Wir erhielten technische Unterstützung von der Biopolymers Facility der Harvard Medical School für Bioanalysatoren. Diese Arbeit wurde durch das Forschungsstipendium der National Multiple Sclerosis Society RG-1707-28516 (H.L.W. und S.L.) unterstützt.

Alle hier beschriebenen Methoden mit Versuchstieren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Brigham and Women's Hospital der Harvard Medical School genehmigt.
Alle hier beschriebenen Methoden mit Humanforschungssubjekten entsprechen den Richtlinien des Partners Human Research Committee.
1. Entnahme von Kotproben
<ol><li>Autoklav oder Vorbereitung eines sterilen und nukleasefreien 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchens mit Schraubverschluss für jedes Tier in einem Versuch.<ol><li>Stellen Sie für menschliche Probanden eine geeignete, nukleasefreie und sterile Stuhlprobenentnahmevorrichtung für jeden Probanden bereit.</li>
	</ol></li>
	<li>Sammeln Sie 25-100 mg (ca. 1-4 Kotpellets für Mauskotproben) Stuhlproben von jedem Tier in einer sterilen Umgebung. HINWEIS: Zwei oder mehr fäkale Pellets (~ 50 mg oder schwerer) werden bevorzugt, um RNA von höchster Reinheit zu erhalten.<ol><li>Verwenden Sie alle notwendigen persönlichen Schutzausrüstungen (PSA) und Materialien, zum Beispiel: ein Paar Laborhandschuhe, ein Desinfektionsspray und ein steriles Papiertuch, um den Arbeitsbereich zu sterilisieren, in dem das Tierversuchsobjekt platziert wird, um eine Kontamination der Fäkalienprobe zu vermeiden.<ol><li>Weisen Sie bei Menschen jede Forschungsperson / jeden Sammler an, 100-200 mg Stuhlproben in einer möglichst sterilen Umgebung zu sammeln. Verwenden Sie den standardmäßigen sterilen Betrieb und vermeiden Sie die Kontamination der Stuhlprobe.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Sammeln Sie Stuhlproben von jedem Tier direkt in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss, ohne andere Oberflächen zu berühren, um eine Kontamination zu vermeiden.<ol><li>Weisen Sie jeden Probanden an, direkt in ein geeignetes Entnahmegerät (z. B. ein steriles Stuhlprobenentnahmeset) zu defäkieren, um eine Kontamination zu vermeiden. HINWEIS: Weisen Sie das Subjekt an, eine Kontamination durch Toilettenoberflächen, Wasser, Urin oder andere nicht sterile Oberflächen / Gegenstände zu vermeiden.</li>
	</ol></li>
	<li>Fäkalproben, die in 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen gesammelt wurden, sofort bei -80 °C einfrieren oder in einen Eimer Trockeneis geben, um die bessere Menge und Qualität der RNA zu erhalten, bevor der Kot wie in den folgenden Schritten beschrieben resuspendiert wird.<ol><li>Bei menschlichen Stuhlproben aliquot jede frische Probe von 200 mg in 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschlüssen geben und bei -80 °C einfrieren, bevor der Kot wie unten beschrieben resuspendiert wird.<ol><li>Für die Lagerung von Stuhlproben, die sich nicht in 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschlüssen befinden, werden jeweils 100-200 mg gefrorene Proben gewogen und in separate 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschlüssen überführt, bevor der Kot wie unten beschrieben resuspendiert wird. HINWEIS: Vermeiden Sie bei menschlichen Stuhlproben die Entnahme von mehr als 200 mg Stuhlproben zur RNA-Isolierung, da dies in den folgenden Schritten zu Schwierigkeiten führen kann. Bei einer überladenen Probe in einem 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen sind die wässrige Phase, die organische Phase und die Interphase möglicherweise nicht eindeutig gebildet und getrennt. Die Prozedur kann hier pausiert werden.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Zubereitung von Waschlösungen
<ol><li>Fügen Sie 21 ml 100%iges Ethanol der American Chemical Society (ACS) zu der Waschlösung 1 hinzu, die im miRNA-Isolierkit enthalten ist (siehe Materialtabelle), um das Endvolumen von 30 ml zu erreichen, wie auf der Flasche angegeben. Wirbeln, bis sich alles in der Flasche auflöst.</li>
	<li>Fügen Sie 40 ml ACS-Ethanol der Qualität 100% in die bereitgestellte Waschlösung 2/3 hinzu, um das Endvolumen von 50 ml zu erreichen, wie auf der Flasche angegeben. Wirbel für 5 s oder bis die endgültige Mischung gut gemischt ist.</li>
</ol>3. Vorbereitung von Geräten und Materialien
<ol><li>Besprühen Sie den Arbeitsbereich und die Ausrüstung, z. B. den Labortisch, den Arbeitsbereich im chemischen Abzug und die Mikrozentrifugenröhrchengestelle, mit einer Ribonuklease (RNase) Dekontaminationslösung (z. B. handelsübliche RNase-Dekontaminationslösung). Um eine Kontamination zu vermeiden, tragen Sie die RNase-Dekontaminationslösung auf die Oberflächen auf, wo und wann immer dies für notwendig erachtet wird.</li>
	<li>Ziehen Sie einen sauberen Laborkittel an, setzen Sie eine Gesichtsmaske auf und tragen Sie geeignete Laborhandschuhe, um die RNA in den Kotproben vor Nukleasen auf der menschlichen Haut zu schützen. Sprühen Sie Handschuhe mit einer RNase-Dekontaminationslösung und wechseln Sie die Handschuhe häufig, um eine Kontamination zu vermeiden.</li>
	<li>Bereiten Sie einen Eimer Trockeneis für fäkale Proben vor, die bei -80 °C gelagert werden, um ein Auftauen vor der Resuspension von Kot zu verhindern, und einen Eimer Eis für Materialien, zum Beispiel: Säure-Phenol: Chloroform, um die Haltbarkeit zu verlängern. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Materialien, einschließlich der im Protokoll verwendeten Medien, steril sind, ohne dass Nukleasen kontaminiert werden.</li>
</ol>4. Fäkalien Resuspension
<ol><li>Resuspendieren Sie 25-100 mg Stuhlproben in 600 μL steriler 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) von Dulbecco. VORSICHT: Fäkalproben sollten sofort verarbeitet werden, wenn sie ab -80 °C aufgetaut werden, ohne auch nur teilweise aufzutauen, um die Freisetzung von RNasen und zellulärer RNA zu minimieren, da Eiskristalle sowohl innere als auch äußere Zellkompartimente reißen, wenn Zellen in der Probe auftauen.<ol><li>Fügen Sie 600 μL 1x DPBS in das 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss mit Kotproben bei Raumtemperatur (RT) hinzu.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Mischung von Stuhlproben, die in 600 μL 1x DPBS in das 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen getaucht sind, das für 30 min bei RT verschlossen ist.</li>
		<li>Resuspendieren Sie die Mischung durch Maischen mit 1 ml Pipettenspitze und Wirbelbohrung mit dem 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Um die Menge und Qualität der RNA zu optimieren und zu erhöhen, resuspendieren Sie die Mischung mit einem Homogenisator mit der Einstellung für einen Zyklus bei S4000 (oder 4000 U/min) und 45 s.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Organische Extraktion
VORSICHT: Verwenden Sie den gefährlichen chemischen Abzug für die folgenden Schritte bis Schritt 6 unter Verwendung von Säurephenol: Chloroform und ACS Klasse 100% Ethanol aufgrund ihrer Toxizität und Entflammbarkeit. Wechseln Sie die PSA nach Bedarf und befolgen Sie die entsprechenden Standardvorsichtsmaßnahmen beim Umgang mit Gefahrgut.
