Name: kinematic analysis of cell division and expansion: quantifying the cellular basis of growth and sampling developmental zones in zea mays leaves
Uploaded: 2016-12-02T11:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
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이 작품은 VA에 앤트워프 대학에서 박사 친교에 의해 지원되었다; KS에 플랑드르 과학 재단 (FWO, 11ZI916N)에서 박사 교제; FWO (G0D0514N)에서 프로젝트 보조금; 공동의 연구 활동 (GOA) 연구 보조금, 앤트워프 대학의 연구위원회에서 &quot;잎 형태 형성의 시스템 생물학 접근&quot;; 그리고 Interuniversity 매력 폴란드 (IUAP VII / 29, MARS), 모든 비디오에 기여 GTSB 한 Asard, Bulelani L. Sizani과 하마다 AbdElgawad에 벨기에 연방 과학 정책 사무실 (BELSPO)에서 &quot;옥수수와 애기 장대 뿌리와 성장을 쏴&quot; .

참고 : 운동 학적 분석을 위해 다음 프로토콜은 정상 상태 성장하는 동안 잎에만 유효합니다. 이것은 몇 일 (6)의 기간 동안 안정한 잎의 신장 속도와 셀 길이와 리프 팽창 공간 패턴을 의미한다. 1. 식물 성장과 잎 신장 속도의 측정 (LER) <ol><li> 정상 상태의 성장에 잎과 관심의 발달 단계를 선택합니다. 참고 : 동일한 축의 연속 잎 유사한 공간 패턴을 의미 정상 성장 및 반복적 성장의 차이가있다. 묘목 성장의 초기 단계 동안, 연속 된 잎은 일반적으로 성장 영역 (7)의 크기를 증가시키는 것이 점점 더 빠른 증가로 인해. 약간 높은 위치 리프 유사한 성장 패턴 (8)이있을 수 있지만,이 연구중인 치료제에 의해 영향을받을 수있는 과도 단계이다. 라인과 TR을 비교하는 것이 중요<html> 그것은 다른 시간에 개발 될지라도, 엄격하게 동일한 위치에서 리프 eatments. 비록 일정한 신장 속도로 성장 속도 프로파일은 반드시 상이한 발달 단계에서 동일하지 않다. 따라서, 일반적으로 출현 후 일수에 의해 정의 된 동일한 발달 단계 8에서 잎을 분석하는 것이 중요하다. </li><li> 성장 룸에서 통제 된 조건 하에서 각각의 치료 및 유전자형 적어도 15 식물을 성장, 외떡잎에 잎 성장의 전체 운동 학적 분석을 수행합니다. </li><li> 잎이 완전히 (그림 1I) 확장 될 때까지 관심의 잎 (주변 잎의 가마에서 출현)가 나타납니다 당시 통치자 매일 잎의 길이를 측정하기 시작합니다. 리프 길이 판의 선단에 오물 레벨까지의 길이를 의미한다. 이 성장을 변경할 수 있으므로, 휴식 또는 잎이 손상되지 않도록주의하십시오. </li></ol>1 다시 &quot;SRC =&quot;/ 파일 / ftp_upload / 54887 / 54887fig1.jpg &quot;/&gt; 그림 1 :. 옥수수 잎의 운동 학적 분석의 도식 개요는 관심의 잎은 잎 신장 비율 (LER)를 계산하는 세 가지 일 연속 통치자로 측정된다. 그 후, 리프 수확되고 세 cm 세그먼트는 분열 크기의 결정에 사용된다. 이것은 DAPI 염색 후 가장 말단 유사 분열의 그림을베이스까지의 길이를 측정하여 수행됩니다. 증식 유사 분열 수치와 (B) 조형 유사 분열 수치의 (A) 예. 중간 정맥의 다른 쪽 판베이스에서 제 십일cm은 셀 길이를 측정 한 10 상자 cm 세그먼트를 절단하는 데 사용된다. 이러한 측정은 성숙한 세포의 길이 (L 메트) 및 분열 (패 DIV)를 떠나는 셀의 길이를 결정하는 역할을 셀 길이 프로파일을 생성하기위한 기초를 제공한다. 그만큼 <e패 DIV 및 L 메르가 분열 조직 (N 메르) 세포의 수를 계산하는데 사용되지만 m&gt; LER 및 L 매트는 전지 생산 속도 (P)을 계산하기 위해 사용된다. 차례로, P 및 N 메르 세포주기의 기간 (T의 c)의 역수이다 평균 셀 분할 률 (D)을 계산하는 데 사용된다. 동일 컬러의 화살표는이 화살표 다음의 파라미터를 계산하는데 사용되는 매개 변수를 나타낸다. 스케일 바는 40 μm의 =. 로마 숫자는 프로토콜에 설명 된 특정 실험 절차를 참조하는 데 사용됩니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54887/54887fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 2. 