Wir erhielten technische Unterstützung von der Biopolymers Facility der Harvard Medical School für Bioanalysatoren. Diese Arbeit wurde durch das Forschungsstipendium der National Multiple Sclerosis Society RG-1707-28516 (H.L.W. und S.L.) unterstützt.

Alle hier beschriebenen Methoden mit Versuchstieren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Brigham and Women's Hospital der Harvard Medical School genehmigt.
Alle hier beschriebenen Methoden mit Humanforschungssubjekten entsprechen den Richtlinien des Partners Human Research Committee.
1. Entnahme von Kotproben
<ol><li>Autoklav oder Vorbereitung eines sterilen und nukleasefreien 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchens mit Schraubverschluss für jedes Tier in einem Versuch.<ol><li>Stellen Sie für menschliche Probanden eine geeignete, nukleasefreie und sterile Stuhlprobenentnahmevorrichtung für jeden Probanden bereit.</li>
	</ol></li>
	<li>Sammeln Sie 25-100 mg (ca. 1-4 Kotpellets für Mauskotproben) Stuhlproben von jedem Tier in einer sterilen Umgebung. HINWEIS: Zwei oder mehr fäkale Pellets (~ 50 mg oder schwerer) werden bevorzugt, um RNA von höchster Reinheit zu erhalten.<ol><li>Verwenden Sie alle notwendigen persönlichen Schutzausrüstungen (PSA) und Materialien, zum Beispiel: ein Paar Laborhandschuhe, ein Desinfektionsspray und ein steriles Papiertuch, um den Arbeitsbereich zu sterilisieren, in dem das Tierversuchsobjekt platziert wird, um eine Kontamination der Fäkalienprobe zu vermeiden.<ol><li>Weisen Sie bei Menschen jede Forschungsperson / jeden Sammler an, 100-200 mg Stuhlproben in einer möglichst sterilen Umgebung zu sammeln. Verwenden Sie den standardmäßigen sterilen Betrieb und vermeiden Sie die Kontamination der Stuhlprobe.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Sammeln Sie Stuhlproben von jedem Tier direkt in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss, ohne andere Oberflächen zu berühren, um eine Kontamination zu vermeiden.<ol><li>Weisen Sie jeden Probanden an, direkt in ein geeignetes Entnahmegerät (z. B. ein steriles Stuhlprobenentnahmeset) zu defäkieren, um eine Kontamination zu vermeiden. HINWEIS: Weisen Sie das Subjekt an, eine Kontamination durch Toilettenoberflächen, Wasser, Urin oder andere nicht sterile Oberflächen / Gegenstände zu vermeiden.</li>
	</ol></li>
	<li>Fäkalproben, die in 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen gesammelt wurden, sofort bei -80 °C einfrieren oder in einen Eimer Trockeneis geben, um die bessere Menge und Qualität der RNA zu erhalten, bevor der Kot wie in den folgenden Schritten beschrieben resuspendiert wird.<ol><li>Bei menschlichen Stuhlproben aliquot jede frische Probe von 200 mg in 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschlüssen geben und bei -80 °C einfrieren, bevor der Kot wie unten beschrieben resuspendiert wird.<ol><li>Für die Lagerung von Stuhlproben, die sich nicht in 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschlüssen befinden, werden jeweils 100-200 mg gefrorene Proben gewogen und in separate 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschlüssen überführt, bevor der Kot wie unten beschrieben resuspendiert wird. HINWEIS: Vermeiden Sie bei menschlichen Stuhlproben die Entnahme von mehr als 200 mg Stuhlproben zur RNA-Isolierung, da dies in den folgenden Schritten zu Schwierigkeiten führen kann. Bei einer überladenen Probe in einem 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen sind die wässrige Phase, die organische Phase und die Interphase möglicherweise nicht eindeutig gebildet und getrennt. Die Prozedur kann hier pausiert werden.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Zubereitung von Waschlösungen
<ol><li>Fügen Sie 21 ml 100%iges Ethanol der American Chemical Society (ACS) zu der Waschlösung 1 hinzu, die im miRNA-Isolierkit enthalten ist (siehe Materialtabelle), um das Endvolumen von 30 ml zu erreichen, wie auf der Flasche angegeben. Wirbeln, bis sich alles in der Flasche auflöst.</li>