<ol><li>Extrakt RNA mit 600 μL Säure-Phenol: Chloroform (das Volumen von Säure-Phenol: Chloroform erforderlich entspricht dem Anfangsvolumen von 1x DPBS in Schritt 4.1).<ol><li>600 μL Säure-Phenol: Chloroform in die Suspension aus Schritt 4.1 geben. HINWEIS: Säure-Phenol: Chloroform aus der unteren Phase in der Flasche zurückziehen, da die obere Phase mit einem wässrigen Puffer gemischt wird. Wenn die Interphase zwischen diesen beiden Phasen gestört ist, warten Sie und ziehen Sie Säure-Phenol: Chloroform nur zurück, wenn sich die Interphase wieder etabliert, um eine Kontamination zu vermeiden.</li>
	</ol></li>
	<li>Wirbeln Sie die Mischung für 60 s gründlich mischen. Alternativ, um die Menge an RNA in der Ausbeute zu optimieren und zu erhöhen, mischen Sie mit einem Homogenisator mit der Einstellung für einen Zyklus bei S4000 und 45 s.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie für 15 min bei 10.000 x g RT, um die wässrige und organische Phase mit einer Mikrozentrifuge zu trennen. Nach der Zentrifugation sollte die Interphase kompakt sein. Wenn nicht, wiederholen Sie die Zentrifugation. HINWEIS: Wenn die Interphase nicht so kompakt wie gewünscht sein kann, möglicherweise aufgrund eines ungleichmäßigen Verhältnisses des Anfangsvolumens zum Volumen des zugesetzten Säurephenols: Chloroform nach mehreren Zentrifugationswiederholungen, fahren Sie fort, die wässrige Phase mit größerer Sorgfalt wiederherzustellen, um eine Kontamination zu vermeiden.</li>
	<li>Gewinnen Sie die wässrige Phase zurück und übertragen Sie sie in ein neues 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Scharnierkappe (nicht im miRNA-Isolierungskit enthalten).<ol><li>Entfernen Sie die wässrige (oder obere) Phase vorsichtig, ohne die untere Phase zu stören, und geben Sie sie in ein neues 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Scharnierkappe. Beachten Sie das übertragene Volumen (z. B. ~500 μL). HINWEIS: Wenn die Interphase kompakt ist und die obere Phase klar getrennt ist, schwimmen möglicherweise einige winzige Restpartikel auf der Oberseite der wässrigen Phase. Pipettieren Sie vorsichtig, um diese Rückstände zu vermeiden und nur sichtbar und deutlich getrennte wässrige Phase zu gewinnen, um eine qualitativ hochwertige RNA-Ausbeute zu gewährleisten, auch wenn Sie nur ein kleines Volumen der wässrigen Phase erhalten könnten.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Endgültige RNA-Isolierung
<ol><li>Fügen Sie 1,25 Volumen RT ACS-Ethanol der Klasse 100% in die wässrige Phase im 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen hinzu (z. B. fügen Sie 625 μL 100% Ethanol hinzu, wenn 500 μL wässrige Phase aus Schritt 5.4 gewonnen werden). Wirbel 3 s.</li>
	<li>Laden Sie das wässrige Phasen-Ethanol-Gemisch durch die Filterkartusche, die im miRNA-Isolierkit enthalten ist.<ol><li>Legen Sie die Filterpatrone für jede Probe in eines der vom Kit gelieferten Sammelröhrchen.<ol><li>600 μL des wässrigen Phasen/Ethanol-Gemisches werden pipettiert und in die Filterpatrone geladen. HINWEIS: Wirbeln Sie die Mischung kurz durch, um das Ethanol vor dem Pipettieren gründlich mit wässriger Phase zu mischen. Es können nicht mehr als 700 μL des wässrigen Phasen-Ethanol-Gemisches gleichzeitig geladen werden.</li>
		</ol></li>
		<li>Zentrifugieren Sie bei 10.000 x g für 90 s, um durch die Mischung zu filtern. Das Drehen mit einer höheren Geschwindigkeit kann den Filter beschädigen.</li>
		<li>Das Filtrat wird verworfen und die Schritte 6.2.1 bis 6.2.2 wiederholt, bis das gesamte Gemisch in aufeinanderfolgenden Anwendungen durch dieselbe Filtermembran filtriert ist. Bewahren Sie das gleiche Sammelrohr für die unten aufgeführten Waschschritte auf und verwenden Sie es wieder.</li>
		<li>Waschen Sie den Filter mit 700 μL miRNA Wash Solution 1. ACHTUNG: miRNA Wash Solution 1 enthält Guanidinthiocyanat, das Hautreizungen und schwere Augenschäden verursachen kann. Tragen Sie notwendige PSA, zum Beispiel: Handschuhe, Gesichtsschutz, Laborschutzkittel. Wechseln Sie die Handschuhe häufig nach Bedarf.<ol><li>700 μL miRNA Wash Solution 1, die mit ACS-Ethanol hergestellte Arbeitslösung, in die Filterpatrone geben.</li>
			<li>Zentrifugieren Sie für 60 s, um die miRNA Wash Solution 1 durch die Filterpatrone zu filtrieren.</li>
			<li>Entsorgen Sie das Filtrat aus dem Sammelröhrchen und legen Sie dieselbe Filterpatrone in dasselbe Sammelröhrchen.</li>
		</ol></li>
		<li>Waschen Sie den Filter mit Waschlösung 2/3 einmal mit Volumina von jeweils 700 μL, 500 μL und 250 μL hintereinander.<ol><li>Tragen Sie 700 μL Waschlösung 2/3, die mit der ACS-Qualität 100% Ethanol hergestellte Arbeitslösung, in die Filterpatrone auf.<ol><li>Zentrifugieren bei 10.000 x g für 1 min.</li>
				<li>Entsorgen Sie das Filtrat aus dem Sammelröhrchen und legen Sie dieselbe Filterpatrone in dasselbe Sammelröhrchen.</li>
			</ol></li>
			<li>Geben Sie 500 μL Waschlösung 2/3 in die Filterpatrone.<ol><li>Zentrifugieren bei 10.000 x g für 1 min.</li>
				<li>Entsorgen Sie das Filtrat aus dem Sammelröhrchen und legen Sie dieselbe Filterpatrone in dasselbe Sammelröhrchen.</li>
			</ol></li>
			<li>Geben Sie 250 μL Waschlösung 2/3 in die Filterpatrone.<ol><li>Zentrifugieren bei 10.000 x g für 1 min.</li>
				<li>Verwerfen Sie das Filtrat aus dem Sammelrohr.</li>
			</ol></li>
			<li>Füllen Sie die Filterpatrone in ein neues Auffangrohr und drehen Sie die Baugruppe 5 Minuten lang, um die Restflüssigkeit aus dem Filter zu entfernen.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>7. Elue RNA mit 50 μL nukleasefreiem Wasser
<ol><li>Füllen Sie die Filterpatrone in ein neues Auffangrohr. Pipettieren Sie 50 μL nukleasefreies Wasser in die Mitte des Filters und verschließen Sie das Sammelrohr.<ol><li>Inkubieren bei RT für 10 min.</li>
		<li>Spin für 5 min bei 8.000 x g , um RNA in das neue Sammelröhrchen zurückzugewinnen.</li>
		<li>Bestimmen Sie die Konzentration und Reinheit der gewonnenen fäkalen RNA mit einem Fluorometer. Die gewonnene fäkale RNA kann bei -80 °C gelagert werden.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Das, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+RNA+communication+consortium%3A+Establishing+foundational+knowledge+and+technologies+for+extracellular+RNA+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The extracellular RNA communication consortium: Establishing foundational knowledge and technologies for extracellular RNA research.</a> Cell. 177 (2), 231-242 (2019).</li>
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<li>Giannoukos, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+robust+RNA-seq+process+for+cultured+bacteria+and+complex+community+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Efficient and robust RNA-seq process for cultured bacteria and complex community transcriptomes.</a> Genome Biology. 13 (3), 23(2012).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine relevanten oder wesentlichen finanziellen Interessen, die im Zusammenhang mit der in diesem Protokollpapier beschriebenen Forschungsmethode stehen.

