Name: isolation of type i and type ii pericytes from mouse skeletal muscles
Uploaded: 2017-05-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
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Ce travail a été partiellement soutenu par une subvention de Fund-A-Fellow de la Myotonic Dystrophy Foundation (MDF-FF-2014-0013) et la Subvention de développement scientifique de l&#39;American Heart Association (16SDG29320001).

Les souris transgéniques Wildtype et Nestin-GFP ont été logées dans l&#39;établissement animal de l&#39;Université du Minnesota. Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité institutionnel pour les soins et l&#39;utilisation des animaux à l&#39;Université du Minnesota et étaient conformes au Guide NIH pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire. 1. Dissection musculaire et isolement monocellulaire <ol><li> Euthanaser des souris adultes (6 à 10 semaines, hommes et femmes) avec du tribrométhanol (250 mg / kg, ip) et stériliser leur peau d&#39;abdomen avec 70% d&#39;éthanol. NOTE: On a utilisé du tribrométhanol à la place de la kétamine pour l&#39;anesthésie / euthanasie, car on sait que la kétamine interagit avec les récepteurs NMDA, ce qui pourrait avoir un impact sur l&#39;étude. </li><li> Placez les souris en position couchée et utilisez un scalpel pour faire une incision horizontale sur la peau abdominale. Éloignez la peau à la main, en tirant dans des directions opposées pour exposer les muscles des membres postérieurs. </li><li> CollecteT les muscles des membres postérieurs à l&#39;aide de pinces et de ciseaux. Conservez-les dans une solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS) additionnée de 1% de pénicilline-streptomycine (P / S) sur de la glace. </li><li> Laver les muscles de la peau arrière disséqués dans du PBS glacé additionné de 1% de P / S deux fois et les transférer dans une plaque stérile de 10 cm. </li><li> Nettoyer soigneusement les nerfs, les vaisseaux sanguins et le tissu conjonctif des muscles à l&#39;aide de pinces et de ciseaux sous un microscope à dissection à un grossissement de 2X. </li><li> Couper finement et hacher les muscles en petits morceaux (1-2 mm 3 ) à l&#39;aide de ciseaux stériles et de lames. Si nécessaire, ajoutez une petite quantité de milieu d&#39;aigle modifié (DMEM) de Dulbecco pour vous assurer que les muscles ne sont pas séchés. </li><li> Décomposer mécaniquement le tissu en pipetant vers le haut et vers le bas à travers une pipette sérologique de 10 mL 10 fois. </li><li> Ajouter la solution de digestion fraîchement préparée (DMEM complétée avec 0,2% de collagénase de type 2) au mélange. Incuber à 37 ° C pendant 2 h avec gentlE agitation à 35 tours / min. </li><li> Triturer avec une aiguille 18 G pour homogénéiser le mélange. Ensuite, centrifuger à 500 xg pendant 5 min. Jeter le surnageant, puis remettre à nouveau le culot dans 0,25% de trypsine / EDTA. Incuber à 37 ° C pendant 10 min. Répétez l&#39;étape de centrifugation deux fois de plus. </li><li> Ajouter 10 mL de DMEM additionné de 20% de sérum bovin fœtal (FBS) à la solution et centrifuger à 500 xg pendant 5 min. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans un tampon de lyse des globules rouges (NH4Cl 155 mM, KHCO3 10 mM et EDTA 0,1 mM). </li><li> Centrifuger à 500 xg pendant 5 min. Jeter le surnageant et remettre à nouveau le culot dans le tampon de tri (HEPES 20 mM, pH 7,0, EDTA 1 mM et 1% de BSA dans du PBS exempt de Ca / Mg 2 + , pH 7,0). Filtrer le mélange à travers une crépine cellulaire de 40 μm pour obtenir une suspension à une seule cellule. </li><li> Centrifuger à 500 xg pendant 5 min. Jeter le surnageant et remettre à nouveau le culot dans 1 ml de tampon de tri. </li><li> Compte leNuméro de cellule avec un hémocytomètre et diluer la suspension monocellulaire à 5 x 10 6 / mL dans le tampon de tri. </li></ol> 2. Coloration et tri des cellules <ol><li> Préparez les contrôles et l&#39;échantillon comme décrit dans le tableau 1 . Tacher la suspension à une seule cellule avec les anticorps respectifs sur de la glace pendant 30 min, comme décrit dans le tableau 1 . </li><li> Centrifuger à 500 xg pendant 5 min et laver les pastilles deux fois avec un tampon de tri. </li><li> Ajouter DAPI aux solutions monocellulaires, comme indiqué dans le Tableau 1. Utiliser DAPI (concentration finale) 5 μg / mL pour le contrôle DAPI à une seule couleur et DAPI 1 μg / mL pour le contrôle PDGFRβ-PE-FMO et l&#39;échantillon. Gardez tous les tubes sur la glace tout au long de l&#39;expérience. </li><li> Activez le trieur et le logiciel. Numérisez et insérez une puce de tri de 100 μm lorsque vous y êtes invité. </li><li> Effectuer la configuration automatique ( c.-à-d. L&#39; alignement des copeaux, l&#39;étalonnage des gouttelettes, l&#39;étalonnage du flux latéral et le calibrage du délai de triOn) en chargeant les perles de configuration automatique lorsqu&#39;elles sont invitées. </li><li> Une fois la configuration automatique terminée, accédez à l&#39;onglet &quot;Expérience&quot;, cliquez sur &quot;Nouveau&quot; et sélectionnez &quot;Modèle vierge&quot; dans &quot;Modèles publics&quot;. </li><li> Sous «Paramètres de mesure», entrez «DAPI» pour «FL1», «Nestin-GFP» pour «FL2» et «PDGFRβ» pour «FL3». Décochez les cases pour «FL4» - «FL6». </li><li> Cochez les cases pour activer les lasers 405, 488 et 561 et cliquez sur &quot;Créer une nouvelle expérience&quot;. </li><li> Sélectionnez l&#39;option &quot;Start Compensation Wizard&quot; et suivez les instructions du logiciel &quot;Compensation Wizard&quot; pour configurer la compensation. <ol><li> Chargez le contrôle non contrôlé et cliquez sur &quot;Démarrer&quot;. Cliquez sur &quot;Détecteur et paramètres de seuil&quot; et ajustez le gain du capteur des détecteurs FSC et BSC pour placer la population sur la balance. </li><li> Un dJuste les niveaux de gain des canaux de fluorescence FL1-FL3 pour placer les populations négatives sur le côté gauche des histogrammes. Cliquez sur le bouton &quot;Enregistrer&quot; pour enregistrer les données. </li><li> Chargez les commandes mono-couleur une par une lorsque vous y êtes invité. Cliquez sur &quot;Démarrer et Enregistrer&quot; pour enregistrer les données. Ajustez les portes pour les populations positives sur les histogrammes. Cliquez sur Suivant.