수확 <ol><li> 관심의 발달 단계에서 (예를 들어, 출현 후 셋째 날), 적어도 다섯 대표 쪽을 선택배치에서 lants이되는 운동 학적 분석을 수행합니다. 마지막 잎의 길이를 결정하는 단계 130에서 설명한 바와 같이 식물의 나머지를 계속 측정. </li><li> 식물의 위 지상 부분을 잘라. 뿌리에 최대한 가깝게 잘라 그대로 (그림 1II을)를 분열 부분을 유지합니다. </li><li> 외부 잎에서 시작, 부드럽게 하나씩 줄이기 모든 관심의 잎까지 잎 제거합니다. 필요한 경우, 잎을 분리 기지에서 몇 가지 추가 밀리미터를 제거합니다. 또한 관심 (그림 1iii)의 잎으로 둘러싸인 정점 작은 잎을 제거 할 수 있습니다. </li><li> 중간 정맥의 일측에 상기베이스부터 3 CM 구간을 잘라, 3 가득 1.5 mL를 시험관에 보관 : 1 (V : V) 무수 에탄올 : 아세트산 용액 (주의 : 장갑을 착용)에서 몇 달에 24 시간까지 4 ° C를 (그림 1iv). 이 세그먼트는 나중에 분열의 길이를 결정하는 데 사용된다. </li><li> 로부터정맥의 다른 측면은,베이스에서 11cm 세그먼트를 잘라 (그림 1 V) 및 안료 (그림 1 VI)를 제거하기 위해 적어도 6 시간 동안 4 ° C에서 무수 에탄올로 가득 15 ML 튜브에 넣습니다. 주 : 나중에, (설명을 참조) 셀 길이 프로파일을 결정하는 첫 번째 10cm를 사용한다. </li><li> 적어도 24 시간 (그림 1vi) 4 ° C에서 청소의 또 다른 라운드의 무수 에탄올을 갱신. </li><li> 마지막으로, 순수 젖산과 무수 에탄올을 대체 (주의 : 장갑을 착용) 청소 및 저장을 위해 4 ° C에서 24 시간 동안 또는 추가 사용 (그림 1vi)까지. </li></ol> 3. 분열 조직 길이 측정 <ol><li> 50 mM 염화나트륨 (NaCl을), 5 mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산이 포함 된 세척 버퍼 준비 (EDTA 단계;주의 : 장갑을 착용) 및 10 mM 트리스 (히드 록시 메틸) 아미노 메탄 - 염산 (트리스 - 염산, pH가 7). </li><li> 2.4 절 등등에서 3cm 세그먼트를 타고20 분 (그림 1vii)에 대한 버퍼를 AK. </li><li> 대기하는 동안, 얼음 및 진한에서 유지 한 μg의 / ㎖ 4 &#39;, 6-diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI) 염색 액을 조제 린스 버퍼를 사용한다. </li><li> DAPI 염색 용액에 2-5 분 동안 분열 조직 세그먼트를 배치하여 핵을 염색. 얼음과 어둠 (그림 1vii)에서 작업 할 수 있습니다. </li><li> 빠르게 현미경 유리에 세그먼트를 장착하고 커버 유리를 덮어 형광 신호를 확인합니다. 표피 세포가있는 동안 기본 세포 층이 안, 형광을 표시해야합니다. </li><li> 염색이 충분하지 않은 경우 일부 여분 분간 DAPI 염색 용액에 다시 넣어 세그먼트. </li><li> , 염색을 중지 커버 유리와 현미경 슬라이드와 커버에 버퍼를 세척 한 방울의 세그먼트를 장착합니다. </li><li> 1,000 epiderm의 시각화를 허용하는 20X의 배율로 UV 형광 장착 된 현미경을 사용하여알 세포를 한 번에. 세그먼트에 걸쳐 스크롤 증식 유사 분열 수치 (중기, anaphase (핵분열 말기), telophase 및 세포질 분열)을 찾아,하지만 개발 기공 (그림 1viii)의 조형 세포 분열을 피하기 9. 가장 말단 유사 분열 그림이있는 위치를 정의합니다. </li><li> 잎의베이스와 가장 후방 표피 유사 분열 지수 사이의 거리를 측정함으로써 분열의 길이를 결정한다. 이미지 프레임의 전체 길이를 측정하는 이미지 분석 소프트웨어 (예 ImageJ에)를 사용한다. <ol><li> (가장 먼 유사 분열의 그림을 판베이스)에서 전체 분열 길이를 커버 프레임 수를 세어 전체 분열 길이 (도 1ix)을 획득 한 프레임의 길이만큼이 값을 곱한다. </li></ol></li></ol> 4. 셀 길이 프로필 <ol><li> 젖산 (단계 2.5)에 저장되어있는 세그먼트를 가지고 벤치에 조심스럽게 놓습니다. 세그먼트 재치를 잘라1cm 각 (그림 1 배)의 10 세그먼트 하는 메스. </li><li> 젖산의 작은 방울의 현미경 슬라이드에 연속 잎 세그먼트를 탑재합니다. 지속적으로 향축 또는 배축면이 위로를 직면해야합니다. 