Es ist wichtig, eine RNase-freie Technik zu verwenden, um eine RNase-Kontamination während der Isolierung zu verhindern7. Nach der Zentrifugation und der Bildung einer kompakten Interphase ist es wichtig, zu vermeiden, dass die Interphase, die untere Phase und die Partikelverunreinigung auf der Oberseite der wässrigen Phase schwimmen, wenn die wässrige Phase zurückgewonnen wird. Zusätzlich werden zwei Waschschritte mit 500 μL und 250 μL Waschlösung 2/3 hinzugefügt, um Verunreinigungen in der Filtermembran für eine optimierte Qualität zu eliminieren. Darüber hinaus wird ein Startprobenmaterial von mehr als 200 mg nicht empfohlen, da dies die klare Bildung einer Interphase erschweren kann. Ebenso wird ein Probenmaterial von weniger als 25 mg nicht empfohlen, da es möglicherweise nicht ausreicht, genügend RNA-Proben für die nachgeschaltete Analyse zu extrahieren.
Das unglaubliche Wachstum der Mikrobiomforschung hat die Messungen mikrobieller Spezies und Gene zu metatranskriptionellen Studien des mikrobiellen Profils vorangetrieben8. MicroRNAs im Stuhl wurden als Marker für Krankheiten 9,10,11 untersucht. Seit dem ersten Bericht über fäkale microRNA-vermittelte Wirt-Mikroben-Interaktionen3 beginnen zunehmende Studien, die Beiträge von Wirt und Ernährung im Darmökosystem zu untersuchen12,13,14. Aufgrund des Reichtums an Mikroben im Darmlumen und Kot erfordern Studien, die sich auf den Wirtsarm der Wirt-Mikroben-Interaktion konzentrieren, eine minimale RNA-Kontamination von Mikroben. Daher ist ein RNA-Extraktionsprotokoll, das Schritte der Zelllyse15 enthält, nicht ideal für die Untersuchung von RNAs, die aus Wirt und Nahrung freigesetzt werden. Daher haben wir dieses Protokoll angepasst, um Lyseschritte zur Minimierung von RNA-Kontaminationen von lebenden Bakterien und lebenden Wirtszellen im Kot zu eliminieren.
Dieses Protokoll funktioniert für Studien, bei denen extrazelluläre RNA im Stuhl- oder Darmlumengehalt ein interessantes Ziel ist. RNA, die mit diesem Protokoll isoliert wird, ist Gesamt-RNA, einschließlich microRNA als Hauptkomponente. Dieses Protokoll unterscheidet nicht, ob die RNA in Exosom, Mikrovesikel oder in einer vesikelfreien Form vorliegt.

