この作品は、VAへのアントワープ大学から博士課程の交わりによってサポートされていました。 KSへフランダース科学財団（FWO、11ZI916N）から博士課程の交わり。 FWO（G0D0514N）からプロジェクト助成金。協調研究活動（GOA）研究助成金、アントワープ大学の研究会から「葉の形態形成のシステムバイオロジーのアプローチ」。そして、大学間アトラクションGTSBハンAsard、Bulelani L. Sizaniと浜田AbdElgawadにベルギー連邦科学政策室（BELSPO）からポーランド（IUAP VII / 29、MARS）、「トウモロコシやシロイヌナズナ根と成長を撃つには、「すべてのビデオに貢献します。

注：運動学的分析のための以下のプロトコールは、定常状態の成長中の葉にのみ有効です。これは、数日間6の期間中に安定した葉の伸び率とセル長と葉の拡大の空間パターンを意味します。 1.植物の成長と葉の伸び率の測定（LER） <ol><li>定常状態の成長の葉や関心の発達段階を選択してください。 注：同一の軸上に連続した葉に類似の空間パターンを意味し、定常状態の成長および繰り返し成長の差があります。苗の成長の初期段階では、連続した葉は、通常、成長ゾーン7の大型化にますます速くによる成長します。少数の高い葉の位置が同様の成長パターン8を持つことができますが、これは調査中での処理によって影響を受ける可能性がある過渡的な段階です。行及びTRとを比較することが重要です<html>それは異なる時間で開発することができるにもかかわらず、厳密に同じ葉位にeatments。でも一定の伸び率で、成長率プロファイルは、必ずしも異なる発生段階で同じではありません。したがって、典型的には、出芽後の日数によって定義された同じ発達段階8で葉を分析することが重要です。 </li><li>単子葉植物で葉の成長の完全な運動学的分析を実行するには、成長の部屋で制御された条件下で各治療と遺伝子型のため、少なくとも15植物を育てます。 </li><li>当時関心の葉は、（周囲の葉の渦巻きから出現）が表示され、葉が完全に展開されるまで（ 図1I）定規で毎日葉の長さの測定を開始します。葉長、葉の先端に土壌レベルからの長さを意味します。これは、その成長を変えるかもしれないので、破損したり、葉を傷つけないように注意してください。 </li></ol>1再 &quot;SRC =&quot; /ファイル/ ftp_upload / 54887 / 54887fig1.jpg &quot;/&gt; 図1：トウモロコシの葉の運動学的分析の概略関心の葉は、葉の伸長率（LER）を計算するために3日間連続定規で測定されます。その後、葉を収穫し、三センチセグメントが分裂組織のサイズを決意するために使用されます。これは、DAPI染色後の最も遠位の有糸分裂の図をベースまでの長さを測定することによって行われます。 （A）増殖性有糸分裂像の実施例、（B）造形有糸分裂像。ミッド静脈の反対側の葉の基部から最初の11センチセル長測定のための1001年センチのセグメントを切断するために使用されています。これらの測定は、成熟細胞の長さ（L マット ）および分裂組織（ リットルDIV）を残して、細胞の長さを決定するように機能するセルの長さのプロファイルを作成するための基礎を提供します。ザ<eLのDIV およびL マーは、分裂組織（N マー ）中の細胞の数を計算するために使用されるM&gt; LER 及びL マットは 、細胞産生率（P）を計算するために使用されます。次に、PおよびN マーは、細胞周期の継続時間（T c）がの逆数の平均細胞分裂速度（D）を計算するために使用されます。同じ色の矢印は、これらの矢印で次のパラメータを計算するために使用されるパラメータを示します。スケールバー=40μmの。ローマ数字は、プロトコルに記載された特定の実験手順を参照するために使用されている。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54887/54887fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 2.収穫<ol><li>関心（ 例えば、出芽後三日目）の発達段階では、少なくとも5つの代表的なPを選択運動学的分析を実施する上でバッチからlants。最後の葉の長さを決定するために、ステップ1.3で説明したように、植物の残りの部分を測定続けます。 </li><li>植物の地上部分をカットします。