원칙적으로, 특정 측면에 대한 선호가 없습니다. </li><li> 리프베이스부터 세그먼트를 분석하는 미분 간섭 대비 (DIC) 광학계를 구비 한 현미경을 사용한다. 일관 동일한 세포 유형을 선택하기 위해 이미지 분석 소프트웨어와 기공 파일로 직접 인접하는 파일의 적어도 20 복제 표피 세포의 길이를 측정한다. <ol><li> 세그먼트 (세그먼트 충분할 당 4 위치)의 각각을 따라 등 간격 위치에서이 작업을 수행하고, 잎 (그림 1xi)에 걸쳐 각 측정에 해당하는 위치를 기록해야합니다. </li></ol></li><li> 로컬 평활 다항식 ​​P를 사용하여 리프 축을 따라 각 mm의 평균 셀 길이를 결정rocedure,에 R-스크립트 (; 보충 파일 1 그림 1xii)에서 구현. 주 : R-스크립트 매끄럽게 증가하는 일련의 데이터를 제공한다. 필요한 스무딩 양은 단지 로컬 잡음을 제거하지만, 전체적인 곡선에 영향을 미치지 않아야 이상적 다소 임의적이며. 한 실험에서 모든 샘플에 대한 평활화의 동일한 금액을 사용하십시오. </li><li> 식물 사이의 각각의 위치에서의 셀 길이를 평균 판 축을 따라 셀 길이 프로파일을 생성하기 위해 표준 오차를 계산한다. </li></ol> 운동 학적 매개 변수 5. 계산 (보조 파일 2 참조) <ol><li> (단계 130에서와 같이 예를 들면 24 시간) 두 개의 연속 시점 사이 리프 길이의 변화를 고려하여 시간 간격을 분할함으로써 LER을 계산한다. </li><li> 세포가 성숙한 CE의 95 %에 도달 여기서베이스로부터 먼 위치에 대응하는 성장 영역 (L의 GZ)의 길이를 계산평활 셀 길이 프로필에 게요 길이. <ol><li> 그 위치 (도 2) 다음의 모든 셀의 길이의 평균의 평활 셀 길이 프로필 95 %의 각 위치에 가라. </li><li> 각 위치에서 계산 된 95 % 셀 길이의 셀 평활화 길이 (단계 4.4)을 비교한다. (, 보완 데이터 2도 2 참조) 잎의 기부에서 시작하여, 성장 영역은 실제 셀 길이는 다음의 셀의 길이의 95 %를 동일 위치에서 종료한다. </li></ol></li></ol><img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54887/54887fig2.jpg" /> 그림 2. 성장 영역의 종료를 결정하는 분열 조직은 : 적색 별표 표시된 위치에서는, 실제의 셀 크기보다 작은 95 %가이 위치에 따라 모든 셀의 평균 셀 크기 (빨간색 점선) (적색 고체 인 선). 성장 영역 (L의 GZ의 끝, AB로 표시95 %이 위치 (청색 선 다음 모든 셀의 평균 셀 크기의 (점선 파란색 라인)) 실제 셀 크기를 동일 곳 루 스타)에 위치해 있습니다. 분할 영역 (D), 신장 영역 (E), 성숙 영역 (M). 점선 화살표는 로컬 크기와 잎의 끝 부분에 기초 위치에서 이동하는 잎의 선단부의 평균 크기의 95 % 사이의 융합을 나타냅니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54887/54887fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <ol start="3"><li> 성장 영역 (L의 GZ) 및 분열 크기의 길이 차이 등의 연신 존 (L EL)의 길이를 계산한다 (L 메르을, 3 단계에서). </li><li> 성숙한 영역의 평균 셀 길이와 성숙 세포의 길이 (L 매트)를 계산한다. </li><li> 를 얻을 리터 매트에 의해 LER 나눈다셀 생산 률 (P). </li><li> N 및 N의 GZ 메르 차이로 연신 존 (N EL) 세포의 수를 계산한다. 분열 조직 (N 메르) 세포의 수는 분열에 대응 한 간격으로 위치한 셀의 누적 개수와 동일. 성장 영역 (N의 GZ) 세포의 수는 증가 영역에 대응 한 간격으로 위치한 셀의 누적 개수와 동일. </li><li> P의 / N의 메르로서 평균 셀 분할 률 (D)을 계산한다. 세포주기 기간 (T의 C)는 LN (2) / D 같다. </li><li> P가 N EL 나누어 연신 존 (T EL)의 시간을 계산한다. 분할 영역에서 시간은 로그 2 (N 메르) * T의 C 같습니다. 분열 조직을 떠나 세포의 길이 (L의 사업부)분열 조직 끝의 평활 셀 길이 프로필에서 셀 길이 같다. </li><li> LN (L 매트) -ln (리터 사업부)] / T 엘 : 평균 다음 공식을 사용하여 세포의 확장 속도 (R 엘)을 계산합니다. </li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