Extrazelluläre RNA wird als ein bedeutender Faktor erkannt, der viele biologische Prozesse vermittelt1. Extrazelluläre RNA im Kot wurde erstmals 2008 als Marker für Darmkrebs und aktive Colitis ulcerosa2 berichtet und kürzlich als normaler Bestandteil des Darmlumens und -kots nachgewiesen und vermittelt die Wirt-Mikroben-Kommunikation 3,4,5. Der Zweck dieses RNA-Isolationsprotokolls ist es, qualitativ hochwertige extrazelluläre RNA aus Stuhlproben von Tieren und Menschen zu extrahieren. Das Protokoll wurde von einem kommerziellen miRNA Isolation Kit adaptiert. Die gewonnene RNA wird für nachgeschaltete Analysen wie RNA-Sequenzierung, RT-PCR und Micro-Array verwendet. Das Protokoll enthält mehrere wichtige und nützliche Tipps, um die Menge und Qualität der RNA im Kot von Tieren und Menschen zu maximieren. Der Grund für die Entwicklung und Optimierung dieser Methode der RNA-Isolierung (einschließlich microRNA) besteht darin, die mikrobielle RNA im Kot zu verringern, die Variablen in den Forschungsstudien zu begrenzen und die RNA-Zusammensetzung im Darm zu analysieren, ohne verschiedene Störfaktoren und Kontaminationsquellen zu berücksichtigen. Bemerkenswert ist, dass diese RNA-Isolierung die Freisetzung von RNA aus lebenden Zellen und lebenden Mikroben (zelluläre RNA) minimiert. Es konzentriert sich auf extrazelluläre RNAs, die von Darmzellen freigesetzt oder über die Nahrung aufgenommen wurden. Grundsätzlich ist diese Methode nicht für Studien geeignet, bei denen das mikrobielle Transkriptom untersucht wird.

<table><tbody><tr><td>Acid-Phenol: Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>AM9720</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, no calcium, no magnesium</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Gloves</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mirVana miRNA Isolation Kit</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>AM1561</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-Free microcentrifuge tubes (1.5 mL, 2 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-Free Water (Not DEPC-treated)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Pipettor and Nuclease-Free Pipette tips (with filter)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PowerLyzer 24 Homogenizer</td><td>QIAGEN</td><td>13155</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Shaker</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fecal (micro) rna isolation