無傷の分裂部分を維持するために、（ 図1II）の根にできるだけ近いを切りました。 </li><li>外側の葉から出発して、静かにそれらを一つずつをアンロールすることにより、関心の葉までのすべての葉を削除します。必要に応じて、葉を分離するためにベースからいくつかの余分なミリメートルを削除します。また興味深いの葉（ 図1iii）で囲まれた頂点と小さな葉を取り除きます。 </li><li>中間静脈の一方の側にベースから出発し、3センチセグメントを切断し、3を充填した1.5 mlの試験管に保存：1（V：V）無水エタノール：酢酸溶液（注意：手袋を着用する）に数ヶ月に24時間のアップのために4℃（ 図1iv）。このセグメントは、後に分裂組織の長さを決定するために使用されます。 </li><li>から静脈の反対側は、ベースから11センチメートルセグメントをカットし（ 図1 V）および顔料（ 図1のvi）を除去するために、少なくとも6時間、4℃で無水エタノールを充填した15mlチューブに入れてください。 注：その後、（説明を参照）セル長プロファイルを決定するためにのみ最初の10センチ使用しています。 </li><li>少なくとも24時間（ 図1vi）、4℃での洗浄の別のラウンドのために無水エタノールを更新。 </li><li>最後に、純粋な乳酸と無水エタノールに置き換えて（注意：手袋を着用）クリーニングと保管のために4℃で24時間、またはさらに使用する（ 図1vi）まで。 </li></ol> 3.分裂組織の長さの測定<ol><li> 50 mMの塩化ナトリウム（NaCl）、5mMのエチレンジアミン四酢酸を含有するリンス緩衝液を調製する（EDTA;注意：手袋を着用）および10mMトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸（TRIS-HClを、pHが7）。 </li><li>セクション2.4から3センチメートルセグメントを取るので、20分（ 図1vii）用のバッファでそれをのk。 </li><li>待っている間、氷上、暗所でそれを維持する、を1μg/ mlの4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）染色溶液を調製するためにすすぎバッファを使用。 </li><li> DAPI染色溶液中で2~5分間分裂組織セグメントを配置することによって核を染色します。氷の上で、暗い（ 図1vii）で働いています。 </li><li>すぐに顕微鏡ガラス上のセグメントをマウントし、カバーガラスで覆うことにより、蛍光シグナルを確認してください。基礎となる細胞層はいけないしながら、表皮細胞は、蛍光を示すべきです。 </li><li>染色が十分でない場合、いくつかの余分な分間DAPI染色溶液中にバックセグメントを入れます。 </li><li>染色を停止するには、カバーガラスと顕微鏡スライドとカバーにバッファをすすぐのドロップセグメントをマウントします。 </li><li>約1,000表皮の可視化を可能にする、20X倍率でのUV蛍光を備えた顕微鏡を使用してくださいアル細胞を一度に。セグメント全体でスクロールして、増殖性有糸分裂像（中期、後期、終期、および細胞質分裂）を探し、途上気孔（ 図1viii）の造形細胞分裂を回避する9。最も遠位の有糸分裂の数字が配置されている場所を定義します。 </li><li>葉のベースと最も遠位の表皮の有糸分裂の数字の間の距離を測定することによって、分裂組織の長さを決定します。画像フレームの全長を測定するために、画像解析ソフトウェア（ 例えば、ImageJの）を使用します。 <ol><li> （葉の根元から最も遠位の有糸分裂の図のように）完全な分裂組織の長さをカバーするフレームの数をカウントし、完全な分裂組織長（ 図1ix）を得るために、1フレームの長さによって、この数を乗算します。 </li></ol></li></ol> 4.セル長プロフィール<ol><li>乳酸（ステップ2.5）に格納されているセグメントを取り、ベンチに慎重に置きます。セグメントのウィットをカット1センチメートル各（ 図1×）の10セグメントにおけるヘクタールメス。 </li><li>乳酸の小滴に顕微鏡スライド上の連続した葉切片をマウントします。一貫向軸または背軸面を上のいずれかに直面することを確認します。原理的には、特定の側には優先順位がありません。 </li><li>葉の基部から始まって、セグメントを分析するために微分干渉コントラスト（DIC）光学系を備えた顕微鏡を使用してください。