	<li>Fügen Sie 40 ml ACS-Ethanol der Qualität 100% in die bereitgestellte Waschlösung 2/3 hinzu, um das Endvolumen von 50 ml zu erreichen, wie auf der Flasche angegeben. Wirbel für 5 s oder bis die endgültige Mischung gut gemischt ist.</li>
</ol>3. Vorbereitung von Geräten und Materialien
<ol><li>Besprühen Sie den Arbeitsbereich und die Ausrüstung, z. B. den Labortisch, den Arbeitsbereich im chemischen Abzug und die Mikrozentrifugenröhrchengestelle, mit einer Ribonuklease (RNase) Dekontaminationslösung (z. B. handelsübliche RNase-Dekontaminationslösung). Um eine Kontamination zu vermeiden, tragen Sie die RNase-Dekontaminationslösung auf die Oberflächen auf, wo und wann immer dies für notwendig erachtet wird.</li>
	<li>Ziehen Sie einen sauberen Laborkittel an, setzen Sie eine Gesichtsmaske auf und tragen Sie geeignete Laborhandschuhe, um die RNA in den Kotproben vor Nukleasen auf der menschlichen Haut zu schützen. Sprühen Sie Handschuhe mit einer RNase-Dekontaminationslösung und wechseln Sie die Handschuhe häufig, um eine Kontamination zu vermeiden.</li>
	<li>Bereiten Sie einen Eimer Trockeneis für fäkale Proben vor, die bei -80 °C gelagert werden, um ein Auftauen vor der Resuspension von Kot zu verhindern, und einen Eimer Eis für Materialien, zum Beispiel: Säure-Phenol: Chloroform, um die Haltbarkeit zu verlängern. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Materialien, einschließlich der im Protokoll verwendeten Medien, steril sind, ohne dass Nukleasen kontaminiert werden.</li>
</ol>4. Fäkalien Resuspension
<ol><li>Resuspendieren Sie 25-100 mg Stuhlproben in 600 μL steriler 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) von Dulbecco. VORSICHT: Fäkalproben sollten sofort verarbeitet werden, wenn sie ab -80 °C aufgetaut werden, ohne auch nur teilweise aufzutauen, um die Freisetzung von RNasen und zellulärer RNA zu minimieren, da Eiskristalle sowohl innere als auch äußere Zellkompartimente reißen, wenn Zellen in der Probe auftauen.<ol><li>Fügen Sie 600 μL 1x DPBS in das 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss mit Kotproben bei Raumtemperatur (RT) hinzu.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Mischung von Stuhlproben, die in 600 μL 1x DPBS in das 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen getaucht sind, das für 30 min bei RT verschlossen ist.</li>
		<li>Resuspendieren Sie die Mischung durch Maischen mit 1 ml Pipettenspitze und Wirbelbohrung mit dem 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Um die Menge und Qualität der RNA zu optimieren und zu erhöhen, resuspendieren Sie die Mischung mit einem Homogenisator mit der Einstellung für einen Zyklus bei S4000 (oder 4000 U/min) und 45 s.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Organische Extraktion
VORSICHT: Verwenden Sie den gefährlichen chemischen Abzug für die folgenden Schritte bis Schritt 6 unter Verwendung von Säurephenol: Chloroform und ACS Klasse 100% Ethanol aufgrund ihrer Toxizität und Entflammbarkeit. Wechseln Sie die PSA nach Bedarf und befolgen Sie die entsprechenden Standardvorsichtsmaßnahmen beim Umgang mit Gefahrgut.
<ol><li>Extrakt RNA mit 600 μL Säure-Phenol: Chloroform (das Volumen von Säure-Phenol: Chloroform erforderlich entspricht dem Anfangsvolumen von 1x DPBS in Schritt 4.1).<ol><li>600 μL Säure-Phenol: Chloroform in die Suspension aus Schritt 4.1 geben. HINWEIS: Säure-Phenol: Chloroform aus der unteren Phase in der Flasche zurückziehen, da die obere Phase mit einem wässrigen Puffer gemischt wird. Wenn die Interphase zwischen diesen beiden Phasen gestört ist, warten Sie und ziehen Sie Säure-Phenol: Chloroform nur zurück, wenn sich die Interphase wieder etabliert, um eine Kontamination zu vermeiden.</li>
	</ol></li>