&quot; </li><li> Passez à &quot;Calculer la matrice&quot; dans l&#39;onglet &quot;Compensation&quot; et cliquez sur &quot;Calculer&quot; dans le panneau &quot;Calculer les paramètres de compensation&quot; pour effectuer la compensation. Cliquez sur &quot;Terminer&quot; pour quitter le &quot;Assistant de compensation&quot;. </li></ol></li><li> Chargez le contrôle PDGFRβ-PE-FMO et cliquez sur &quot;Démarrer&quot;. Dessinez une porte de polygone (Gate A) autour des cellules d&#39;intérêt sous la trame &quot;Tous les événements&quot;. </li><li> Double-cliquez à l&#39;intérieur de la porte A pour créer un tracé enfant. Changez l&#39;axe Y en DAPI et dessinez une porte polygone (Gate B) autour des cellules live (DAPI low ). Double-cliquez sur iNside Gate B pour créer un tracé d&#39;enfant. Modifiez l&#39;axe X sur FSC-H et l&#39;axe Y sur FSC-W et dessinez une porte polygone (Gate C) autour des single pour éliminer les doublets. </li><li> Double-cliquez à l&#39;intérieur de la porte C pour créer un tracé enfant. Modifiez l&#39;axe X à Nestin-GFP et à l&#39;axe Y à PDGFRβ-PE. Cliquez sur le bouton &quot;Enregistrer&quot; pour enregistrer les données. </li><li> Chargez l&#39;échantillon et répétez les étapes 2.11-2.12. Après l&#39;enregistrement, cliquez sur &quot;Pause&quot; pour conserver l&#39;échantillon. </li><li> Définissez les limites de gating pour les cellules PDGFRβ + et Nestin-GFP + en fonction du contrôle PDGFRβ-PE-FMO. Dessinez des portes pour les populations PDGFRβ + Nestin-GFP et PDGFRβ + Nestin-GFP + . </li><li> Sous &quot;Méthode de tri&quot;, sélectionnez &quot;Tubes bidirectionnels&quot; et affectez les cellules &quot;PDGFRβ + Nestin-GFP - &quot; et &quot;PDGFRβ + Nestin-GFP + &quot; aux tubes collecteurs gauche et droit, reDe façon spectaculaire. Montez les tubes collecteurs remplis de tampon de tri de triage à l&#39;étape de la collecte et cliquez sur le bouton &quot;Charger la collection&quot;. </li><li> Cliquez sur le bouton &quot;Reprendre&quot; pour garder l&#39;exemple en cours d&#39;exécution. Cliquez sur &quot;Démarrer le tri&quot; pour collecter les cellules PDGFRβ + Nestin-GFP - (type I pericytes) et PDGFRβ + Nestin-GFP + (type II pericytes). </li></ol> 3. Analyses post-tri <ol><li> Centrifuger les cellules triées à 500 xg pendant 5 min, renvoyer la pastille dans 1 mL de milieu pericyte (voir la Table des matériaux ) et compter la densité cellulaire en utilisant un hémocytomètre. </li><li> Périphériques de type I et type II sur les lamelles coulées en poly-D-lysine (PDL) à ~ 1 x 10 4 cellules / cm 2 . Cultiver en milieu pericyte pendant 3 jours à 37 ° C avec 5% de CO 2 . </li><li> Le jour 3, examinez la morphologie du percyte (sous contraste de phase) et l&#39;expression endogène de Nestin-GFP en utilisant un micro fluorescentPortée (laser d&#39;excitation: 488 nm, filtre d&#39;excitation: 470/40 nm et filtre d&#39;émission: 515/30 nm). Prenez des images sous un objectif 20X (0,45 NA). </li><li> Remplacer le milieu pericyte par un additif adipogène (moyen de base MSC basal + additif immunogène adipogène) et myogénique (DMEM + 2% de sérum de cheval) pour initier la différenciation adipogène et myogénique, respectivement, comme décrit précédemment 20 . Changer le support tous les 2-3 jours. </li><li> Réparez les cellules le jour 17 (14 jours après la différenciation adipogène / myogénique) dans du paraformaldéhyde à 4% (PFA) pendant 20 minutes à température ambiante. REMARQUE: Attention, le PFA est cancérogène. </li><li> Effectuer une immunocytochimie contre la périlipine (marqueur adipocytaire) et S-myosine (myotube mûr / marqueur de myofibres), comme décrit dans les publications précédentes 19 , 20 . <ol><li> Laver les cellules fixes 3 fois dans du PBS pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Ajouter un tampon de blocage (PBSSupplémenté avec 5% de sérum d&#39;âne, 3% de BSA et 0,3% de Triton X-100) et incuber à température ambiante pendant 1 h. </li><li> Incuber les cellules avec des anticorps anti-perilipine (2 μg / mL) et / ou anti-S-myosine (2 μg / mL) à 4 ° C pendant une nuit. </li><li> Laver les cellules 3 fois dans du PBS pendant 10 minutes à température ambiante. </li><li> Incuber les cellules avec des anticorps Alexa 555 anti-lapin (4 μg / mL) et / ou Alexa555 anti-souris (4 μg / mL) à température ambiante pendant 1 h. </li><li> Laver les cellules 3 fois dans du PBS pendant 10 minutes à température ambiante. </li><li> Monter les cellules immunostained avec un support de support contenant DAPI (voir la table des matériaux). Examiner l&#39;expression de la périlipine et de la S-myosine à l&#39;aide d&#39;un microscope fluorescent (laser d&#39;excitation: 543 nm, excitation 540/45 nm et émission 600/50 nm) et prendre des images sous un objectif 40X (0,60 NA). </li></ol></li></ol>