옥수수 잎 전체 학적 분석 판 성장의 셀룰러 기반의 판정이 가능하고 효율적인 샘플링 전략의 디자인을 허용한다. 프로토콜은 비교적 간단하지만, 몇 가지주의 사항은 다음 중요한 단계 추천 : (1)은 분열 조직의 길이 결정 (3 단계) 때문에, 분열 조직에 손상을주지 않고 젊은, 동봉 된 잎 (2.3 단계) 분리하는 것이 중요합니다 전체가 필요합니다 분열 조직은 존재합니다. 연습은 사전에 필요할 수 있?...

성장 분석은 일반적으로 환경 적 요인에 대한 유전자형 결정 성장의 차이 및 / 또는 표현형의 반응을 설명하기 위해 식물 과학자들에 의해 사용되는 도구 세트에 따라 달라집니다. 그들은 성장의 기본 메커니즘을 탐구하는 크기와 무게 전체 식물의 측정 또는 장기 성장 속도의 계산을 포함한다. 장기 성장은 세포 수준에서 세포 분열과 팽창에 의해 결정된다. 따라서, 분석 성장이 두 프로세스의 정량화를 포함하는 전체 장기 성장 1의 차이를 이해하는 열쇠이다. 따라서, 비 전문 실험실에서 사용하는 것이 상대적으로 쉽다 세포 성장 파라미터를 결정하는 적절한 방법을 위해 중요하다. 운동 학적 분석은 이미 장기 성장 모델이 개발을위한 강력한 프레임 워크를 제공하는 방식으로 설정되어있다. 이 기술은 선형 시스템에 최적화 된,이러한 애기 장대의 뿌리와 잎 외떡잎로서뿐만 아니라, 쌍떡잎 식물 잎 3 비 - 선형 시스템에 대한. 오늘날,이 방법은 점점 방법 유전 호르몬 발달을 연구하는 데 사용되는, 환경 적 인자, 세포 분열 및 다양한 기관에서 팽창 (표 1)에 영향을 준다. 제한이 식물 재료의보다 많은 양을 필요로 기술 (예, 대사 산물에 대한 장기의 크기와 공간적인 조직에 의해 부과 될 수 있지만, 또한, 또한, 그들의 기본적인 생화학 적 분자, 및 생리적 규정 (표 2)에 세포 과정을 연결하는 프레임 워크를 제공한다 측정 프로테오믹스 등). 예컨대 옥수수 (ZEA 메이스) 잎과 같은 외떡잎 잎 순차적 성숙에 도달하는 분열 조직 및 연신 존을 통과하는 세포가 선단을 향해 판의베이스를 이동하는 선형 시스템을 나타내는존. 이는 성장 (4)의 공간 패턴의 정량적 연구 이상적인 모델 시스템 만든다. 또한, 옥수수 잎 (몇 cm (5)에 걸친 분열과 신장 영역) 큰 성장 영역이 다른 조직 수준의 연구에 대한 가능성을 제공합니다. 이 분자 기술, 생리 학적 측정 및 세포 생물학 접근 (표 2)의 범위를 통해 운동 학적 분석에 의해 정량화 세포 분열 및 확장을 제어 (추정) 규제 메커니즘의 조사를 할 수 있습니다. 여기서는 단자엽 나뭇잎의 운동 학적 분석을 수행하기위한 프로토콜을 제공한다. 첫째, 우리는 리프 축의 위치와 얼마나 학적 매개 변수를 계산하는 함수로서 세포 분열과 세포 신장 둘의 적절한 분석을 수행하는 방법을 설명한다. 둘째, 우리는 또한이가 샘플링 디자인의 기초로 사용할 수있는 방법을 보여줍니다. 여기서 우리는 두 가지 사례를 토론 고해상도 샘플링을D는 각각 향상된 데이터 해석 및 시간 / 비용의 절감을 가능하게 샘플링을 집중했다. 운동의 표 1. 개요 세포 분열 및 다양한 기관에서 확장 정량화하는 방법을 분석한다. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> 오르간 </td><td> 참고 </td></tr><tr><td> 외떡잎 잎 </td><td> 16, 20, 21, 22 </td></tr><tr><td> 루트 팁 </td><td> 2, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 </td></tr><tr><td> 쌍떡잎 식물 잎 </td><td> 21, 30, 31 </td></tr><tr><td> 혀끝의 분열 조직을 촬영 </td><td> (32) </td></tr></tbody></table> 운동의 표 1. 개요 세포 분열 및 다양한 기관에서 확장 정량화하는 방법을 분석한다. 분자 수준에서 자신의 규제기구 학적 분석에 의해 정량 세포 과정과 표 2에 연결합니다. 다양한 종 및 기관에서 생화학 및 분자 분석 결과에 세포 프로세스의 정량화를 연결하는 다양한 연구에 대한 참조. 크 실로 글루칸 endotransglucosylase (XET), 말론 디 알데히드 (MDA), 사이클린 의존 키나제 (CDK). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54887/54887table2large.jpg" target="_blank">이 테이블의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>Pots</td><td>Any</td><td>Any</td><td>We use pots with the following measures, but can be different depending on the treatment/study: bottom diameter: 11 cm, opening diameter: 15 cm, height: 12 cm. We grow one maize plant per pot.</td></tr><tr><td>Planting substrate</td><td>Any</td><td>Any</td><td>We use potting medium (Jiffy, The Netherlands), but other substrates can be used, depending on treatment/study.</td></tr><tr><td>Ruler</td><td>Any</td><td>Any</td><td>An extension ruler that covers at least 1.5 meters is needed to measure the final leaf length of the plants.</td></tr><tr><td>Seeds</td><td>Any</td><td>NA</td><td>Seeds can be ordered from a breeder.</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Any</td><td>Any</td><td>The scalpel is used during leaf harvesting to detach the leaf of interest from its surrounding leaves and right after harvesting to cut a proper sample for cell length and meristem length measurements.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>15 mL falcon tubes</td><td>Any</td><td>Any</td><td>The 15 mL falcon tubes are used for storing samples used for cell length measurements during sample clearing with absolute ethanol and lactic acid.