	<li>Wirbeln Sie die Mischung für 60 s gründlich mischen. Alternativ, um die Menge an RNA in der Ausbeute zu optimieren und zu erhöhen, mischen Sie mit einem Homogenisator mit der Einstellung für einen Zyklus bei S4000 und 45 s.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie für 15 min bei 10.000 x g RT, um die wässrige und organische Phase mit einer Mikrozentrifuge zu trennen. Nach der Zentrifugation sollte die Interphase kompakt sein. Wenn nicht, wiederholen Sie die Zentrifugation. HINWEIS: Wenn die Interphase nicht so kompakt wie gewünscht sein kann, möglicherweise aufgrund eines ungleichmäßigen Verhältnisses des Anfangsvolumens zum Volumen des zugesetzten Säurephenols: Chloroform nach mehreren Zentrifugationswiederholungen, fahren Sie fort, die wässrige Phase mit größerer Sorgfalt wiederherzustellen, um eine Kontamination zu vermeiden.</li>
	<li>Gewinnen Sie die wässrige Phase zurück und übertragen Sie sie in ein neues 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Scharnierkappe (nicht im miRNA-Isolierungskit enthalten).<ol><li>Entfernen Sie die wässrige (oder obere) Phase vorsichtig, ohne die untere Phase zu stören, und geben Sie sie in ein neues 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Scharnierkappe. Beachten Sie das übertragene Volumen (z. B. ~500 μL). HINWEIS: Wenn die Interphase kompakt ist und die obere Phase klar getrennt ist, schwimmen möglicherweise einige winzige Restpartikel auf der Oberseite der wässrigen Phase. Pipettieren Sie vorsichtig, um diese Rückstände zu vermeiden und nur sichtbar und deutlich getrennte wässrige Phase zu gewinnen, um eine qualitativ hochwertige RNA-Ausbeute zu gewährleisten, auch wenn Sie nur ein kleines Volumen der wässrigen Phase erhalten könnten.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Endgültige RNA-Isolierung
<ol><li>Fügen Sie 1,25 Volumen RT ACS-Ethanol der Klasse 100% in die wässrige Phase im 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen hinzu (z. B. fügen Sie 625 μL 100% Ethanol hinzu, wenn 500 μL wässrige Phase aus Schritt 5.4 gewonnen werden). Wirbel 3 s.</li>
	<li>Laden Sie das wässrige Phasen-Ethanol-Gemisch durch die Filterkartusche, die im miRNA-Isolierkit enthalten ist.<ol><li>Legen Sie die Filterpatrone für jede Probe in eines der vom Kit gelieferten Sammelröhrchen.<ol><li>600 μL des wässrigen Phasen/Ethanol-Gemisches werden pipettiert und in die Filterpatrone geladen. HINWEIS: Wirbeln Sie die Mischung kurz durch, um das Ethanol vor dem Pipettieren gründlich mit wässriger Phase zu mischen. Es können nicht mehr als 700 μL des wässrigen Phasen-Ethanol-Gemisches gleichzeitig geladen werden.</li>
		</ol></li>
		<li>Zentrifugieren Sie bei 10.000 x g für 90 s, um durch die Mischung zu filtern. Das Drehen mit einer höheren Geschwindigkeit kann den Filter beschädigen.</li>
		<li>Das Filtrat wird verworfen und die Schritte 6.2.1 bis 6.2.2 wiederholt, bis das gesamte Gemisch in aufeinanderfolgenden Anwendungen durch dieselbe Filtermembran filtriert ist. Bewahren Sie das gleiche Sammelrohr für die unten aufgeführten Waschschritte auf und verwenden Sie es wieder.</li>
		<li>Waschen Sie den Filter mit 700 μL miRNA Wash Solution 1. ACHTUNG: miRNA Wash Solution 1 enthält Guanidinthiocyanat, das Hautreizungen und schwere Augenschäden verursachen kann. Tragen Sie notwendige PSA, zum Beispiel: Handschuhe, Gesichtsschutz, Laborschutzkittel. Wechseln Sie die Handschuhe häufig nach Bedarf.<ol><li>700 μL miRNA Wash Solution 1, die mit ACS-Ethanol hergestellte Arbeitslösung, in die Filterpatrone geben.</li>
			<li>Zentrifugieren Sie für 60 s, um die miRNA Wash Solution 1 durch die Filterpatrone zu filtrieren.</li>
			<li>Entsorgen Sie das Filtrat aus dem Sammelröhrchen und legen Sie dieselbe Filterpatrone in dasselbe Sammelröhrchen.</li>
		</ol></li>
		<li>Waschen Sie den Filter mit Waschlösung 2/3 einmal mit Volumina von jeweils 700 μL, 500 μL und 250 μL hintereinander.<ol><li>Tragen Sie 700 μL Waschlösung 2/3, die mit der ACS-Qualität 100% Ethanol hergestellte Arbeitslösung, in die Filterpatrone auf.<ol><li>Zentrifugieren bei 10.000 x g für 1 min.</li>