Es wird deutlich, dass RNA im Darmlumen und Kot von Tieren und Menschen existiert. Das unten beschriebene Protokoll isoliert die Gesamt-RNA einschließlich microRNAs aus Stuhlproben von Tieren und Menschen. Ziel ist es, Gesamt-RNA mit hoher Reinheit und Menge für nachgeschaltete Analysen wie RNA-Sequenzierung, RT-PCR und Micro-Array zu isolieren. Die Vorteile dieses optimierten Protokolls in der miRNA-Isolierung sind die Fähigkeit, hochgereinigte RNA-Produkte mit zusätzlichen beschriebenen Waschschritten zu isolieren, eine erhöhte Menge an RNA, die mit einer verbesserten Methode bei der Resuspension der Probe erhalten wird, und wichtige Tipps zur Dekontamination. Eine Einschränkung ist die Unfähigkeit, größere Proben von mehr als 200 mg zu verarbeiten und zu reinigen, da diese Probengrößen eine Schwierigkeit bei der klaren Bildung der Interphase verursachen würden. Folglich kann die große Probengröße die zu extrahierende wässrige Phase wie im Protokoll beschrieben mit organischen Stoffen kontaminieren, die die Qualität der am Ende isolierten RNA beeinträchtigen. Für die meisten nachgeschalteten Analysen reichen jedoch RNA-Isolate aus einer Probe von bis zu 200 mg aus.

Repräsentative RNAs wurden aus 50 mg Mauskotproben (2 Mauskotpellets) bzw. 100 mg menschlichen Stuhlproben isoliert und in 50 μL nukleasefreiem Wasser eluiert. Die Spektralphotometeranalyse der Konzentration legt nahe, dass insgesamt 49 μg bzw. 16 μg RNA isoliert wurden (Tabelle 1). Die RNA-Reinheit war hoch, was durch ein A260/A280-Verhältnis von ~2,0 und ein A260/A230-Verhältnis von ~1,8 angezeigt wird (Tabelle 1). Wie berichtet3, ist die Mehrheit der RNAs im Kot microRNA und diese microRNAs können im Exosom existieren. In Übereinstimmung damit legt ein Chip-basierter Elektrophorese-Assay von RNA nahe, dass repräsentative RNA-Isolate aus Maus- und menschlichen Fäkalien in 18S- und 28S-rRNA-Zusammensetzungen niedrig sind oder fehlen und die Größe der RNA-Isolate in die kleine RNA-Region fällt (Abbildung 1A). Eine weitere kleine RNA-Elektrophorese mit der chipbasierten Elektrophorese zeigt, dass ein großer Teil der RNAs von microRNA-Größe ist (Abbildung 1B). Dies steht im Einklang mit der Beobachtung, dass die mit einem kleinen RNA-Bioanalysator durchgeführte Quantifizierung mit der mit früheren Assays6 vergleichbar ist.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Beispiel-ID</td>
			<td>Elutionsvolumen (μL)</td>
			<td>RNA-Konzentration (ng/μL)</td>
			<td>A260/A280</td>
			<td>A260/A230</td>
			<td>Ertrag (ng)</td>
		</tr><tr><td>Maus</td>
			<td>50</td>
			<td>978.333</td>
			<td>2.036</td>
			<td>1.897</td>
			<td>48916.65</td>
		</tr><tr><td>Mensch</td>
			<td>50</td>
			<td>330.759</td>
			<td>1.981</td>
			<td>1.849</td>
			<td>16537.95</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Repräsentative Nanotropfenanalyse von RNA, die mit diesem Protokoll isoliert wurde. Repräsentative RNAs wurden aus 2 Mauskotpellets oder 100 mg menschlichen Stuhlproben isoliert, die in 50 μL nukleasefreiem Wasser eluiert wurden. Die RNA-Konzentration, das Verhältnis von A260/A280 und das Verhältnis von A260/A230 wurden mit Nanotropfen gemessen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61908/61908fig01.jpg"> Abbildung 1: Repräsentative chipbasierte Elektrophorese-Analysen der Größenverteilung fäkaler RNA-Isolate. (A) Repräsentative RNAs, die aus 2 Mauskotpellets (linkes Bild) und 100 mg menschlichen Stuhlproben (rechtes Bild) unter Verwendung des hier beschriebenen Protokolls isoliert wurden, wurden mit dem Chip-basierten Elektrophorese-Assay charakterisiert. Dieser Assay legt nahe, dass die Mehrheit der RNA-Isolate kleine RNA waren. (B) Die Isolate wurden dann für die kleine RNA-Elektrophorese mit dem chipbasierten Elektrophoresesystem unterzogen, um die Größenverteilung der Isolate zu analysieren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61908/61908fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

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Fecal micro RNA Isolation

Dieses Protokoll isoliert hochwertige Gesamt-RNA aus Kotproben von Tieren und Menschen. Ein kommerzielles miRNA-Isolierkit wird mit signifikanter Adaption verwendet, um reine RNA mit optimierter Quantität und Qualität zu isolieren. Die RNA-Isolate eignen sich für die meisten nachgeschalteten RNA-Assays wie Sequenzierung, Micro-Array und RT-PCR.

Fäkale (Mikro-) RNA-Isolierung

It is becoming clear that RNA exists in the gut lumen and feces in animals and humans. The protocol described below isolates total RNA including microRNAs ...

Nanyang Technological University

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Immunology and Infection

Unit 1

Fecal (micro) RNA Isolation

Diagnostic and Radiological Studies of the GI System

SCIENTISTS IN ACTION

4.7K Aufrufe.  Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School. Dieses Protokoll isoliert hochwertige Gesamt-RNA aus Kotproben von Tieren und Menschen. Ein kommerzielles miRNA-Isolierkit wird mit signifikanter Adaption verwendet, um reine RNA mit optimierter Quantität und Qualität zu isolieren. Die RNA-Isolate eignen sich für die meisten nachgeschalteten RNA-Assays wie Sequenzierung, Micro-Array und RT-PCR.