</td></tr><tr><td>Eppendorf tubes</td><td>Any</td><td>Any</td><td>The eppendorf tubes are used for storing samples used for meristem length measurements in ethanol:acetic acid 3:1 (v:v) solution.</td></tr><tr><td>Gloves</td><td>Any</td><td>Any</td><td>Latex gloves, which protect against corrosive reagents.</td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Any</td><td>Any</td><td>CAUTION: Corrosive to metals, category 1 Skin corrosion, categories 1A,1B,1C Serious eye damage, category 1; Flammable liquids, categories 1,2,3</td></tr><tr><td>Absolute ethanol</td><td>Any</td><td>Any</td><td>CAUTION: Hazardous in case of skin contact (irritant), of eye contact (irritant), of inhalation. Slightly hazardous in case of skin contact (permeator), of ingestion</td></tr><tr><td>Lactic acid&amp;nbsp;&gt;98%</td><td>Any</td><td>Any</td><td>CAUTION: Corrosive to metals, category 1 Skin corrosion, categories 1A,1B,1C Serious eye damage, category 1</td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Any</td><td>Any</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Any</td><td>Any</td><td>CAUTION: Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), category 4 Skin irritation, category 2 Eye irritation, category 2 Skin sensitisation, category 1 Specific Target Organ Toxicity &amp;ndash; Single exposure, category 3</td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride (Tris-HCl)</td><td>Any</td><td>Any</td><td>This material can be an irritant, contact with eyes and skin should be avoided. Inhalation of dust may be irritating to the respiratory tract.</td></tr><tr><td>4&amp;prime;,6-Diamidine-2&amp;prime;-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td><td>Any</td><td>Any</td><td>Cell permeable fluorescent minor groove-binding probe for DNA. Causes skin irritation. May cause an allergic skin reaction. May cause respiratory irritation.</td></tr><tr><td>Ice</td><td>Any</td><td>NA</td><td>The DAPI solution has to be kept on ice.</td></tr><tr><td>Fluorescent microscope</td><td>AxioScope A1, Axiocam ICm1 from Zeiss or other</td><td></td><td>Any fluorescent microscope can be used for determining meristem length.</td></tr><tr><td>Microscopic slide</td><td>Any</td><td>Any</td><td></td></tr><tr><td>Cover glass</td><td>Any</td><td>Any</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers</td><td>Any</td><td>Any</td><td>Tweezers are needed for unfolding the rolled maize leaf right after harvesting in order to cut a proper sample for cell length and meristem length measurements.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Image-analysis software</td><td>Axiovision (Release 4.8) from Zeiss</td><td>NA</td><td>The software can be downloaded at: http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/axiovision.html. Other softwares such as ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) could be used as well.</td></tr><tr><td>Microscope equipped with DIC</td><td>AxioScope A1, Axiocam ICm1 from Zeiss or other</td><td></td><td>Any microscope, equipped with differential interference contrast (DIC) can be used to measure cell lengths.</td></tr><tr><td>R statistical analysis software</td><td>R Foundation for Statistical Computing</td><td>NA</td><td>Open source; Could be downloaded at https://www.r-project.org/</td></tr><tr><td>R script</td><td>NA</td><td>NA</td><td>We use the kernel smoothing function locpoly of the Kern Smooth package (Wand MP, Jones MC.&amp;nbsp; Kernel Smoothing: Chapman &amp;amp; Hall/CRC (1995)). The script is available for Mac and Windows upon inquiry with the corresponding author.</td></tr></tbody></table>