				<li>Entsorgen Sie das Filtrat aus dem Sammelröhrchen und legen Sie dieselbe Filterpatrone in dasselbe Sammelröhrchen.</li>
			</ol></li>
			<li>Geben Sie 500 μL Waschlösung 2/3 in die Filterpatrone.<ol><li>Zentrifugieren bei 10.000 x g für 1 min.</li>
				<li>Entsorgen Sie das Filtrat aus dem Sammelröhrchen und legen Sie dieselbe Filterpatrone in dasselbe Sammelröhrchen.</li>
			</ol></li>
			<li>Geben Sie 250 μL Waschlösung 2/3 in die Filterpatrone.<ol><li>Zentrifugieren bei 10.000 x g für 1 min.</li>
				<li>Verwerfen Sie das Filtrat aus dem Sammelrohr.</li>
			</ol></li>
			<li>Füllen Sie die Filterpatrone in ein neues Auffangrohr und drehen Sie die Baugruppe 5 Minuten lang, um die Restflüssigkeit aus dem Filter zu entfernen.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>7. Elue RNA mit 50 μL nukleasefreiem Wasser
<ol><li>Füllen Sie die Filterpatrone in ein neues Auffangrohr. Pipettieren Sie 50 μL nukleasefreies Wasser in die Mitte des Filters und verschließen Sie das Sammelrohr.<ol><li>Inkubieren bei RT für 10 min.</li>
		<li>Spin für 5 min bei 8.000 x g , um RNA in das neue Sammelröhrchen zurückzugewinnen.</li>
		<li>Bestimmen Sie die Konzentration und Reinheit der gewonnenen fäkalen RNA mit einem Fluorometer. Die gewonnene fäkale RNA kann bei -80 °C gelagert werden.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Das, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+RNA+communication+consortium:+Establishing+foundational+knowledge+and+technologies+for+extracellular+RNA+research.">The extracellular RNA communication consortium: Establishing foundational knowledge and technologies for extracellular RNA research.</a> Cell. 177 (2), 231-242 (2019).</li><li>Ahmed, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+microRNA+markers+for+screening+sporadic+human+colon+cancer+and+active+ulcerative+colitis+in+stool+and+tissue.">Diagnostic microRNA markers for screening sporadic human colon cancer and active ulcerative colitis in stool and tissue.</a> Cancer Genomics &amp; Proteomics. 6 (5), 281-295 (2009).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host+shapes+the+gut+microbiota+via+fecal+microRNA.">The host shapes the gut microbiota via fecal microRNA.</a> Cell Host &amp; Microbe. 19 (1), 32-43 (2016).</li><li>Viennois, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-derived+fecal+microRNAs+can+indicate+gut+microbiota+healthiness+and+ability+to+induce+inflammation.">Host-derived fecal microRNAs can indicate gut microbiota healthiness and ability to induce inflammation.</a> Theranostics. 9 (15), 4542-4557 (2019).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+administration+of+miR-30d+from+feces+of+MS+patients+suppresses+MS-like+symptoms+in+mice+by+expanding+Akkermansia+muciniphila.">Oral administration of miR-30d from feces of MS patients suppresses MS-like symptoms in mice by expanding Akkermansia muciniphila.</a> Cell Host &amp; Microbe. 26 (6), 779-794 (2019).</li><li>Masotti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+small+non-coding+RNAs+allows+an+accurate+comparison+of+miRNA+expression+profiles.">Quantification of small non-coding RNAs allows an accurate comparison of miRNA expression profiles.</a> Journal of Biomedicine &amp; Biotechnology. 2009, 659028 (2009).</li><li>Green, M. 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M., Viola, M. F., Hoban, A. E., Dinan, T. G., Cryan, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Faecal+microRNAs:+indicators+of+imbalance+at+the+host-microbe+interface.">Faecal microRNAs: indicators of imbalance at the host-microbe interface.</a> Beneficial Microbes. , 1-10 (2017).</li><li>Giannoukos, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+robust+RNA-seq+process+for+cultured+bacteria+and+complex+community+transcriptomes.">Efficient and robust RNA-seq process for cultured bacteria and complex community transcriptomes.</a> Genome Biology. 13 (3), 23 (2012).</li></ol>