一貫して同じ細胞型を選択するために画像解析ソフトウェアを用いて気孔ファイルに直接隣接したファイル内の少なくとも20の反復の表皮細胞の長さを測定します。 <ol><li>セグメント（セグメントで十分あたり4箇所）のそれぞれに沿って等間隔の位置でこれを行い、そして葉（ 図1xi）を通じて、各測定のための対応する位置を書き留めてください。 </li></ol></li><li>局所多項式平滑pを用いて、葉軸に沿って各ミリにおける平均セル長を決定しますrocedure、R-スクリプト（;補足ファイル1 図1xii）に実装されています。 注：R-スクリプトはスムージングの増加に伴う一連のデータを提供します。必要な平滑化の量は、ある程度任意であり、理想的にはちょうど地元のノイズを除去するが、全体的な曲線に影響を及ぼさないはずです。一つの実験内の全てのサンプルについてスムージングの同じ量を使用してください。 </li><li>植物間の各位置でのセル長を平均葉の軸に沿った細胞の長さプロファイルを作成するための標準誤差を計算します。 </li></ol>機構パラメータの5.計算（補足ファイル2を参照してください） <ol><li> （ステップ1.3と同様に、例えば、24時間、）は、2つの連続する時点間葉の長さの変化を取得し、時間間隔で割ることにより、LERを計算します。 </li><li>細胞が成熟したCEの95％に達する、ベースからの位置の遠位に対応する成長ゾーン（LのGZ）の長さを計算します平滑化セル長プロファイル上のLL長。 <ol><li>その位置（ 図2）は、次の平滑セル長分布の各位置のすべてのセルの長さの平均の95％を取ります。 </li><li>各位置で計算された95％の細胞の長さを有する平滑細胞長（ステップ4.4）を比較します。 （;補足データ2を図2を参照）、葉の基部から開始し、成長ゾーンは、実際のセルの長さは、次のセルの長さの95％に等しい位置で終了します。 </li></ol></li></ol><img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54887/54887fig2.jpg" /> 図2：成長ゾーンの終了を決定する分裂組織：赤い星で示す位置で、実際のセルサイズは、95％（赤点線）よりも小さい全てのセルの平均セルサイズのこの位置以下の（赤色の固体ライン）。成長ゾーン（LのGZの終わり;、abで示されていますLUEスター）は、この位置以下のすべてのセルの平均セルサイズ（青の実線）の95％（点線青線）は、実際のセルサイズに等しい位置しています。分割領域（D）、延伸ゾーン（E）、および成熟領域（M）。破線の矢印は、地元の大きさや葉の先端までの基礎の位置から移動した葉の先端部全体の平均サイズの95％の間の収束を示す。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54887/54887fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <ol start="3"><li>成長ゾーン（LのGZ）の長さと分裂組織の大きさ（;ステップ3で決定したLのマー ）との差として伸長領域（L エル ）の長さを計算します。 </li><li>成熟したゾーン内の平均セル長として成熟細胞の長さ（L マット）を計算します 。 </li><li>取得するには、l マットによってLERを割り細胞産生速度（P）。 </li><li> NのGZとN マーとの差である伸長領域（N エル ）のセルの数を計算します。分裂組織（N マー ）での細胞の数は、分裂組織に対応する間隔で位置する細胞の累積数に等しいです。成長ゾーン（NのGZ）中の細胞の数は、成長ゾーンに対応する間隔で位置する細胞の累積数に等しいです。 </li><li> P / Nのマーとして平均細胞分裂速度（D）を計算します 。細胞周期の継続時間（T c）は 、LN（2）/ Dに等しいです。 </li><li> PでN エルを分割することにより伸長領域（T エル ）で時間を計算します。分割ゾーン内の時間は、ログ2（N マー ）* T cを等しくなります。分裂組織を離れる細胞の長さ（L divの ）分裂組織の終わりに平滑化セル長プロファイルからセル長に等しいです。 </li><li> LN（ リットルマット ）-ln（ リットルdivの ）] / T エル ：平均以下の式を用いて細胞増殖率（R エル）を計算します 。 </li></ol>

