Das übergeordnete Ziel dieses Pankreasgang-Infusionsverfahrens ist es, die Linienverfolgung, Geneinführung und zelllinienspezifisches Targeting in der Bauchspeicheldrüse zu ermöglichen. Diese Methode könnte helfen, Schlüsselfragen zu Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse zu beantworten, einschließlich chronischer Pankreatitis, Diabetes und Bauchspeicheldrüsenkrebs. Legen Sie zunächst eine betäubte Maus unter ein Seziermikroskop, so dass ihr Bauch in der Mitte des Sichtfeldes positioniert ist.
Immobilisieren Sie das Tier mit einem chirurgischen Klebeband und tragen Sie dann eine Augensalbe auf, um zu verhindern, dass sie austrocknen. Als nächstes bedecken Sie den Bauch der Maus mit einer dicken Schicht Haarentfernungscreme. Und nach etwa drei Minuten die Creme vorsichtig mit Gaze abwischen, die in 70% Ethanol getränkt ist, um alle Haare zu entfernen.
Zum Schluss die Haut mit 70% Ethanol abwischen, gefolgt von 10% Povidoniodidlösung, um Verunreinigungen zu entfernen und die Haut zu desinfizieren. Um die Operation zu beginnen, erstellen Sie mit einem Skalpell einen Mittellinien-Hautschnitt, der sich vom Xiphoid-Prozess bis zum Nabel erstreckt. Heben Sie dann mit einer Adson-Zette das Peritoneum an und machen Sie mit einer Schere ein kleines Mittellinienloch.
Erweitern Sie den Schnitt entlang der Mittellinie des Peritoneums, so dass seine Länge der Länge des Hautschnitts entspricht. Als nächstes verwenden Sie stumpfe Retraktoren, um die Leber hochzuziehen, und nachdem Sie den gemeinsamen Gallengang freigelegt haben, klemmen Sie ihn mit einer gekrümmten Bulldoggen-Gefäßklemme. Identifizieren Sie den Zwölffingerdarm und ziehen Sie ihn mit der Arruga-Zette kaudal heraus, um die Papille als weißen Fleck auf der vorderen Oberfläche des zweiten Teils des Zwölffingerdarms sichtbar darzustellen.
Um den Pankreasgang zu identifizieren, ziehen Sie den Zwölffingerdarm kaudal zurück, positionieren Sie dann eine 30-1/5-Eichnadel tangential zum Zwölffingerdarm und machen Sie eine Punktion an seiner Wand, die direkt gegenüber der Papille liegt. Um die Lösung zu infundieren, führen Sie den Katheter, der mit einer Infusionspumpe verbunden ist, durch die erzeugte Duodenotomie ein und schieben Sie ihn entlang des Kanals, bis er im Gefäß sichtbar ist, aber nicht weiter als einen Zentimeter reicht, um kleinere duktale Nebenflüsse zu vermeiden. Immobilisieren Sie den Katheter, indem Sie ihn mit einer zweiten gekrümmten Bulldoggen-Gefäßklemme klemmen.
Schalten Sie dann die Pumpe ein, um die Infusion von 150 Mikrolitern der Lösung in den Kanal einzuleiten. Als nächstes injizieren Sie etwa 1,5 Milliliter Kochsalzlösung in das Peritoneum der Maus, um einen Verlust des infundierten Volumens zu vermeiden, und bedecken Sie dann den freiliegenden Darm mit einer angefeuchteten Gaze, um austrocknung zu verhindern. Sobald die Infusion abgeschlossen ist, lassen Sie den immobilisierten Katheter los und entfernen Sie ihn mit der Bulldoggenklemme vorsichtig aus dem Pankreasgang.
Lösen Sie dann die Klemme aus dem gemeinsamen Gallengang. Schließen Sie das Peritoneum und die Haut, indem Sie sie kontinuierlich in einer einzigen Schicht nähen und die erste der beiden Dosen Analgetikum verabreichen, von denen die zweite am nächsten Tag verabreicht wird. Dann bringen Sie die Maus in einen Käfig, der unter einer Wärmelampe positioniert ist, und versorgen Sie das Tier ad libitum mit Futter und Wasser.
Beobachten Sie die Maus, bis sie ein ausreichendes Bewusstsein wiedererlangt hat, das sich in sternaler Liege manifestiert. Sieben Tage nach der Operation aus der eingeschläferten tierischen Bauchspeicheldrüse sowie Milz, Leber und Zwölffingerdarm als Kontrollen dienen. Tauchen Sie das gesamte isolierte Gewebe in eine 4% ige Paraformaldehydlösung und fixieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius.
Sobald das Gewebe fixiert ist, schützen Sie die Proben, indem Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius in einer 30% igen Saccharoselösung einweichen. Nach einem Kryoschutz über Nacht die Proben in flüssigem Stickstoff einfrieren und mit einem Mikrotom Gewebeschnitte auf sechs Mikrometer schneiden. Stellen Sie abschließend die Schnitte unter einem Fluoreszenzmikroskop ab.
Hier werden mikroskopische Bilder von Pankreasabschnitten präsentiert, die sieben Tage nach der Scheinoperation und der Pankreaskanalinfusion von AAV8, die das GFP-Gen tragen, von Mäusen entfernt wurden. Leber, Milz und Zwölffingerdarm, die aus der mit AAV8 infundierten Maus isoliert wurden, zeigten kein GFP-Signal, während die Bauchspeicheldrüse eine prominente GFP-Expression zeigte, was die pankreasspezifische Abgabe des Virus nach einer Pankreasgang-Infusion bestätigte. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 10 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.
Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es sehr wichtig, eine sorgfältige Dissektion durchzuführen und eine möglichst kleine Duodenotomie für die Einführung des Katheters durchzuführen. Nach ihrer Entwicklung ebnete die Technik den Weg für Forscher, die die Bauchspeicheldrüse untersuchten, um eine Reihe von Pathologien zu untersuchen, die das Organ befallen, einschließlich chronischer Pankreatitis, Diabetes und Bauchspeicheldrüsenkrebs sowohl in Nagetier- als auch in größeren Tiermodellen. Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein sehr gutes Verständnis dafür haben, wie Sie den Pankreasgang effektiv und selektiv infundieren können.