Die Autoren erklären keine relevanten oder wesentlichen finanziellen Interessen, die im Zusammenhang mit der in diesem Protokollpapier beschriebenen Forschungsmethode stehen.

Es ist wichtig, eine RNase-freie Technik zu verwenden, um eine RNase-Kontamination während der Isolierung zu verhindern7. Nach der Zentrifugation und der Bildung einer kompakten Interphase ist es wichtig, zu vermeiden, dass die Interphase, die untere Phase und die Partikelverunreinigung auf der Oberseite der wässrigen Phase schwimmen, wenn die wässrige Phase zurückgewonnen wird. Zusätzlich werden zwei Waschschritte mit 500 μL und 250 μL Waschlösung 2/3 hinzugefügt, um Verunreinigungen in ...

Extrazelluläre RNA wird als ein bedeutender Faktor erkannt, der viele biologische Prozesse vermittelt1. Extrazelluläre RNA im Kot wurde erstmals 2008 als Marker für Darmkrebs und aktive Colitis ulcerosa2 berichtet und kürzlich als normaler Bestandteil des Darmlumens und -kots nachgewiesen und vermittelt die Wirt-Mikroben-Kommunikation 3,4,5. Der Zweck dieses RNA-Isolationsprotokolls ist es, qualitativ hochwertige extrazelluläre RNA aus Stuhlproben von Tieren und Menschen zu extrahieren. Das Protokoll wurde von einem kommerziellen miRNA Isolation Kit adaptiert. Die gewonnene RNA wird für nachgeschaltete Analysen wie RNA-Sequenzierung, RT-PCR und Micro-Array verwendet. Das Protokoll enthält mehrere wichtige und nützliche Tipps, um die Menge und Qualität der RNA im Kot von Tieren und Menschen zu maximieren. Der Grund für die Entwicklung und Optimierung dieser Methode der RNA-Isolierung (einschließlich microRNA) besteht darin, die mikrobielle RNA im Kot zu verringern, die Variablen in den Forschungsstudien zu begrenzen und die RNA-Zusammensetzung im Darm zu analysieren, ohne verschiedene Störfaktoren und Kontaminationsquellen zu berücksichtigen. Bemerkenswert ist, dass diese RNA-Isolierung die Freisetzung von RNA aus lebenden Zellen und lebenden Mikroben (zelluläre RNA) minimiert. Es konzentriert sich auf extrazelluläre RNAs, die von Darmzellen freigesetzt oder über die Nahrung aufgenommen wurden. Grundsätzlich ist diese Methode nicht für Studien geeignet, bei denen das mikrobielle Transkriptom untersucht wird.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acid-Phenol: Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM9720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mirVana miRNA Isolation Kit</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM1561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free microcentrifuge tubes (1.5 mL, 2 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water (Not DEPC-treated)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor and Nuclease-Free Pipette tips (with filter)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerLyzer 24 Homogenizer</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>13155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fecal (micro) rna isolation

Es wird deutlich, dass RNA im Darmlumen und Kot von Tieren und Menschen existiert. Das unten beschriebene Protokoll isoliert die Gesamt-RNA einschließlich microRNAs aus Stuhlproben von Tieren und Menschen. Ziel ist es, Gesamt-RNA mit hoher Reinheit und Menge für nachgeschaltete Analysen wie RNA-Sequenzierung, RT-PCR und Micro-Array zu isolieren. Die Vorteile dieses optimierten Protokolls in der miRNA-Isolierung sind die Fähigkeit, hochgereinigte RNA-Produkte mit zusätzlichen beschriebenen Waschschritten zu isolieren, eine erhöhte Menge an RNA, die mit einer verbesserten Methode bei der Resuspension der Probe erhalten wird, und wichtige Tipps zur Dekontamination. Eine Einschränkung ist die Unfähigkeit, größere Proben von mehr als 200 mg zu verarbeiten und zu reinigen, da diese Probengrößen eine Schwierigkeit bei der klaren Bildung der Interphase verursachen würden. Folglich kann die große Probengröße die zu extrahierende wässrige Phase wie im Protokoll beschrieben mit organischen Stoffen kontaminieren, die die Qualität der am Ende isolierten RNA beeinträchtigen. Für die meisten nachgeschalteten Analysen reichen jedoch RNA-Isolate aus einer Probe von bis zu 200 mg aus.