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

トウモロコシの葉の完全な運動学的分析は葉の成長の細胞基盤の決意を可能にし、効率的なサンプリング戦略を設計することができます。プロトコルは比較的簡単ですが、いくつかの注意が次の重要なステップで推奨されている：分裂組織の長さの決意（ステップ3）が完了を必要とするため、（1）分裂組織に損傷を与えることなく、若い、同封の葉（ステップ2.3）を取り外すことが重要で?...

成長の分析は、一般的に環境要因への遺伝子型決定の成長の違いおよび/または表現型の応答を記述するために、植物の科学者によって使用されている一連のツールに依存します。彼らは、サイズと重量植物全体または器官の測定と成長の基礎となるメカニズムを探求する成長率の計算を含みます。臓器成長は細胞分裂および細胞レベルで膨張することによって決定されます。そのため、成長中のこれらの2つの方法の定量化を含めて、全体の臓器の成長1の違いを理解する鍵と分析しています。これにより、非専門の研究所によって使用することが比較的容易である細胞の成長パラメータを決定するための適切な方法を有することが重要です。 キネマティック解析はすでに臓器成長モデル2の開発のための強力なフレームワークを提供するアプローチとして確立されています。技術は線形システム用に最適化されました、このようなシロイヌナズナの根と単子葉植物の葉などが、また、このような双子葉葉3のような非線形システムのため。今日では、この方法はますますどの遺伝子、ホルモン、発達研究するために使用され、環境要因が、様々な器官（ 表1）に細胞分裂および増殖に影響を与えます。制限は、植物材料のより高い量を必要とする技術（ 例えば、代謝産物のための器官の大きさ及び空間的構成によって課すことができるが、また、それはまた、その基礎となる生化学分子、および生理学的規則（ 表2）に細胞プロセスをリンクするためのフレームワークを提供します測定、プロテオミクス、 など ）。 例えば、トウモロコシ（ トウモロコシ ）の葉、単子葉葉は、順次成熟に到達するために分裂組織と伸びゾーンを通過し、細胞が先端に向かって葉の基部から移動する線形システムを表しますゾーン。これは、成長4の空間パターンの定量的研究のための理想的なモデルシステムになります。また、トウモロコシの葉は、大きな成長ゾーン（数センチメートル5に及ぶ分裂組織と伸びゾーン）を持っているし、他の組織レベルでの研究の可能性を提供します。これは、分子技術、生理学的測定、および細胞生物学のアプローチ（ 表2）の範囲で運動学的分析により定量化し、細胞分裂と拡張を制御する（推定）調節機構の調査を可能にします。 ここでは、単子葉植物の葉に運動学的解析を行うためのプロトコルを提供します。まず、葉軸に沿った位置とどのように運動学的パラメータを計算するの関数として細胞分裂と細胞伸長の両方の適切な分析を行う方法について説明します。第二に、我々はまた、このサンプリングの設計のための基礎として使用することができる方法を示します。高解像度のサンプリングAN：ここでは、2例を議論しますdはそれぞれ、改善されたデータの解釈と時間/お金の節約を可能にする、サンプリングを集中しました。 動の表1.概要は、細胞分裂と様々な臓器の拡大を定量化するための方法を分析します。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> 器官 </td><td> 参照 </td></tr><tr><td>単子葉植物の葉</td><td> 16、20、21、22 </td></tr><tr><td>根の先端</td><td> 2、23、24、25、26、27、28、29 </td></tr><tr><td>双子葉植物の葉</td><td> 21、30、31 </td></tr><tr><td>頂端分裂組織を撃ちます</td><td> 32 </td></tr></tbody></table> 動の表1.概要は、細胞分裂と様々な臓器の拡大を定量化するための方法を分析します。 分子レベルでそれらの調節に運動学的分析によって定量化細胞プロセスの間に、表2のリンク。様々な種及び臓器における生化学的および分子アッセイからの結果に細胞プロセスの定量化を結ぶ様々な研究への参照。キシログルカンendotransglucosylase（XET）、マロンジアルデヒド（MDA）、サイクリン依存性キナーゼ（CDK）。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54887/54887table2large.jpg" target="_blank">この表の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1670">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Pots</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td style="width:813px;">We use pots with the following measueres, but can be different depending on the treatment/study : bottom diameter: 11cm, opening diameter: 15 cm, height: 12 cm. We grow one maize plant per pot.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Planting substrate</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td>We use potting medium (Jiffy, The Netherlands), but other substrates can be used, depending on treatment/study.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Ruler</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td>An extension ruler that covers at least 1,5 meters is needed to measure the final leaf length of the plants.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Seeds&#160;</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">NA</td>
			<td>Seeds can be ordered from a breeder.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Scalpel</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td style="width:813px;">The scalpel is used during leaf harvesting to detach the leaf of interest from its surrounding leaves and right after harvesting to cut a proper sample for cell length and meristem length measurements.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">15 ml falcon tubes</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td style="width:813px;">The 15 ml falcon tubes are used for storing samples used for cell length measurements during sample clearing with absolute ethanol and lactic acid.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Eppendorf tubes</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td style="width:813px;">The eppendorf tubes are used for storing samples used for meristem length measurements in ethanol:acetic acid 3:1 (v:v) solution.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Gloves</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td>Latex gloves, which protect against corrosive reagents.