kinematic analysis of cell division and expansion: quantifying the cellular basis of growth and sampling developmental zones in zea mays leaves

Growth analyses are often used in plant science to investigate contrasting genotypes and the effect of environmental conditions. The cellular aspect of these analyses is of crucial importance, because growth is driven by cell division and cell elongation. Kinematic analysis represents a methodology to quantify these two processes. Moreover, this technique is easy to use in non-specialized laboratories. Here, we present a protocol for performing a kinematic analysis in monocotyledonous maize (Zea mays) leaves. Two aspects are presented: (1) the quantification of cell division and expansion parameters, and (2) the determination of the location of the developmental zones. This could serve as a basis for sampling design and/or could be useful for data interpretation of biochemical and molecular measurements with high spatial resolution in the leaf growth zone. The growth zone of maize leaves is harvested during steady-state growth. Individual leaves are used for meristem length determination using a DAPI stain and cell-length profiles using DIC microscopy. The protocol is suited for emerged monocotyledonous leaves harvested during steady-state growth, with growth zones spanning at least several centimeters. To improve the understanding of plant growth regulation, data on growth and molecular studies must be combined. Therefore, an important advantage of kinematic analysis is the possibility to correlate changes at the molecular level to well-defined stages of cellular development. Furthermore, it allows for a more focused sampling of specified developmental stages, which is useful in case of limited budget or time.

여기, 우리는 그들의 잎 성장의 관점에서 가뭄 스트레스 조건 (가뭄, 34 % SWC)를 실시 잘 급수 설비 (제어, 54 % 토양 수분 함량, (SWC))과 식물 사이의 비교를 나타낸다. 모든 식물은 ° C를 하루 / 밤, 300-400 μEm -2 초 -1 광합성 활성 방사선 (PAR). 가뭄 조건 25 ° C / 18을, 통제 된 조건 (16 시간 일 / 8 시간 밤에서 성장 챔버에서 성장했다 올바른 SWC에 도달 한 후, 추가?...

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Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

Quantifying cell division and expansion is of crucial importance to the understanding of whole-plant growth. Here, we present a protocol to calculate cellular parameters determining maize leaf growth rates and highlight the use of these data for investigating molecular growth regulatory mechanisms by directing developmental stage-specific sampling strategies.

세포 분열 및 확장의 운동 학적 분석 : 성장과 샘플링 발달 영역의 세포 기초의 정량화<em&gt; ZEA 메이스</em&gt; 잎

Growth analyses are often used in plant science to investigate contrasting genotypes and the effect of environmental conditions. The cellular aspect of ...

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Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

10.8K 조회수.  University of Antwerp. Quantifying cell division and expansion is of crucial importance to the understanding of whole-plant growth. Here, we present a protocol to calculate cellular parameters determining maize leaf growth rates and highlight the use of these data for investigating molecular growth regulatory mechanisms by directing developmental stage-specific sampling strategies. 

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Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessons from an Analysis of Maize Leaf Development

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not detected or are not identified as differentially expressed (DE) in transcriptomic analyses of whole plant organs. Laser Microdissection RNA-Seq (LM RNA-Seq) is a powerful tool to identify genes that are DE in specific developmental domains. However, the choice of cellular domains to microdissect and compare, and the accuracy of the microdissections are crucial to the success of the experiments. Here, two examples illustrate design considerations for transcriptomics experiments; a LM RNA-seq analysis to identify genes that are DE along the maize leaf proximal-distal axis, and a second experiment to identify genes that are DE in liguleless1-R (lg1-R) mutants compared to wild-type. Key elements that contributed to the success of these experiments were detailed histological and in situ hybridization analyses of the region to be analyzed, selection of leaf primordia at equivalent developmental stages, the use of morphological landmarks to select regions for microdissection, and microdissection of precisely measured domains. This paper provides a detailed protocol for the analysis of developmental domains by LM RNA-Seq. The data presented here illustrate how the region selected for microdissection will affect the results obtained.

Many developmentally important genes have cell- or tissue-specific expression patterns. This paper describes LM RNA-seq experiments to identify genes that are differentially expressed at the maize leaf blade-sheath boundary and in lg1-R mutants compared to wild-type. The experimental considerations discussed here apply to transcriptomic analyses of other developmental phenomena.

레이저 이외에 Microdissection RNA-서열에 대한 실험 디자인 : 옥수수 잎 개발의 분석 교훈

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not ...