Serie: Fecal micro RNA Isolation

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. They are composed of position-dependent, cis-acting RNA elements and unique combinations of RNA binding proteins. Defining the composition of a specific RNP is essential to achieving a fundamental understanding of gene regulation. The isolation of a select RNP is akin to finding a needle in a haystack. Here, we demonstrate an approach to isolate RNPs associated at the 5' untranslated region of a select mRNA in asynchronous, transfected cells. This cognate RNP has been demonstrated to be necessary for the translation of select viruses and cellular stress-response genes.
The demonstrated RNA-protein co-precipitation protocol is suitable for the downstream analysis of protein components through proteomic analyses, immunoblots, or suitable biochemical identification assays. This experimental protocol demonstrates that DHX9/RNA helicase A is enriched at the 5' terminus of cognate retroviral RNA and provides preliminary information for the identification of its association with cell stress-associated huR and junD cognate mRNAs.

This manuscript describes an approach to isolate select cognate RNPs formed in eukaryotic cells via a specific oligonucleotide-directed enrichment. We demonstrate the applicability of this approach by isolating a cognate RNP bound to the retroviral 5' untranslated region that is composed of DHX9/RNA helicase A.

Isolierung von Cognate RNA-Protein-Komplexe von Zellen unter Verwendung von Oligonukleotid-gerichtete Elution

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Forschung

Biochemie

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

Neuartige RNA-bindende Proteine ​​Isolation durch die rasche Methodik

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

Genetik

Simultaneous DNA-RNA Extraction from Coastal Sediments and Quantification of 16S rRNA Genes and Transcripts by Real-time PCR

Real Time Polymerase Chain Reaction also known as quantitative PCR (q-PCR) is a widely used tool in microbial ecology to quantify gene abundances of taxonomic and functional groups in environmental samples. Used in combination with a reverse transcriptase reaction (RT-q-PCR), it can also be employed to quantify gene transcripts. q-PCR makes use of highly sensitive fluorescent detection chemistries that allow quantification of PCR amplicons during the exponential phase of the reaction. Therefore, the biases associated with &#39;end-point&#39; PCR detected in the plateau phase of the PCR reaction are avoided. A protocol to quantify bacterial 16S rRNA genes and transcripts from coastal sediments via real-time PCR is provided. First, a method for the co-extraction of DNA and RNA from coastal sediments, including the additional steps required for the preparation of DNA-free RNA, is outlined. Second, a step-by-step guide for the quantification of 16S rRNA genes and transcripts from the extracted nucleic acids via q-PCR and RT-q-PCR is outlined. This includes details for the construction of DNA and RNA standard curves. Key considerations for the use of RT-q-PCR assays in microbial ecology are included.

A protocol to quantify bacterial 16S rRNA genes and transcripts from coastal sediments via real-time PCR is provided. The methodology includes the co-extraction of DNA and RNA; preparation of DNA-free RNA; and 16S rRNA gene and transcript quantification via RT-q-PCR, including standard curve construction.

Gleichzeitige DNA-RNA-Extraktion aus Küstensedimenten und Quantifizierung von 16S rRNA-Gene und Transkripte von Real-time PCR

Real Time Polymerase Chain Reaction also known as quantitative PCR (q-PCR) is a widely used tool in microbial ecology to quantify gene abundances of ...

Umwelt

Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral subtypes2. Human pandemics of flu originally stem from AIVs3. Many fatal human cases during the H5N1 outbreaks in recent years were reported. Lately, a new AIV related strain swept through the human population, causing the 'swine flu epidemic'4. Although human trading and transportation activity seems to be responsible for the spread of highly pathogenic strains5, dispersal can also partly be attributed to wild birds6, 7. However, the actual reservoir of all AIV strains is wild birds.
In reaction to this and in face of severe commercial losses in the poultry industry, large surveillance programs have been implemented globally to collect information on the ecology of AIVs, and to install early warning systems to detect certain highly pathogenic strains8-12. Traditional virological methods require viruses to be intact and cultivated before analysis. This necessitates strict cold chains with deep freezers and heavy biosafety procedures to be in place during transport. Long-term surveillance is therefore usually restricted to a few field stations close to well equipped laboratories. Remote areas cannot be sampled unless logistically cumbersome procedures are implemented. These problems have been recognised13, 14 and the use of alternative storage and transport strategies investigated (alcohols or guanidine)15-17. Recently, Kraus et al.18 introduced a method to collect, store and transport AIV samples, based on a special filter paper. FTA cards19 preserve RNA on a dry storage basis20 and render pathogens inactive upon contact21. This study showed that FTA cards can be used to detect AIV RNA in reverse-transcription PCR and that the resulting cDNA could be sequenced and virus genes and determined.
In the study of Kraus et al.18 a laboratory isolate of AIV was used, and samples were handled individually. In the extension presented here, faecal samples from wild birds from the duck trap at the Ottenby Bird Observatory (SE Sweden) were tested directly to illustrate the usefulness of the methods under field conditions. Catching of ducks and sample collection by cloacal swabs is demonstrated. The current protocol includes up-scaling of the work flow from single tube handling to a 96-well design. Although less sensitive than the traditional methods, the method of FTA cards provides an excellent supplement to large surveillance schemes. It allows collection and analysis of samples from anywhere in the world, without the need to maintaining a cool chain or safety regulations with respect to shipping of hazardous reagents, such as alcohol or guanidine.