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td style="width:813px;">CAUTION: Corrosive to metals, category 1 Skin corrosion, categories 1A,1B,1C Serious eye damage, category 1; Flammable liquids, categories 1,2,3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Absolute ethanol</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td style="width:813px;">CAUTION: Hazardous in case of skin contact (irritant), of eye contact (irritant), of inhalation. Slightly hazardous in case of skin contact (permeator), of ingestion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Lactic acid &#62;98%</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td>CAUTION: Corrosive to metals, category 1 Skin corrosion, categories 1A,1B,1C Serious eye damage, category 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td style="width:813px;">CAUTION: Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), category 4 Skin irritation, category 2 Eye irritation, category 2 Skin sensitisation, category 1 Specific Target Organ Toxicity &#8211; Single exposure, category 3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride (Tris-HCl)</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td style="width:813px;">This material can be an irritant, contact with eyes and skin should be avoided. Inhalation of dust may be irritating to the respiratory tract.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">4&#8242;,6-Diamidine-2&#8242;-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td style="width:813px;">Cell permeable fluorescent minor groove-binding probe for DNA. Causes skin irritation. May cause an allergic skin reaction. May cause respiratory irritation.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Ice</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">NA</td>
			<td>The DAPI solution has to be kept on ice.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Fluorescent microscope</td>
			<td>AxioScope A1, Axiocam ICm1 from Zeiss or other</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td>Any fluorescent microscope can be used for determining meristem length.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Microscopic slide</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Cover glass</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Tweezers</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td style="width:813px;">Tweezers are needed for unfolding the rolled maize leaf right after harvesting in order to cut a proper sample for cell length and meristem length measurements.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Image-analysis software</td>
			<td>Axiovision (Release 4.8) from Zeiss</td>
			<td style="width:209px;">NA</td>
			<td style="width:813px;">The software can be downloaded at: http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/axiovision.html. Other softwares such as ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) could be used as well.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Microscope equipped with DIC</td>
			<td>AxioScope A1, Axiocam ICm1 from Zeiss or other</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td>Any&#160; microscope, equipped with differential interference contrast (DIC) can be used to measure cell lengths.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">R statistical analysis software</td>
			<td>R Foundation for Statistical Computing</td>
			<td style="width:209px;">NA</td>
			<td>Open source; Could be downloaded at https://www.r-project.org/</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:315px;">R script</td>
			<td style="width:333px;">NA</td>
			<td style="width:209px;">NA</td>
			<td style="width:813px;">We use the kernel smoothing function locpoly of the Kern Smooth package (Wand MP, Jones MC.&#160; Kernel Smoothing: Chapman &#38; Hall/CRC (1995)). The script is available for Mac and Windows upon inquire with the corresponding author. We have versions for Mac and Windows.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