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Tous les auteurs n&#39;ont aucun conflit d&#39;intérêt à divulguer.

Les pericytes sont des cellules perivasculaires multipotentes 22 , 23 situées sur la surface abluminal des capillaires 21 , 26 . Dans les muscles squelettiques, les pericytes peuvent se différencier selon les voies adipogènes et / ou myogènes 19 , 20 , 24 . Des études récentes ont révélé deux sous-populations de pericytes, avec une expression de marqueur différente et des potentiels de différenciation distincts 19 , 24 , 25 . Les pericytes de type I (NG2 + Nestin - ) sont adipogènes, tandis que les pericytes de type II (NG2 + Nestin + ) sont myogéniques. L&#39;isolement de ces sous-populations pour les études in vitro nécessite la ligne de souris double-transgénique NG2-DsRed et Nestin-GFP. La dépendance de cette purificationLe protocole sur les souris doublement transgéniques limite de manière significative son application et donc la recherche sur la biologie des sous-populations de pericytes. Cet article vidéo illustre une méthode alternative pour l&#39;isolement des pericytes de type I et de type II des muscles squelettiques de souris. Cette nouvelle méthode repose toujours sur une technique FACS pour la séparation des cellules. Cependant, au lieu d&#39;utiliser une fluorescence transgénique NG2-DsRed, elle cible le signal PDGFRβ endogène. Ceci est basé sur l&#39;observation que NG2-DsRed expression co-localise avec PDGFR β dans le muscle squelettique 19 . Par rapport à la méthode d&#39;origine, ce protocole présente plusieurs avantages. Tout d&#39;abord, il ne nécessite pas le fond génétique NG2-DsRed, bien que les antécédents Nestin-GFP soient encore nécessaires. Deuxièmement, au lieu de cibler NG2, ce protocole utilise PDGFRβ, un marqueur bien caractérisé avec des anticorps validés et commercialement disponibles. Troisièmement, il permet l&#39;isolement simultané de boType I et type II pericytes. Par exemple, les cellules PDGFRβ-PE + Nestin-GFP et PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + isolées à l&#39;aide de ce protocole présentent des capacités de différenciation distinctes. Plus précisément, PDGFRβ-PE + Nestin-GFP - mais pas PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + , les cellules se différencient en adipocytes dans un état adipogène, alors que PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + , mais pas PDGFRβ-PE + Nestin-GFP - , Les cellules subissent une différenciation myogénique sous condition myogénique. Ces données sont cohérentes avec les rapports précédents montrant que les cellules NG2-DsRed + Nestin-GFP (type I pericytes) sont adipogènes et les cellules NG2-DsRed + Nestin-GFP + (type II pericytes) sont myogènes 19 , 24 , suggérant que le PDGFRβ isolé -PE + Nestin-GFP - et PDGFRβ-PE + NLes cellules estin-GFP + sont en effet des pericytes de type I et de type II, respectivement. Ensemble, ces résultats suggèrent que ce nouveau protocole permet l&#39;isolement / purification relativement facile des sous-populations de percytes à partir de muscles squelettiques de souris et éventuellement d&#39;autres tissus. Cela favorisera les études sur la biologie pericyte et leur traduction thérapeutique pour divers troubles. Il convient toutefois de noter qu&#39;il existe une limitation de cette méthode en raison de l&#39;utilisation de PDGFRβ. Il a été démontré dans une étude antérieure que les cellules interstitielles PW1 + (PIC) expriment aussi le PDGFRβ 20 . Par conséquent, les populations isolées de PDGFRβ-PE + Nestin-GFP et PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + peuvent contenir des PIC. Cependant, la contribution de ces PIC à la différenciation par perette est limitée, étant donné que les pericytes dépassent les PIC dans les muscles squelettiques 20 et que les pericytes de type I ne subissent pas mesOgénèse 19 , 25 . En utilisant cette méthode, les pericytes type I et type II ont été obtenues à des rendements de 9,5% et 2,1%, respectivement. Ces chiffres étaient comparables aux rendements déclarés de 2,8% et de 3,4%, respectivement, chez les souris à double transgénique 19 . La légère différence peut être due à différentes stratégies de gating ou à des protocoles de digestion. Ces résultats suggèrent à nouveau que le protocole proposé peut être utilisé pour isoler les sous-types de pericytes des muscles squelettiques. Les étapes critiques de ce protocole incluent les points suivants: (1) Assurez-vous que les muscles squelettiques sont entièrement hachés et capables de passer facilement par une pipette sérologique de 10 mL. Les gros blocs musicaux interfèrent avec la digestion enzymatique et réduisent considérablement le rendement. (2) Utiliser une solution de collagénase fraîchement préparée pour la digestion musculaire et permettre une agitation douce (35 tours / min) pendant l&#39;incubation. (3) Conservez leContrôle et échantillonne sur glace tout au long des étapes de coloration et de tri. (4) Utilisez les contrôles FMO pour configurer les limites de verrouillage. En plus de la capacité de différenciation, les pericytes type I et type II présentent également une morphologie différente. Plus précisément, les pericytes de type I ont des corps de cellules rondes, avec des processus courts et des noyaux relativement importants. Les pericytes de type II, d&#39;autre part, ont généralement de petits corps cellulaires, avec des processus longs et minces et de petits noyaux. Les différences morphologiques suggèrent que les pericytes de type I et de type II sont intrinsèquement différents, ce qui correspond à la nature hétérogène des pericytes 21 . Ce qui cause / maintient la différence entre les pericytes de type I et de type II, ainsi que les mécanismes moléculaires sous-jacents, reste incertain et nécessite une recherche plus approfondie. Ce protocole d&#39;isolement aidera à répondre à ces questions importantes.