A method to preserve, detect and sequence RNA from Avian Influenza Viruses was validated and extended using natural faecal samples from birds. This technique removes the necessity of maintaining a cool chain and handling of infectious viruses and can be applied in a 96-well high-throughput setup.

Avian Influenza Surveillance mit FTA-Karten: Field Methods, Biosafety-und Transportprobleme gelöst

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral ...

Immunologie und Infektion

Detection and Genogrouping of Noroviruses from Children's Stools By Taqman One-step RT-PCR

Noroviruses (NoVs) are the leading cause of outbreaks of sporadic acute gastroenteritis worldwide in humans of all ages. They are important cause of hospitalizations in children with a public health impact similar to that of Rotavirus. NoVs are RNA viruses of great genetic diversity and there is a continuous appearance of new strains. Five genogroups are recognized; GI and GII with their many genotypes and subtypes being the most important for human infection. However, the diagnosis of these two genotypes remains problematic, delaying diagnosis and treatment. 1, 2, 3
For RNA extraction from stool specimens the most commonly used method is the QIAmp Viral RNA commercial kit from Qiagen. This method combines the binding properties of a silica gel membrane, buffers that control RNases and provide optimum binding of the RNA to the column together with the speed of microspin. This method is simple, fast and reliable and is carried out in a few steps that are detailed in the description provided by the manufacturer. 
 Norovirus is second only to rotavirus as the most common cause of diarrhea. Norovirus diagnosis should be available in all studies on pathogenesis of diarrhea as well as in outbreaks or individual diarrhea cases. At present however norovirus diagnosis is restricted to only a few centers due to the lack of simple methods of diagnosis. This delays diagnosis and treatment 1, 2, 3. In addition, due to costs and regulated transportation of corrosive buffers within and between countries use of these manufactured kits poses logistical problems. As a result, in this protocol we describe an alternative, economic, in-house method which is based on the original Boom et al. method4 which uses the nucleic acid binding properties of silica particles together with the anti-nuclease properties of guanidinium thiocyanate.
For the detection and genogrouping (GI and GII) of NoVs isolates from stool specimens, several RT-PCR protocols utilizing different targets have been developed. The consensus is that an RT-PCR using TaqMan chemistry would be the best molecular technique for diagnosis, because it combines high sensitivity, specificity and reproducibility with high throughput and ease of use. Here we describe an assay targeting the open reading frame 1 (ORF1)-ORF2 junction region; the most conserved region of the NoV genome and hence most suitable for diagnosis. For further genetic analysis a conventional RT-PCR that targets the highly variable N-terminal-shell from the major protein of the capsid (Region C) using primers originally described by Kojima et al. 5 is detailed. Sequencing of the PCR product from the conventional PCR enables the differentiation of genotypes belonging to the GI and GII genogroups.

A One-Step RT-PCR assay for detection and genogroup identification of Norovirus isolates from children&#x2019;s stools, that utilizes primers and TaqMan probes specific to the open reading frame 1 (ORF1)-ORF2 junction region, the most conserved region of the Norovirus genome is described. A non-commercial, cost-effective RNA extraction method is detailed.

Erkennung und Genogrouping von Noroviren aus Kinder-Hocker mit der TaqMan One-Step RT-PCR

Noroviruses (NoVs) are the leading cause of outbreaks of sporadic acute gastroenteritis worldwide in humans of all ages. They are important cause of ...

Medizin

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

RNA Isolierung von Pseudomonas aeruginosa Kolonisierung der Murine Gastrointestinaltrakt

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein complexes is essential to understanding mRNA regulation inferred by interacting proteins or non-coding RNAs. Herein, we describe a tandem RNA isolation procedure (TRIP) that enables the purification of endogenously formed mRNA-protein complexes from cellular extracts. The two-step protocol involves the isolation of polyadenylated mRNAs with antisense oligo(dT) beads and subsequent capture of an mRNA of interest with 3&#39;-biotinylated 2&#39;-O-methylated antisense RNA oligonucleotides, which can then be isolated with streptavidin beads. TRIP was used to recover in vivo crosslinked mRNA-ribonucleoprotein (mRNP) complexes from yeast, nematodes and human cells for further RNA and protein analysis. Thus, TRIP is a versatile approach that can be adapted to all types of polyadenylated RNAs across organisms to study the dynamic re-arrangement of mRNPs imposed by intracellular or environmental cues.

A tandem RNA isolation procedure (TRIP) for recovery of endogenously formed mRNA-protein complexes is described. Specifically, RNA-protein complexes are crosslinked in vivo, polyadenylated RNAs are isolated from extracts with oligo(dT) beads, and particular mRNAs are captured with modified RNA antisense oligonucleotides. Proteins bound to mRNAs are detected by immunoblot analysis.

Ein Oligonukleotid-basierte Tandem RNA Isolierung Vorgehensweise eukaryotischen mRNA-Protein-komplexe

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein ...

