank">favor, haga clic derecho para descargar el archivo.</a> Archivo complementaria 2:. Los cálculos de los parámetros cinemáticos <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54887/Supplementary_Data_2.xlsx" target="_blank">favor, haga clic derecho para descargar el archivo.</a>

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Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

Quantifying cell division and expansion is of crucial importance to the understanding of whole-plant growth. Here, we present a protocol to calculate cellular parameters determining maize leaf growth rates and highlight the use of these data for investigating molecular growth regulatory mechanisms by directing developmental stage-specific sampling strategies.

Análisis cinemático de la división celular y la expansión: La cuantificación de la base celular del crecimiento y el desarrollo en las zonas de muestreo<em&gt; Zea mays</em&gt; Las hojas

Growth analyses are often used in plant science to investigate contrasting genotypes and the effect of environmental conditions. The cellular aspect of ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

10.8K vistas.  University of Antwerp. Quantifying cell division and expansion is of crucial importance to the understanding of whole-plant growth. Here, we present a protocol to calculate cellular parameters determining maize leaf growth rates and highlight the use of these data for investigating molecular growth regulatory mechanisms by directing developmental stage-specific sampling strategies. 

Video: Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer software.  Video bioinformatics is a powerful quantitative approach for extracting spatio-temporal data from video images using computer software to perform dating mining and analysis. In this article, we introduce a video bioinformatics method for quantifying the growth of human embryonic stem cells (hESC) by analyzing time-lapse videos collected in a Nikon BioStation CT incubator equipped with a camera for video imaging. In our experiments, hESC colonies that were attached to Matrigel were filmed for 48 hours in the BioStation CT.  To determine the rate of growth of these colonies, recipes were developed using CL-Quant software which enables users to extract various types of data from video images.  To accurately evaluate colony growth, three recipes were created. The first segmented the image into the colony and background, the second enhanced the image to define colonies throughout the video sequence accurately, and the third measured the number of pixels in the colony over time.  The three recipes were run in sequence on video data collected in a BioStation CT to analyze the rate of growth of individual hESC colonies over 48 hours. To verify the truthfulness of the CL-Quant recipes, the same data were analyzed manually using Adobe Photoshop software. When the data obtained using the CL-Quant recipes and Photoshop were compared, results were virtually identical, indicating the CL-Quant recipes were truthful. The method described here could be applied to any video data to measure growth rates of hESC or other cells that grow in colonies. In addition, other video bioinformatics recipes can be developed in the future for other cell processes such as migration, apoptosis, and cell adhesion.  

Video bioinformatics is the automated processing, analysis, understanding, and data mining of biological spatio-temporal data extracted from microscopic videos. The purpose of this article is to demonstrate a method for measuring human embryonic stem cell colony growth using a video bioinformatics method.

Vídeo Bioinformática Análisis de Crecimiento Humano Colonia células madre embrionarias

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Investigación

Biología

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

Un sistema para la<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cultivo de páncreas embrionario

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Flow cytometry has been widely used to obtain information about DNA content in a population of cells, to infer relative percentages in different cell cycle phases. This technique has been successfully extended to the mitotic tissues of the model organism Drosophila melanogaster for genetic studies of cell cycle regulation in vivo. When coupled with cell-type specific fluorescent protein expression and genetic manipulations, one can obtain detailed information about effects on cell number, cell size and cell cycle phasing in vivo. However this live-cell method has relied on the use of the cell permeable Hoechst 33342 DNA-intercalating dye, limiting users to flow cytometers equipped with a UV laser. We have modified this protocol to use a newer live-cell DNA dye, Vybrant DyeCycle Violet, compatible with the more common violet 405nm laser. The protocol presented here allows for efficient cell cycle analysis coupled with cell type, relative cell size and cell number information, in a variety of Drosophila tissues. This protocol extends the useful cell cycle analysis technique for live Drosophila tissues to a small benchtop analyzer, the Attune Acoustic Focusing Cytometer, which can be run and maintained on a single-lab scale.

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

A protocol for cell cycle analysis of live Drosophila tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer is described. This protocol simultaneously provides information about relative cell size, cell number, DNA content and cell type via lineage tracing or tissue specific expression of fluorescent proteins in vivo.

Teléfono directo Análisis de Ciclo de<em&gt; Drosophila</em&gt; Los tejidos que usan la acústica Attune Centrándose citómetro y Vybrant DyeCycle ADN Violet Stain

Flow cytometry has  been widely used to obtain information about DNA content in a population of  cells, to infer relative percentages in different cell ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

Análisis citológico de espermatogénesis: Los preparativos en directo y fijas de<em&gt; Drosophila</em&gt; Testículos