La dystrophie musculaire est un trouble musculaire-dégénératif qui n&#39;a jusqu&#39;ici pas de traitements efficaces. Le développement de thérapies qui favorisent la régénération tissulaire a toujours été d&#39;un grand intérêt. La régénération et la réparation des tissus après dommages dépendent des cellules souches / cellules progénitrices résidentes 1 . Les cellules satellites sont des cellules précurseurs myogènes actives qui contribuent à la régénération musculaire 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . Leur utilisation clinique, cependant, est entravée par leur migration limitée et leur faible taux de survie après l&#39;injection, ainsi que par leur diminution de la capacité de différenciation après l&#39; amplification in vitro 8 , 9 , 10 , 11 . En plus de satelliLes muscles squelettiques contiennent également de nombreuses autres populations de cellules avec un potentiel myogénique 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , telles que les cellules interstitielles positives du récepteur du facteur de croissance dérivées des plaquettes (PDGFRβ). Il existe des preuves montrant que les cellules PDGFRβ + dérivées de muscle peuvent se différencier en cellules myogènes et améliorer la pathologie musculaire et la fonction 14 , 17 , 18 , 19 , 20 . Le PDGFRβ marque principalement les pericytes 21 , qui sont des cellules périvasculaires avec une pluripotence 22 , 23 . En plus de PDGFRβ, de nombreux autres marqueurs, y compris Neuron-Glial 2 (NG2) et CD146, sont également utilisés pour iDentify pericytes 21 . Il convient toutefois de noter qu&#39;aucun de ces marqueurs n&#39;est spécifique à un pericyte 21 . Des études récentes ont révélé deux sous-types de percytes musculaires, appelés type I et type II, qui expriment différents marqueurs moléculaires et réalisent des fonctions distinctes 19 , 24 , 25 . Biochimiquement, les pericytes de type I sont NG2 + Nestin - , tandis que les pericytes de type II sont NG2 + Nestin + 19 , 24 . Fonctionnellement, les pericytes de type I peuvent subir une différenciation adipogène, contribuant à l&#39;accumulation de graisse et / ou à la fibrose, tandis que les pericytes de type II peuvent se différencier le long de la voie myogénique, ce qui contribue à la régénération musculaire 19 , 24 , 25 . Ces résultats démontrent que: (1) les pericytes de type I peuvent bE ciblés dans le traitement des troubles dégénératifs gras / fibrose, et (2) les pericytes de type II ont un grand potentiel thérapeutique pour la dystrophie musculaire. Une étude et une caractérisation plus poussées de ces populations nécessitent un protocole d&#39;isolement qui permet de séparer les pericytes de type I et de type II à un haut niveau de pureté. À l&#39;heure actuelle, l&#39;isolement des sous-populations de péricyte repose sur les souris doublement transgéniques NG2-DsRed et Nestin-GFP 19 , 24 . La disponibilité des souris NG2-DsRed et la qualité de la plupart des anticorps NG2 limitent l&#39;utilisation généralisée de cette méthode. Étant donné que tous les pericytes NG2 + expriment également le PDGFRβ dans les muscles squelettiques 19 , 20 , 24 , nous supposons que NG2 peut être remplacé par PDGFRβ pour l&#39;isolement des pericytes et de leurs sous-populations. Ce travail décrit un protocole basé sur FACS quiUtilise la coloration PDGFRβ et le signal Nestin-GFP. Cette méthode est moins exigeante pour les chercheurs parce que: (1) il ne nécessite pas l&#39;arrière-plan NG2-DsRed et (2) il utilise des anticorps PDGFRβ disponibles dans le commerce, qui sont bien caractérisés. En outre, il permet l&#39;isolement simultané de pericytes de type I et de type II à haute pureté, ce qui permet d&#39;approfondir la recherche sur la biologie et le potentiel thérapeutique de ces sous-populations de pericyte. Après la purification, ces cellules peuvent être cultivées en culture, et leurs morphologies peuvent être visualisées. Ce travail montre également que les pericytes de type I et de type II isolés en utilisant cette méthode, comme ceux purifiés à partir de souris doublement transgéniques, sont adipogènes et myogènes, respectivement.