kinematic analysis of cell division and expansion: quantifying the cellular basis of growth and sampling developmental zones in zea mays leaves

Growth analyses are often used in plant science to investigate contrasting genotypes and the effect of environmental conditions. The cellular aspect of these analyses is of crucial importance, because growth is driven by cell division and cell elongation. Kinematic analysis represents a methodology to quantify these two processes. Moreover, this technique is easy to use in non-specialized laboratories. Here, we present a protocol for performing a kinematic analysis in monocotyledonous maize (Zea mays) leaves. Two aspects are presented: (1) the quantification of cell division and expansion parameters, and (2) the determination of the location of the developmental zones. This could serve as a basis for sampling design and/or could be useful for data interpretation of biochemical and molecular measurements with high spatial resolution in the leaf growth zone. The growth zone of maize leaves is harvested during steady-state growth. Individual leaves are used for meristem length determination using a DAPI stain and cell-length profiles using DIC microscopy. The protocol is suited for emerged monocotyledonous leaves harvested during steady-state growth, with growth zones spanning at least several centimeters. To improve the understanding of plant growth regulation, data on growth and molecular studies must be combined. Therefore, an important advantage of kinematic analysis is the possibility to correlate changes at the molecular level to well-defined stages of cellular development. Furthermore, it allows for a more focused sampling of specified developmental stages, which is useful in case of limited budget or time.

ここで、我々は彼らの葉の成長の面ではよく水やり植物（対照、54％土壌水分量、（SWC））と乾燥ストレス条件に付し植物（干ばつ、34％SWC）間の比較を示します。すべての植物は、制御された条件（16時間の日/ 8時間の夜、25℃/ 18℃の昼/夜、300-400μEm-2秒-1光合成有効放射（PAR）の下で成長チャンバー中で増殖させた。干ばつ正しいSWCに達した後、さ?...

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Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

Quantifying cell division and expansion is of crucial importance to the understanding of whole-plant growth. Here, we present a protocol to calculate cellular parameters determining maize leaf growth rates and highlight the use of these data for investigating molecular growth regulatory mechanisms by directing developmental stage-specific sampling strategies.

細胞分裂と拡張の動解析：成長とサンプリング発達ゾーンの細胞基礎での定量化<em&gt;トウモロコシ</em&gt;葉

Growth analyses are often used in plant science to investigate contrasting genotypes and the effect of environmental conditions. The cellular aspect of ...

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Biology

Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

10.8K ビュー.  University of Antwerp. Quantifying cell division and expansion is of crucial importance to the understanding of whole-plant growth. Here, we present a protocol to calculate cellular parameters determining maize leaf growth rates and highlight the use of these data for investigating molecular growth regulatory mechanisms by directing developmental stage-specific sampling strategies. 

ビデオ: Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer software.  Video bioinformatics is a powerful quantitative approach for extracting spatio-temporal data from video images using computer software to perform dating mining and analysis. In this article, we introduce a video bioinformatics method for quantifying the growth of human embryonic stem cells (hESC) by analyzing time-lapse videos collected in a Nikon BioStation CT incubator equipped with a camera for video imaging. In our experiments, hESC colonies that were attached to Matrigel were filmed for 48 hours in the BioStation CT.  To determine the rate of growth of these colonies, recipes were developed using CL-Quant software which enables users to extract various types of data from video images.  To accurately evaluate colony growth, three recipes were created. The first segmented the image into the colony and background, the second enhanced the image to define colonies throughout the video sequence accurately, and the third measured the number of pixels in the colony over time.  The three recipes were run in sequence on video data collected in a BioStation CT to analyze the rate of growth of individual hESC colonies over 48 hours. To verify the truthfulness of the CL-Quant recipes, the same data were analyzed manually using Adobe Photoshop software. When the data obtained using the CL-Quant recipes and Photoshop were compared, results were virtually identical, indicating the CL-Quant recipes were truthful. The method described here could be applied to any video data to measure growth rates of hESC or other cells that grow in colonies. In addition, other video bioinformatics recipes can be developed in the future for other cell processes such as migration, apoptosis, and cell adhesion.  