연구

생화학

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin condensation, microtubule-kinetochore attachment, chromosome segregation, and cytokinesis in a small time frame. Errors in the delicate process can result in human disease, including birth defects and cancer. Traditional approaches investigating human mitotic disease states often rely on cell culture systems, which lack the natural physiology and developmental/tissue-specific context advantageous when studying human disease. This protocol overcomes many obstacles by providing a way to visualize, with high resolution, chromosome dynamics in a vertebrate system, the zebrafish. This protocol will detail an approach that can be used to obtain dynamic images of dividing cells, which include: in vitro transcription, zebrafish breeding/collecting, embryo embedding, and time-lapse imaging. Optimization and modifications of this protocol are also explored. Using H2A.F/Z-EGFP (labels chromatin) and mCherry-CAAX (labels cell membrane) mRNA-injected embryos, mitosis in AB wild-type, auroraBhi1045, and esco2hi2865 mutant zebrafish is visualized. High resolution live imaging in zebrafish allows one to observe multiple mitoses to statistically quantify mitotic defects and timing of mitotic progression. In addition, observation of qualitative aspects that define improper mitotic processes (i.e., congression defects, missegregation of chromosomes, etc.) and improper chromosomal outcomes (i.e., aneuploidy, polyploidy, micronuclei, etc.) are observed. This assay can be applied to the observation of tissue differentiation/development and is amenable to the use of mutant zebrafish and pharmacological agents. Visualization of how defects in mitosis lead to cancer and developmental disorders will greatly enhance understanding of the pathogenesis of disease.

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

라이브 Zebrafish의 배아에서 유사 분열 부문 및 역학을 관찰

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

발생학

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic development. The activity and morphology of SAMs determine important agronomic traits, such as shoot architecture, size and number of reproductive organs, and most importantly, grain yield. Here, we provide a detailed protocol for analyzing both the surface morphology and the internal cellular structure of the living SAMs from different species through laser scanning confocal microscope. The whole procedure from the sample preparation to the acquisition of high resolution three-dimensional (3D) images can be accomplished within as short as 20 minutes. We demonstrate that this protocol is highly efficient for studying not only the inflorescence SAMs of the model species but also the vegetative meristems from different crops, providing a simple but powerful tool to study the organization and development of meristems across different plant species.

This protocol presents how to live image and analyze the shoot apical meristems from different plant species using laser scanning confocal microscopy.

다른 식물 종에서 촬영 정점 Meristems의 confocal 라이브 영상

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Use of Atomic Force Microscopy to Measure Mechanical Properties and Turgor Pressure of Plant Cells and Plant Tissues

We present here the use of atomic force microscopy to indent plant tissues and recover its mechanical properties. Using two different microscopes in indentation mode, we show how to measure an elastic modulus and use it to evaluate cell wall mechanical properties. In addition, we also explain how to evaluate turgor pressure. The main advantages of atomic force microscopy are that it is non-invasive, relatively rapid (5~20 min), and that virtually any type of living plant tissue that is superficially flat can be analyzed without the need for treatment. The resolution can be very good, depending on the tip size and on the number of measurements per unit area. One limitation of this method is that it only gives direct access to the superficial cell layer.

Here, we present atomic force microscopy (AFM), operated as a nano- and micro-indentation tool on cells and tissues. The instrument allows the simultaneous acquisition of 3D surface topography of the sample and its mechanical properties, including cell wall Young's modulus as well as turgor pressure.

식물 세포 및 식물 조직의 기계적 특성 및 터거 압력을 측정하기 위해 원자력 현미경 검사법 사용

We present here the use of atomic force microscopy to indent plant tissues and recover its mechanical properties. Using two different microscopes in ...

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in molecular and imaging technologies allowed us to gain insights into how biochemical signals influence morphogenetic events. However, it is increasingly evident that apart from biochemical signals, mechanical cues also impact several aspects of cell and tissue growth. The Arabidopsis shoot apical meristem (SAM) is a dome-shaped structure responsible for the generation of all aboveground organs. The organization of the cortical microtubule cytoskeleton that mediates apoplastic cellulose deposition in plant cells is spatially distinct. Visualization and quantitative assessment of patterns of cortical microtubules are necessary for understanding the biophysical nature of cells at the SAM, as cellulose is the stiffest component of the plant cell wall. The stereotypical form of cortical microtubule organization is also a consequence of tissue-wide physical forces existing at the SAM. Perturbation of these physical forces and subsequent monitoring of cortical microtubule organization allows for the identification of candidate proteins involved in mediating mechano-perception and transduction. Here we describe a protocol that helps investigate such processes.

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Here we describe a protocol for live cell imaging of the cortical microtubule cytoskeleton at the shoot apical meristem and monitoring its response to changes in physical forces.

미생물의 미세 관 세포 골격및 아라비도시스 촬영 Apical 메리스템의 미세 기계적 조작의 라이브 세포 이미징

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in ...