<table><tbody><tr><td>Cell Sorter</td><td>Sony</td><td>SH800</td><td></td></tr><tr><td>Automatic Setup Beads</td><td>Sony</td><td>LE-B3001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>Avertin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>Pericyte Growth Medium</td><td>ScienCell</td><td>1201</td><td></td></tr><tr><td>MSC Basal Medium (Mouse)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5501</td><td></td></tr><tr><td>Adipogenic Stimulatory Supplement (Mouse)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5503</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>16000</td><td></td></tr><tr><td>Horse Serum</td><td>Sigma</td><td>H1270</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type 2</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin/EDTA&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>PDL</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>PDGFR&amp;beta;-PE Antibody</td><td>eBioscience</td><td>12-1402</td><td></td></tr><tr><td>Perilipin Antibody</td><td>Sigma</td><td>P1998</td><td></td></tr><tr><td>S-Myosin Antibody</td><td>DSHB</td><td>MF-20</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555-anti-rabbit antibody&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-31572</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555-anti-mouse antibody</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-31570</td><td></td></tr><tr><td>Mounting Medium with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>BP120</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Fisher Scientific</td><td>A661</td><td></td></tr><tr><td>KHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P184</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>18 G Needles</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Serological Pipette</td><td>BD</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>OneComp eBeads</td><td>eBioscience</td><td>01-1111</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of type i and type ii pericytes from mouse skeletal muscles

Les pericytes sont des cellules multiperces perivasculaires qui présentent une hétérogénéité dans différents organes ou même dans le même tissu. Dans les muscles squelettiques, il existe au moins deux sous-populations périticées (appelées type I et type II), qui expriment différents marqueurs moléculaires et possèdent des capacités de différenciation distinctes. En utilisant des souris doublement transgéniques NG2-DsRed et Nestin-GFP, les pericytes de type I (NG2-DsRed + Nestin-GFP-) et de type II (NG2-DsRed + Nestin-GFP + ) ont été isolées avec succès. Cependant, la disponibilité de ces souris à double transgénique empêche l&#39;utilisation généralisée de cette méthode de purification. Ce travail décrit un protocole alternatif qui permet l&#39;isolement facile et simultané des pericytes de type I et de type II à partir des muscles squelettiques. Ce protocole utilise la technique de tri cellulaire activée par fluorescence (FACS) et cible PDGFRβ, plutôt que NG2, avec le signal Nestin-GFP. Après l&#39;isolement, type I et tyPe II pericytes présentent des morphologies distinctes. De plus, les pericytes de type I et de type II isolés avec cette nouvelle méthode, comme ceux isolés des souris doublement transgéniques, sont adipogènes et myogènes, respectivement. Ces résultats suggèrent que ce protocole peut être utilisé pour isoler les sous-populations de péricyte des muscles squelettiques et éventuellement d&#39;autres tissus.