Video bioinformatics is the automated processing, analysis, understanding, and data mining of biological spatio-temporal data extracted from microscopic videos. The purpose of this article is to demonstrate a method for measuring human embryonic stem cell colony growth using a video bioinformatics method.

ヒト胚性幹細胞のコロニーの成長のビデオバイオインフォマティクス解析

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

生物学

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

のためのシステム<em&gt; ex vivoで</em胚膵臓&gt;培養

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Flow cytometry has been widely used to obtain information about DNA content in a population of cells, to infer relative percentages in different cell cycle phases. This technique has been successfully extended to the mitotic tissues of the model organism Drosophila melanogaster for genetic studies of cell cycle regulation in vivo. When coupled with cell-type specific fluorescent protein expression and genetic manipulations, one can obtain detailed information about effects on cell number, cell size and cell cycle phasing in vivo. However this live-cell method has relied on the use of the cell permeable Hoechst 33342 DNA-intercalating dye, limiting users to flow cytometers equipped with a UV laser. We have modified this protocol to use a newer live-cell DNA dye, Vybrant DyeCycle Violet, compatible with the more common violet 405nm laser. The protocol presented here allows for efficient cell cycle analysis coupled with cell type, relative cell size and cell number information, in a variety of Drosophila tissues. This protocol extends the useful cell cycle analysis technique for live Drosophila tissues to a small benchtop analyzer, the Attune Acoustic Focusing Cytometer, which can be run and maintained on a single-lab scale.

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

A protocol for cell cycle analysis of live Drosophila tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer is described. This protocol simultaneously provides information about relative cell size, cell number, DNA content and cell type via lineage tracing or tissue specific expression of fluorescent proteins in vivo.

の生細胞サイクル分析<em&gt;ショウジョウバエ</em同調させるアコースティック·フォーカスサイトメーターとVybrant DyeCycleバイオレットDNA染色を使用して&gt;組織

Flow cytometry has  been widely used to obtain information about DNA content in a population of  cells, to infer relative percentages in different cell ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

精子形成細胞学的分析：ライブとの固定の準備<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;精巣

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force used to pump blood. Individual cardiomyocytes were first isolated over 40 years ago in order to better study the physiology and structure of heart muscle. Techniques have rapidly improved to include enzymatic digestion via coronary perfusion. More recently, analyzing the contractility and calcium flux of isolated myocytes has provided a vital tool in the cellular and sub-cellular analysis of heart failure. Echocardiography and EKGs provide information about the heart at an organ level only. Cardiomyocyte cell culture systems exist, but cells lack physiologically essential structures such as organized sarcomeres and t-tubules required for myocyte function within the heart. In the protocol presented here, cardiomyocytes are isolated via Langendorff perfusion. The heart is removed from the mouse, mounted via the aorta to a cannula, perfused with digestion enzymes, and cells are introduced to increasing calcium concentrations. Edge and sarcomere detection software is used to analyze contractility, and a calcium binding fluorescent dye is used to visualize calcium transients of electrically paced cardiomyocytes; increasing understanding of the role cellular changes play in heart dysfunction. Traditionally used to test drug effects on cardiomyocytes, we employ this system to compare myocytes from WT mice and mice with a mutation that causes dilated cardiomyopathy. This protocol is unique in its comparison of live cells from mice with known heart function and known genetics. Many experimental conditions are reliably compared, including genetic or environmental manipulation, infection, drug treatment, and more. Beyond physiologic data, isolated cardiomyocytes are easily fixed and stained for cytoskeletal elements. Isolating cardiomyocytes via perfusion is an extremely versatile method, useful in studying cellular changes that accompany or lead to heart failure in a variety of experimental conditions.