Repräsentative RNAs wurden aus 50 mg Mauskotproben (2 Mauskotpellets) bzw. 100 mg menschlichen Stuhlproben isoliert und in 50 μL nukleasefreiem Wasser eluiert. Die Spektralphotometeranalyse der Konzentration legt nahe, dass insgesamt 49 μg bzw. 16 μg RNA isoliert wurden (Tabelle 1). Die RNA-Reinheit war hoch, was durch ein A260/A280-Verhältnis von ~2,0 und ein A260/A230-Verhältnis von ~1,8 angezeigt wird (Tabelle 1). Wie berichtet3, ist die Mehrheit der RNAs...

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Fecal micro RNA Isolation

Dieses Protokoll isoliert hochwertige Gesamt-RNA aus Kotproben von Tieren und Menschen. Ein kommerzielles miRNA-Isolierkit wird mit signifikanter Adaption verwendet, um reine RNA mit optimierter Quantität und Qualität zu isolieren. Die RNA-Isolate eignen sich für die meisten nachgeschalteten RNA-Assays wie Sequenzierung, Micro-Array und RT-PCR.

Fäkale (Mikro-) RNA-Isolierung

It is becoming clear that RNA exists in the gut lumen and feces in animals and humans. The protocol described below isolates total RNA including microRNAs ...

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Immunology and Infection

Unit 1

Fecal (micro) RNA Isolation

Diagnostic and Radiological Studies of the GI System

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4.4K Aufrufe.  Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School. Dieses Protokoll isoliert hochwertige Gesamt-RNA aus Kotproben von Tieren und Menschen. Ein kommerzielles miRNA-Isolierkit wird mit signifikanter Adaption verwendet, um reine RNA mit optimierter Quantität und Qualität zu isolieren. Die RNA-Isolate eignen sich für die meisten nachgeschalteten RNA-Assays wie Sequenzierung, Micro-Array und RT-PCR.

Serie: Fecal micro RNA Isolation

RNA Interference in Ticks

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites of wild and domestic animals and humans, and are considered to be second worldwide to mosquitoes as vectors of human diseases1 and the most important vectors affecting cattle industry worldwide2. Ticks are classified in the subclass Acari, order Parasitiformes, suborder Ixodida and are distributed worldwide from Arctic to tropical regions3. Despite efforts to control tick infestations, these ectoparasites remain a serious problem for human and animal health4,5.
RNA interference (RNAi)6 is a nucleic acid-based reverse genetic approach that involves disruption of gene expression in order to determine gene function or its effect on a metabolic pathway. Small interfering RNAs (siRNAs) are the effector molecules of the RNAi pathway that is initiated by double-stranded RNA (dsRNA) and results in a potent sequence-specific degradation of cytoplasmic mRNAs containing the same sequence as the dsRNA trigger7-9. Post-transcriptional gene silencing mechanisms initiated by dsRNA have been discovered in all eukaryotes studied thus far, and RNAi has been rapidly developed in a variety of organisms as a tool for functional genomics studies and other applications10.
RNAi has become the most widely used gene-silencing technique in ticks and other organisms where alternative approaches for genetic manipulation are not available or are unreliable5,11. The genetic characterization of ticks has been limited until the recent application of RNAi12,13. In the short time that RNAi has been available, it has proved to be a valuable tool for studying tick gene function, the characterization of the tick-pathogen interface and the screening and characterization of tick protective antigens14. Herein, a method for RNAi through injection of dsRNA into unfed ticks is described. It is likely that the knowledge gained from this experimental approach will contribute markedly to the understanding of basic biological systems and the development of vaccines to control tick infestations and prevent transmission of tick-borne pathogens15-19.