Les paramètres FACS, y compris l&#39;intensité laser et la compensation de canal, sont corrigés en fonction des résultats des contrôles non contrôlés et des contrôles à une seule couleur. La commande PDGFRβ-PE-FMO sert à régler le déclenchement de la population de PDGFRβ-PE + ( Figure 1A ). Parmi les cellules PDGFRβ-PE, deux populations représentant les cellules Nestin-GFP + et Nestin-GFP sont clairement séparées ( Figure 1A ). Les limites de gating pour les populations de PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + et PDGFRβ-PE + Nestin-GFP sont définies en fonction du déclenchement de PDGFRβ-PE + et Nestin-GFP + ( Figure 1A ). Ces limites sont utilisées pour définir et trier PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + (type II pericytes) et PDGFRβ-PE + Nestin-GFP - (type I pericytEs) des cellules de l&#39;échantillon ( figure 1B ). Les cellules PDGFRβ-PE + Nestin-GFP et PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + isolées représentent respectivement 9,5% et 2,1% des cellules totales dans la solution à une seule cellule. Les spectres de type I et de type II isolés par FACS démontrent des différences morphologiques après trois jours de culture. Les pericytes de type I présentent une morphologie amiboïde, avec des corps circulaires ronds et des processus courts ( figure 2 ). Les pericytes de type II, cependant, montrent une morphologie ramifiée, caractérisée par de petits corps cellulaires et des processus longs et minces ( figure 2 ). À cette époque, la plupart des pericytes de type II restent comme Nestin-GFP + , tandis que les pericytes de type I sont Nestin-GFP - ( Figure 2 ). De plus, type I, mais pas type II, pericySe différencient en adipocytes exprimant la périlipine après 14 jours dans un milieu adipogène ( figure 3 ). Type II, mais pas de type I, les pericytes se différencient en myotines exprimant la S-myosine après 14 jours en milieu myogène ( Figure 4 ). Ces résultats indiquent fortement que les pericytes de type I sont adipogènes, tandis que les pericytes de type II sont myogéniques. <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55904/55904fig1.jpg" /> Figure 1 : limites de positionnement et triage représentatif. ( A ) Graphique fluorescent du contrôle PDGFRβ-PE-FMO, démontrant les limites de gâches PDGFRβ-PE + Nestin-GFP et PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + . ( B ) Graphique fluorescent représentatif de l&#39;échantillon montrant la distribution du PDGFRβ-PE + Nestin-GFP <sUp&gt; - (type I pericytes) et PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + (type II pericytes). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55904/55904fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55904/55904fig2.jpg" /> Figure 2: expression morphologique et Nestin-GFP dans les pericytes triés type I et type II. Les pericytes triés de type I et de type II ont été ensemencés sur des lamelles et cultivés en milieu pericyte pendant 3 jours. Les pericytes de type I présentaient des corps circulaires ronds, avec de courts procédés et aucun signal GFP endogène sous un microscope fluorescent (excitation Laser: 488 nm, filtres d&#39;excitation et d&#39;émission: respectivement 470/40 nm et 515/30 nm). Les pericytes de type II ont démontré de petits corps cellulaires, avec des processus longs et minces, et un signal GFP endogène fort sous unMicroscope fluorescent sous les mêmes réglages. Barre d&#39;échelle = 100 μm <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55904/55904fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <img alt="figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55904/55904fig3.jpg" /> Figure 3: Différenciation adipogène des pericytes triées de type I et de type II. Les pericytes triés de type I et de type II ont été cultivés en milieu pericyte pendant 3 jours. Ils ont ensuite été différenciés en milieu adipogène pendant 14 jours. Les cellules ont été fixées et immunostained avec un anticorps anti-perilipine suivi d&#39;un anticorps anti-lapin Alexa555. L&#39;immunocytochimie a montré que le type I, mais pas le type II, les pericytes ont exprimé le marqueur adipocytaire de la périlipine (rouge) sous un microscope fluorescent (laser d&#39;excitation: 543 nm; filtres d&#39;excitation et d&#39;émission: 540/45 nm et 600/50 nm, respect<html> Ively). Barre d&#39;échelle = 50 μm <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55904/55904fig3large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55904/55904fig4.jpg" /> Figure 4 : Différenciation myogénique des pericytes triés de type I et de type II. Les pericytes triés de type I et de type II ont été cultivés dans un milieu pericyte pendant 3 jours et ont ensuite été différenciés en milieu myogène pendant 14 jours. Les cellules ont été fixées et immunocolorées avec un anticorps anti-S-myosine et un anticorps anti-souris d&#39;âne Alexa555. L&#39;immunocytochimie a montré que les pericytes de type II, mais pas de type I, exprimaient le myotube / myofibère mature S-myosine (rouge) sous un microscope fluorescent (laser d&#39;excitation: 543 nm; filtres d&#39;excitation et d&#39;émission: 540/45 nm et 600/50 nm , respectivement). Barre d&#39;échelle = 50 μm//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55904/55904fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Tubes </td><td> Coloration </td></tr><tr><td> Contrôle non contrôlé </td><td> Suspension de cellule unique à partir de souris de type sauvage </td></tr><tr><td> Contrôle de couleur unique DAPI (exclusion de cellules mortes) </td><td> Suspension cellulaire unique de souris sauvages + DAPI (5 μg / mL) </td></tr><tr><td> GFP à contrôle unique </td><td> Suspension de cellule unique de souris Nestin-GFP </td></tr><tr><td> Contrôle de couleur unique PE </td><td> OneComp eBeads + anticorps PDGFRβ-PE (4 μg / mL) </td></tr><tr><td> Contrôle PE-FMO </td><td> Suspension cellulaire unique de souris Nestin-GFP + DAPI (1 μg / mL) </td></tr><tr><td> Échantillon </td><td> Suspension cellulaire unique à partir de souris Nestin-GFP + anticorps PDGFRβ-PE (4 μg / mL) +DAPI (1 μg / mL) </td></tr></tbody></table> Tableau 1: Protocole de coloration pour les contrôles à une seule couleur, contrôle PDGFRβ-PE-FMO et échantillon de muscle.

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Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Ce travail décrit un protocole basé sur FACS qui permet un isolement facile et simultané des pericètes de type I et de type II provenant des muscles squelettiques.

Isolation des Pericytes de Type I et de Type II des Muscles Squelets de la Souris

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

isolation-of-type-i-and-type-ii-pericytes-from-mouse-skeletal-muscles

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.1K vues.  University of Minnesota.  Ce travail décrit un protocole basé sur FACS qui permet un isolement facile et simultané des pericètes de type I et de type II provenant des muscles squelettiques. 

Vidéo: Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

Isolement et quantitative immunocytochimique caractérisation des cellules myogéniques primaires et fibroblastes de muscle squelettique humain

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Recherche

Biologie du développement

Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to differentiate into later stages of muscle development. The protocol provided here describes a robust method for the isolation and culture of a highly proliferative population of myoblast cells from young adult mouse skeletal muscle explants. These cells are useful for the study of the metabolic properties of skeletal muscle of different mouse models, as well as in other downstream applications such as transfection with exogenous DNA or transduction with viral expression vectors. The level of differentiation and metabolic profile of these cells depends on the length of exposure, and composition of the media used to induce myoblast differentiation. These methods provide a robust system for the study of mouse muscle cell metabolism ex vivo. Importantly, unlike in vivo models, the methods described here provide a cell population that can be expanded and studied with high levels of reproducibility.

Myoblasts are proliferating precursor cells that differentiate to form polynucleated myotubes and eventually skeletal muscle myofibers. Here, we present a protocol for efficient isolation and culture of primary myoblasts from young adult mouse skeletal muscles. The method enables molecular, genetic, and metabolic studies of muscle cells in culture.