Individual cardiomyocytes from wild type and mutant mice can be isolated from the heart in order to study their contractility and calcium transients. This allows characterization of the contribution of cellular dysfunction to heart dysfunction from any cause.

マウス心筋細胞の単離と生理解析

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

β-カテニンの分解にの再構成<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;卵抽出

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here protocols are presented for preparing embryos and adult C. elegans animals for short- and long-term time-lapse microscopy and methods for tracking and quantification of developmental processes. The methods presented are all based on C. elegans strains available from the Caenorhabditis Genetics Center and on open-source software that can be easily implemented in any laboratory independently of the microscopy system used. A reconstruction of a 3D cell-shape model using the modelling software IMOD, manual tracking of fluorescently-labeled subcellular structures using the multi-purpose image analysis program Endrov, and an analysis of cortical contractile flow using PIVlab (Time-Resolved Digital Particle Image Velocimetry Tool for MATLAB) are shown. It is discussed how these methods can also be deployed to quantitatively capture other developmental processes in different models, e.g., cell tracking and lineage tracing, tracking of vesicle flow.

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.

の発達過程を追跡し、定量化<em&gt; C。エレガンス</em&gt;オープンソースのツールを使用しました

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

A Morphometric and Cellular Analysis Method for the Murine Mandibular Condyle

The temporomandibular joint (TMJ) has the capacity to adapt to external stimuli, and loading changes can affect the position of condyles, as well as the structural and cellular components of the mandibular condylar cartilage (MCC). This manuscript describes methods for analyzing these changes and a method for altering the loading of the TMJ in mice (i.e., compressive static TMJ loading). The structural evaluation illustrated here is a simple morphometric approach that uses the Digimizer software and is performed in radiographs of small bones. In addition, the analysis of cellular changes leading to alterations in collagen expression, bone remodeling, cell division, and proteoglycan distribution in the MCC is described. The quantification of these changes in histological sections - by counting the positive fluorescent pixels using image software and measuring the distance mapping and stained area with Digimizer - is also demonstrated. The methods shown here are not limited to the murine TMJ, but could be used on additional bones of small experimental animals and in other regions of endochondral ossification.

This manuscript presents methods for analyzing morphometric and cellular changes within the mandibular condyle of rodents.

形態とマウスの下顎頭軟骨細胞解析法

The temporomandibular joint (TMJ) has the capacity to adapt to external stimuli, and loading changes can affect the position of condyles, as well as the ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

ゼブラフィッシュ ランゲルハンス島における単一セルの解像度カルシウム イメージングを用いた β-細胞機能の解析

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, host-symbiont interactions, speciation, and venom synthesis. Despite the availability of several molecular tools, including CRISPR/Cas9, functional genetic studies are still limited in this organism. The major limitation of applying CRISPR/Cas9 technology in N. vitripennis stems from the challenges of embryonic microinjections. Injections of embryos are particularly difficult in this organism and in general in many parasitoid wasps, due to small embryo size and the requirement of a host pupa for embryonic development. To address these challenges, Cas9 ribonucleoprotein complex delivery into female&#160;ovaries by adult injection, rather than embryonic microinjection, was optimized, resulting in both somatic and heritable germline edits. The injection procedures were optimized in pupae and female wasps using either ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) or BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). These methods are shown to be effective alternatives to embryo injection, enabling site-specific and heritable germline mutations.

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Here, we describe methods for efficient pupal and adult injections in Nasonia vitripennis as accessible alternatives to embryo microinjection, enabling functional analysis of genes of interest using either RNA-silencing via RNA interference (RNAi) or gene knockout via CRISPR/Cas9 genome editing.

ナソニアビトリペニスにおけるRNAiおよびCRISPR遺伝子編集のためのプパルおよび成人注射

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...