Development of Microfluidic Devices to Study the Elongation Capability of Tip-growing Plant Cells in Extremely Small Spaces

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior in such restrictive conditions. To address this issue, we have developed growth chambers for tip-growing plant cells that contain a series of narrow, micro-fabricated gaps (~1 &#181;m) in a poly-dimethylsiloxane (PDMS) substrate. This transparent material allows the user to monitor tip elongation processes in individual cells during microgap penetration by time-lapse imaging. Using this experimental platform, we observed morphological changes in pollen tubes as they penetrated the microgap. We captured the dynamic changes in the shape of a fluorescently labeled vegetative nucleus and sperm cells in a pollen tube during this process. Furthermore, we demonstrated the capability of root hairs and moss protonemata to penetrate the 1 &#181;m gap. This in vitro platform can be used to study how individual cells respond to physically constrained spaces and may provide insights into tip-growth mechanisms.

We describe a method to investigate the capability of tip-growing plant cells, including pollen tubes, root hairs, and moss protonemata, to elongate through extremely narrow gaps (~1 &#181;m) in a microfluidic device.

매우 작은 공간에 팁 성장 하는 식물 세포의 신장 기능 연구를 미세 장치 개발

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior ...

생체공학

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

의 장기, 고해상도 공 촛점 시간 경과 영상<em&gt; Arabidopsis 떡잎</em발아시&gt; 표피

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

생물학

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) micro/nano-indentations, for a JPK&#160;AFM. Specifically, in this protocol we measure the apparent Young&#8217;s modulus of cell walls at subcellular resolutions across regions of up to 100 &#181;m&#160;x 100 &#181;m in floral meristems, hypocotyls, and roots. This requires careful preparation of the sample, the correct selection of micro-indenters and indentation depths. To account for cell wall properties only, measurements are performed in highly concentrated solutions of mannitol in order to plasmolyze the cells and thus remove the contribution of cell turgor pressure.
In contrast to other extant techniques, by using different indenters and indentation depths, this method allows simultaneous multiscale measurements, i.e. at subcellular resolutions and across hundreds of cells comprising a tissue. This means that it is now possible&#160;to spatially-temporally characterize the changes that take place in the mechanical properties of cell walls during development, enabling these changes to be correlated with growth and differentiation. This represents a key step to understand how coordinated microscopic cellular changes bring about macroscopic morphogenetic events.
However, several limitations remain: the method can only be used on fairly small samples (around 100 &#181;m in diameter) and only on external tissues; the method is sensitive to tissue topography; it measures only certain aspects of the tissue&#8217;s complex mechanical properties. The technique is being developed rapidly and it is likely that most of these limitations will be resolved in the near future.

We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

셀 벽의 탄성 특성의 AFM 기반의 매핑 : 조직, 세포 및 세포 이하의 해상도에서

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed &#8216;residence time&#8217;) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

The goal of this protocol is to demonstrate how to monitor fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces with variable-angle epifluorescence microscopy, showing blinking dots of GFP-tagged PATROL1, a membrane trafficking protein, in the cell cortex of the stomatal complex in Arabidopsis thaliana.

가변 각도 표면 형광 현미경으로 식물 세포 표면 역학의 실시간 영상

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

Quantitative Analysis of Cell Edge Dynamics during Cell Spreading

Cell spreading is a dynamic process in which a cell suspended in media attaches to a substrate and flattens itself from a rounded to a thin and spread-out shape. Following the cell-substrate attachment, the cell forms a thin sheet of lamellipodia emanating from the cell body. In the lamellipodia, globular actin (G-actin) monomers polymerize into a dense filamentous actin (F-actin) meshwork that pushes against the plasma membrane, thereby providing the mechanical forces required for the cell to spread. Notably, the molecular players that control the actin polymerization in lamellipodia are essential for many other cellular processes, such as cell migration and endocytosis. 
Since spreading cells form continuous lamellipodia that span the entire cell periphery and persistently expand outward, cell spreading assays have become an efficient tool to assess the kinetics of lamellipodial protrusions. Although several technical implementations of the cell spreading assay have been developed, a detailed description of the workflow, which would include both a step-by-step protocol and computational tools for data analysis, is currently lacking. Here, we describe the experimental procedures of the cell spreading assay and present an open-source tool for quantitative and unbiased analysis of cell edge dynamics during spreading. When combined with pharmacological manipulations and/or gene-silencing techniques, this protocol is amenable to a large-scale screen of molecular players regulating lamellipodial protrusions.

In this protocol, we present the experimental procedures of a cell spreading assay that is based on live-cell microscopy. We provide an open-source computational tool for the unbiased segmentation of fluorescently labeled cells and quantitative analysis of lamellipodia dynamics during cell spreading.

셀 확산 시 셀 엣지 역학의 정량적 분석

Cell spreading is a dynamic process in which a cell suspended in media attaches to a substrate and flattens itself from a rounded to a thin and spread-out ...

세포 분열 및 확장의 운동 학적 분석 : 성장과 샘플링 발달 영역의 세포 기초의 정량화

요약

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