Isolation of Viral Replication Compartment-enriched Sub-nuclear Fractions from Adenovirus-infected Normal Human Cells

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments through the recruitment of viral and cellular proteins to sites occupied by the viral genome. These sites, called replication compartments (RC), can be considered viral-induced nuclear domains where the viral genome is localized and viral and cellular proteins that participate in replication, transcription and post-transcriptional processing are recruited. Moreover, cellular proteins involved in the antiviral response, such as tumor suppressor proteins, DNA damage response (DDR) components and innate immune response factors are also co-opted to RC. Although RC seem to play a crucial role to promote an efficient and productive replication cycle, a detailed analysis of their composition and associated activities has not been made. To facilitate the study of adenoviral RC and potentially those from other DNA viruses that replicate in the cell nucleus, we adapted a simple procedure based on velocity gradients to isolate Ad RC and established a cell-free system amenable to conduct morphological, functional and compositional studies of these virus-induced subnuclear structures, as well as to study their impact on host-cell interactions.

We provide a novel strategy to isolate viral replication compartments (RC) from adenovirus (Ad)-infected human cells. This approach represents a cell-free system that can help to elucidate the molecular mechanisms regulating viral genome replication and expression as well as regulation of viral-host interactions established at the RC.

Isolierung der viralen Replikation Compartment angereicherte Teil nuklearen Fraktionen von Adenovirus-infizierten normalen menschlichen Zellen

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments ...

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ease of growth and small size. This small size, though, has disallowed a number of technical approaches found in other model systems. For example, blood transfusions in mammalian systems and grafting techniques in plants enable asking questions of circulatory system composition and signaling. The circulatory system of the worm, the pseudocoelom, has until recently been impossible to assay directly. To answer questions of intercellular signaling and circulatory system composition C. elegans researchers have traditionally turned to genetic analysis, cell/tissue specific rescue, and mosaic analysis. These techniques provide a means to infer what is happening between cells, but are not universally applicable in identification and characterization of extracellular molecules. Here we present a newly developed technique to directly assay the pseudocoelomic fluid of C. elegans. The technique begins with either genetic or physical manipulation to increase the volume of extracellular fluid. Afterward the animals are subjected to a vampiric reverse microinjection technique using a microinjection rig that allows fine balance pressure control. After isolation of extracellular fluid, the collected fluid can be assayed by transfer into other animals or by molecular means. To demonstrate the effectiveness of this technique we present a detailed approach to assay a specific example of extracellular signaling molecules, long dsRNA during a systemic RNAi response. Although characterization of systemic RNAi is a proof of principle example, we see this technique as being adaptable to answer a variety of questions of circulatory system composition and signaling.

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

The model organism C. elegans uses pseudocoelomic fluid as a passive circulatory system. Direct assay of this fluid has not been previously possible. Here we present a novel technique to directly assay the extracellular space, and use systemic silencing signals during an RNAi response as a proof of principle example.

Vampiric Isolation der extrazellulären Flüssigkeit aus<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ...

Biologie

Depletion of Ribosomal RNA for Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity and functionality of the gut community will provide insight into the effects of gut microbiota on mosquito life traits. Metagenomic RNA-Seq has become an important tool to analyze transcriptomes from various microbes present in a microbial community. Messenger RNA usually comprises only 1-3% of total RNA, while rRNA constitutes approximately 90%. It is challenging to enrich messenger RNA from a metagenomic microbial RNA sample because most prokaryotic mRNA species lack stable poly(A) tails. This prevents oligo d(T) mediated mRNA isolation. Here, we describe a protocol that employs sample derived rRNA capture probes to remove rRNA from a metagenomic total RNA sample. To begin, both mosquito and microbial small and large subunit rRNA fragments are amplified from a metagenomic community DNA sample. Then, the community specific biotinylated antisense ribosomal RNA probes are synthesized in vitro using T7 RNA polymerase. The biotinylated rRNA probes are hybridized to the total RNA. The hybrids are captured by streptavidin-coated beads and removed from the total RNA. This subtraction-based protocol efficiently removes both mosquito and microbial rRNA from the total RNA sample. The mRNA enriched sample is further processed for RNA amplification and RNA-Seq.

A ribosomal RNA (rRNA) depletion protocol was developed to enrich messenger RNA (mRNA) for RNA-seq of the mosquito gut metatranscriptome. Sample specific rRNA probes, which were used to remove rRNA via subtraction, were created from the mosquito and its gut microbes. Performance of the protocol can result in the removal of approximately 90-99% of rRNA.

Depletion der ribosomalen RNA für Mosquito Gut metagenomische RNA-seq

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity ...

Fäkale (Mikro-) RNA-Isolierung

Zusammenfassung

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RNA Isolierung von Pseudomonas aeruginosa Kolonisierung der Murine Gastrointestinaltrakt

Ein Oligonukleotid-basierte Tandem RNA Isolierung Vorgehensweise eukaryotischen mRNA-Protein-komplexe

Isolierung der viralen Replikation Compartment angereicherte Teil nuklearen Fraktionen von Adenovirus-infizierten normalen menschlichen Zellen

Vampiric Isolation der extrazellulären Flüssigkeit aus

Depletion der ribosomalen RNA für Mosquito Gut metagenomische RNA-seq

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Isolierung der viralen Replikation Compartment angereicherte Teil nuklearen Fraktionen von Adenovirus-infizierten normalen menschlichen Zellen

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