Isolement et différenciation des myoblastes primaires des explantations de muscle squelettique de souris

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal muscles regulating the exchange of fluids and nutrients as well as the immune response against infectious agents by controlling immune cell migration. For these functions, MMEC form a functional &#34;myovascular unit&#34; (MVU), with further cell types, such as fibroblasts, pericytes and skeletal muscle cells. Consequently, a dysfunction of MMEC and therefore the MVU contributes to a vast variety of myopathies. However, regulatory mechanisms of MMEC in health and disease remain insufficiently understood and their elucidation precedes more specific treatments for myopathies. The isolation and in-depth investigation of primary MMEC functions in the context of the MVU might facilitate a better understanding of these processes.
This article provides a protocol to isolate primary murine MMEC of the skeletal muscle by mechanical and enzymatic dissociation including purification and culture maintenance steps.

Microvascular endothelial cells of skeletal muscles (MMEC) shape the inner wall of muscle capillaries and regulate both, exchange of fluids/molecules and migration of (immune) cells between muscle tissue and blood. Isolation of primary murine MMEC, as described here, enables comprehensive in vitro investigations of the &#34;myovascular unit&#34;.

Isolement de cellules endothéliales microvasculaires primaires murines Muscle squelettique

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Neurosciences

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

Isolement et culture des fibres musculaires individuelles et de leurs cellules satellites du muscle squelettique adulte

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Biologie

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal nuclei in muscle fibers. In adult muscle, satellite cells are normally mitotically quiescent. Following injury, however, satellite cells initiate cellular proliferation to produce myoblasts, their progenies, to mediate the regeneration of muscle. Transplantation of satellite cell-derived myoblasts has been widely studied as a possible therapy for several regenerative diseases including muscular dystrophy, heart failure, and urological dysfunction. Myoblast transplantation into dystrophic skeletal muscle, infarcted heart, and dysfunctioning urinary ducts has shown that engrafted myoblasts can differentiate into muscle fibers in the host tissues and display partial functional improvement in these diseases. Therefore, the development of efficient purification methods of quiescent satellite cells from skeletal muscle, as well as the establishment of satellite cell-derived myoblast cultures and transplantation methods for myoblasts, are essential for understanding the molecular mechanisms behind satellite cell self-renewal, activation, and differentiation. Additionally, the development of cell-based therapies for muscular dystrophy and other regenerative diseases are also dependent upon these factors.

However, current prospective purification methods of quiescent satellite cells require the use of expensive fluorescence-activated cell sorting (FACS) machines. Here, we present a new method for the rapid, economical, and reliable purification of quiescent satellite cells from adult mouse skeletal muscle by enzymatic dissociation followed by magnetic-activated cell sorting (MACS). Following isolation of pure quiescent satellite cells, these cells can be cultured to obtain large numbers of myoblasts after several passages. These freshly isolated quiescent satellite cells or ex vivo expanded myoblasts can be transplanted into cardiotoxin (CTX)-induced regenerating mouse skeletal muscle to examine the contribution of donor-derived cells to regenerating muscle fibers, as well as to satellite cell compartments for the examination of self-renewal activities.

The isolation and culture of a pure population of quiescent satellite cells, a muscle stem cell population, is essential to the understanding of muscle stem cell biology and regeneration, as well as stem cell transplantation for therapies in muscular dystrophy and other degenerative diseases.&#160;

L&#39;isolement, la culture, et la transplantation de cellules satellites du muscle

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling pathways involved in vascular smooth muscle contraction in PASMC from fetal sheep. While sheep make an excellent model of term pulmonary hypertension, they are very expensive and lack the advantage of genetic manipulation found in mice. Conversely, the inability to isolate PASMC from mice was a significant limitation of that system. Here we described the isolation of primary cultures of mouse PASMC from P7, P14, and P21 mice using a variation of the previously described technique of Marshall et al.26 that was previously used to isolate rat PASMC. These murine PASMC represent a novel tool for the study of signaling pathways in the neonatal period. Briefly, a slurry of 0.5% (w/v) agarose + 0.5% iron particles in M199 media is infused into the pulmonary vascular bed via the right ventricle (RV). The iron particles are 0.2 &#956;M in diameter and cannot pass through the pulmonary capillary bed. Thus, the iron lodges in the small pulmonary arteries (PA). The lungs are inflated with agarose, removed and dissociated. The iron-containing vessels are pulled down with a magnet. After collagenase (80 U/ml) treatment and further dissociation, the vessels are put into a tissue culture dish in M199 media containing 20% fetal bovine serum (FBS), and antibiotics (M199 complete media) to allow cell migration onto the culture dish. This initial plate of cells is a 50-50 mixture of fibroblasts and PASMC. Thus, the pull down procedure is repeated multiple times to achieve a more pure PASMC population and remove any residual iron. Smooth muscle cell identity is confirmed by immunostaining for smooth muscle myosin and desmin.

We have developed a novel and reproducible technique to isolate primary cultures of pulmonary artery smooth muscle cells (PASMC) from mice as young as P7, thereby allowing better study of the signaling pathways involved in neonatal smooth muscle cell contraction and relaxation.

Isolement de l&#39;artère pulmonaire cellules musculaires lisses de souris néonatales

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Isolation and Purification of Murine Cardiac Pericytes

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier integrity. However, their tissue-specific functions in the heart are not well understood. Moreover, there is currently no protocol utilizing readily accessible materials to isolate and purify pericytes of cardiac origin. Our protocol focuses on using the widely used mammalian model, the mouse, as our source of cells. Using the enzymatic digestion and mechanical dissociation of heart tissue, we obtained a crude cell mixture that was further purified by fluorescence activating cell sorting (FACS) by a plethora of markers. Because there is no single unequivocal marker for pericytes, we gated for cells that were CD31-CD34-CD45-CD140b+NG2+CD146+. Following purification, these primary cells were cultured and passaged multiple times without any changes in morphology and marker expression. With the ability to regularly obtain primary murine cardiac pericytes using our protocol, we hope to further understand the role of pericytes in cardiovascular physiology and their therapeutic potential.