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force used to pump blood. Individual cardiomyocytes were first isolated over 40 years ago in order to better study the physiology and structure of heart muscle. Techniques have rapidly improved to include enzymatic digestion via coronary perfusion. More recently, analyzing the contractility and calcium flux of isolated myocytes has provided a vital tool in the cellular and sub-cellular analysis of heart failure. Echocardiography and EKGs provide information about the heart at an organ level only. Cardiomyocyte cell culture systems exist, but cells lack physiologically essential structures such as organized sarcomeres and t-tubules required for myocyte function within the heart. In the protocol presented here, cardiomyocytes are isolated via Langendorff perfusion. The heart is removed from the mouse, mounted via the aorta to a cannula, perfused with digestion enzymes, and cells are introduced to increasing calcium concentrations. Edge and sarcomere detection software is used to analyze contractility, and a calcium binding fluorescent dye is used to visualize calcium transients of electrically paced cardiomyocytes; increasing understanding of the role cellular changes play in heart dysfunction. Traditionally used to test drug effects on cardiomyocytes, we employ this system to compare myocytes from WT mice and mice with a mutation that causes dilated cardiomyopathy. This protocol is unique in its comparison of live cells from mice with known heart function and known genetics. Many experimental conditions are reliably compared, including genetic or environmental manipulation, infection, drug treatment, and more. Beyond physiologic data, isolated cardiomyocytes are easily fixed and stained for cytoskeletal elements. Isolating cardiomyocytes via perfusion is an extremely versatile method, useful in studying cellular changes that accompany or lead to heart failure in a variety of experimental conditions.

Individual cardiomyocytes from wild type and mutant mice can be isolated from the heart in order to study their contractility and calcium transients. This allows characterization of the contribution of cellular dysfunction to heart dysfunction from any cause.

Aislamiento y fisiológica Análisis de Ratón cardiomiocitos

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

La reconstitución de la degradación de β-catenina en<em&gt; Xenopus</em&gt; Extracto de Huevo

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here protocols are presented for preparing embryos and adult C. elegans animals for short- and long-term time-lapse microscopy and methods for tracking and quantification of developmental processes. The methods presented are all based on C. elegans strains available from the Caenorhabditis Genetics Center and on open-source software that can be easily implemented in any laboratory independently of the microscopy system used. A reconstruction of a 3D cell-shape model using the modelling software IMOD, manual tracking of fluorescently-labeled subcellular structures using the multi-purpose image analysis program Endrov, and an analysis of cortical contractile flow using PIVlab (Time-Resolved Digital Particle Image Velocimetry Tool for MATLAB) are shown. It is discussed how these methods can also be deployed to quantitatively capture other developmental processes in different models, e.g., cell tracking and lineage tracing, tracking of vesicle flow.

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.

El seguimiento y cuantificación de los procesos de desarrollo en<em&gt; C. elegans</em&gt; Uso de las herramientas de código abierto

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

A Morphometric and Cellular Analysis Method for the Murine Mandibular Condyle

The temporomandibular joint (TMJ) has the capacity to adapt to external stimuli, and loading changes can affect the position of condyles, as well as the structural and cellular components of the mandibular condylar cartilage (MCC). This manuscript describes methods for analyzing these changes and a method for altering the loading of the TMJ in mice (i.e., compressive static TMJ loading). The structural evaluation illustrated here is a simple morphometric approach that uses the Digimizer software and is performed in radiographs of small bones. In addition, the analysis of cellular changes leading to alterations in collagen expression, bone remodeling, cell division, and proteoglycan distribution in the MCC is described. The quantification of these changes in histological sections - by counting the positive fluorescent pixels using image software and measuring the distance mapping and stained area with Digimizer - is also demonstrated. The methods shown here are not limited to the murine TMJ, but could be used on additional bones of small experimental animals and in other regions of endochondral ossification.

This manuscript presents methods for analyzing morphometric and cellular changes within the mandibular condyle of rodents.

Un método de análisis celular para el cóndilo Mandibular murino y morfométricos

The temporomandibular joint (TMJ) has the capacity to adapt to external stimuli, and loading changes can affect the position of condyles, as well as the ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

Análisis de la función de célula Beta usando proyección de imagen de resolución sola célula calcio en islotes de pez cebra

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, host-symbiont interactions, speciation, and venom synthesis. Despite the availability of several molecular tools, including CRISPR/Cas9, functional genetic studies are still limited in this organism. The major limitation of applying CRISPR/Cas9 technology in N. vitripennis stems from the challenges of embryonic microinjections. Injections of embryos are particularly difficult in this organism and in general in many parasitoid wasps, due to small embryo size and the requirement of a host pupa for embryonic development. To address these challenges, Cas9 ribonucleoprotein complex delivery into female&#160;ovaries by adult injection, rather than embryonic microinjection, was optimized, resulting in both somatic and heritable germline edits. The injection procedures were optimized in pupae and female wasps using either ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) or BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). These methods are shown to be effective alternatives to embryo injection, enabling site-specific and heritable germline mutations.

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Here, we describe methods for efficient pupal and adult injections in Nasonia vitripennis as accessible alternatives to embryo microinjection, enabling functional analysis of genes of interest using either RNA-silencing via RNA interference (RNAi) or gene knockout via CRISPR/Cas9 genome editing.

Inyecciones pupales y para adultos para RNAi y edición de genes CRISPR en Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...