We have optimized a protocol to isolate and purify murine cardiac pericytes for basic research and investigation of their biology and therapeutic potential.

Isolement et purification des périphytes cardiaques murines

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier ...

Médecine

Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate filament proteins that sustain the nuclear envelope and the components of the nucleoplasm. We recently reported that muscle wasting in EDMD can be ascribed to intrinsic epigenetic dysfunctions affecting muscle (satellite) stem cells regenerative capacity. Isolation and culture of single myofibers is one of the most physiological ex-vivo approaches to monitor satellite cells behavior within their niche, as they remain between the basal lamina surrounding the fiber and the sarcolemma. Therefore, it represents an invaluable experimental paradigm to study satellite cells from a variety of murine models. Here, we describe a re-adapted method to isolate intact and viable single myofibers from post-natal hindlimb muscles (Tibialis Anterior, Extensor Digitorum Longus, Gastrocnemius and Soleus). Following this protocol, we were able to study satellite cells from Lamin &#916;8-11 -/- mice, a severe EDMD murine model, at only 19 days after birth.
We detail the isolation procedure, as well as the culture conditions for obtaining a good amount of myofibers and their associated satellite-cells-derived progeny. When cultured in growth-factors rich medium, satellite cells derived from wild type mice activate, proliferate, and eventually differentiate or undergo self-renewal. In homozygous Lamin &#916;8-11 -/- mutant mice these capabilities are severely impaired.
This technique, if strictly followed, allows to study all processes linked to the myofiber-associated satellite cell even in early post-natal developmental stages and in fragile muscles.

Here, we propose a method to efficiently obtain single muscle fibers at early post-natal developmental stages from homozygous mutant Lamin &#916;8-11 mouse model, a very severe model for Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD).

Isolement et culture myofiber uniques à partir d’un modèle murin de la dystrophie musculaire Emery-Dreifuss dans le développement post-natal précoce

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate ...

A High Output Method to Isolate Cerebral Pericytes from Mouse

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood brain barrier formation and physiology is now demonstrated but its molecular basis remains largely unknown. As the pathophysiological role of cerebral pericytes in neurological disorders is intriguing and of great importance, the in vitro models are not only sufficiently appropriate but also able to incorporate different techniques for these studies. Several methods have been proposed as in vitro models for the extraction of cerebral pericytes, although an antibiotic-free protocol with high output is desirable. Most importantly, a method that has increased output per extraction reduces the usage of more animals.
Here, we propose a simple and efficient method for extracting cerebral pericytes with sufficiently high output. The mouse brain tissue homogenate is mixed with a BSA-dextran solution for the separation of the tissue debris and microvascular pellet. We propose a three-step separation followed by filtration to obtain a microvessel rich filtrate. With this method, the quantity of microvascular fragments obtained from 10 mice is sufficient to seed 9 wells (9.6 cm2 each) of a 6-well plate. Most interestingly with this protocol, the user can obtain 27 pericyte rich wells (9.6 cm2 each) in passage 2. The purity of the pericyte cultures are confirmed with the expression of classical pericyte markers: NG2, PDGFR-&#946; and CD146. This method demonstrates an efficient and feasible in vitro tool for physiological and pathophysiological studies on pericytes.

We present a protocol for the extraction of murine cerebral pericytes. Based on an antibiotic-free enrichment oriented pericyte extraction, this protocol is a valuable tool for in vitro studies providing high purity and high yield, thus decreasing the number of experimental animals used.

Une méthode de sortie élevée pour isoler les péricartétes cérébraux de la souris

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood ...

Isolation of Quiescent Stem Cell Populations from Individual Skeletal Muscles

Skeletal muscle harbors distinct populations of adult stem cells that contribute to the homeostasis and repair of the tissue. Skeletal muscle stem cells (MuSCs) have the ability to make new muscle, whereas fibro-adipogenic progenitors (FAPs) contribute to stromal supporting tissues and have the ability to make fibroblasts and adipocytes. Both MuSCs and FAPs reside in a state of prolonged reversible cell cycle exit, called quiescence. The quiescent state is key to their function. Quiescent stem cells are commonly purified from multiple muscle tissues pooled together in a single sample. However, recent studies have revealed distinct differences in the molecular profiles and quiescence depth of MuSCs isolated from different muscles. The present protocol describes the isolation and study of MuSCs and FAPs from individual skeletal muscles and presents strategies to perform molecular analysis of stem cell activation. It details how to isolate and digest muscles of different developmental origin, thicknesses, and functions, such as the diaphragm, triceps, gracilis, tibialis anterior (TA), gastrocnemius (GA), soleus, extensor digitorum longus (EDL), and the masseter muscles. MuSCs and FAPs are purified by fluorescence-activated cell sorting (FACS) and analyzed by immunofluorescence staining and 5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine (EdU) incorporation assay.

This protocol describes the isolation of muscle stem cells and fibro-adipogenic progenitors from individual skeletal muscles in mice. The protocol involves single muscle dissection, stem cell isolation by fluorescence activated cell sorting, purity assessment by immunofluorescence staining, and quantitative measurement of S-phase entry by 5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine incorporation assay.

Isolement de populations de cellules souches quiescentes à partir de muscles squelettiques individuels

Skeletal muscle harbors distinct populations of adult stem cells that contribute to the homeostasis and repair of the tissue. Skeletal muscle stem cells ...

Isolation des Pericytes de Type I et de Type II des Muscles Squelets de la Souris

Résumé

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