A method for RNA interference (RNAi) by injection of dsRNA into unfed ticks is described. RNAi is the most widely used gene-silencing technique in ticks where the use of other methods of genetic manipulation has been limited.

RNA-Interferenz in Ticks

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites of wild and domestic animals and humans, and are considered to be second worldwide to mosquitoes as vectors ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the generation of extreme population diversity that facilitates virus adaptation and evolution. Increasing evidence shows that the intrinsic error rates, and the resulting mutation frequencies, of RNA viruses can be modulated by subtle amino acid changes to the viral polymerase. Although biochemical assays exist for some viral RNA polymerases that permit quantitative measure of incorporation fidelity, here we describe a simple method of measuring mutation frequencies of RNA viruses that has proven to be as accurate as biochemical approaches in identifying fidelity altering mutations. The approach uses conventional virological and sequencing techniques that can be performed in most biology laboratories. Based on our experience with a number of different viruses, we have identified the key steps that must be optimized to increase the likelihood of isolating fidelity variants and generating data of statistical significance. The isolation and characterization of fidelity altering mutations can provide new insights into polymerase structure and function1-3. Furthermore, these fidelity variants can be useful tools in characterizing mechanisms of virus adaptation and evolution4-7.

The present article describes the steps required to isolate and characterize RNA polymerase fidelity variants of RNA viruses and how to use mutation frequency data to confirm fidelity changes in tissue culture.

Isolierung von Fidelity Varianten von RNA-Viren und Charakterisierung von Virus-Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

RNA Isolierung von Pseudomonas aeruginosa Kolonisierung der Murine Gastrointestinaltrakt

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

Detektion von fluoreszierenden Nanopartikel Wechselwirkungen mit primären Immun-Zell-Subpopulationen durch Durchflusszytometrie

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral proteins involved in the regulation of the virus activity recognize several nucleic acids. The nucleocapsid protein NCp7 (NC) is a key protein regulating several processes during virus replication. NC is in fact a chaperone destabilizing the secondary structures of RNA and DNA and facilitating their annealing. The inactivation of NC is a new approach and an interesting target for anti-HIV therapy. The Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) assay was developed to identify molecules able to inhibit the melting and annealing of RNA and DNA folded in thermodynamically stable tridimensional conformations, such as hairpin structures of TAR and cTAR elements of HIV, by the nucleocapsid protein of HIV-1. The new assay employs either the recombinant or the synthetic protein, and oligonucleotides without the need of their previous labeling. The analysis of the results is achieved by standard polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by conventional nucleic acid staining. The protocol reported in this work describes how to perform the NAME assay with the full-length protein or its truncated version lacking the basic N-terminal domain, both competent as nucleic acids chaperones, and how to assess the inhibition of NC chaperone activity by a threading intercalator. Moreover, NAME can be performed in two different modes, useful to obtain indications on the putative mechanism of action of the identified NC inhibitors.

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

Nucleocapsid Glühen-vermittelte Elektrophorese (NAME) Assay ermöglicht die schnelle Identifizierung von HIV-1-Inhibitoren Nucleocapsid

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

This study describes an imaging-based micro-neutralization assay to analyze the antigenic relationships between viruses. The protocol employs a flatbed scanner and has four steps, including titration, titration quantitation, neutralization, and neutralization quantitation. The assay works well with current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses.

Optimierung eines Assay Quantitative Mikroneutralisations

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material

The RT-QuIC technique is a sensitive in vitro cell-free prion amplification assay based mainly on the seeded misfolding and aggregation of recombinant prion protein (PrP) substrate using prion seeds as a template for the conversion. RT-QuIC is a novel high-throughput technique which is analogous to real-time polymerase chain reaction (PCR). Detection of amyloid fibril growth is based on the dye Thioflavin T, which fluoresces upon specific interaction with &#7526;-sheet rich proteins. Thus, amyloid formation can be detected in real time. We attempted to develop a reliable non-invasive screening test to detect chronic wasting disease (CWD) prions in fecal extract. Here, we have specifically adapted the RT-QuIC technique to reveal PrPSc seeding activity in feces of CWD infected cervids. Initially, the seeding activity of the fecal extracts we prepared was relatively low in RT-QuIC, possibly due to potential assay inhibitors in the fecal material. To improve seeding activity of feces extracts and remove potential assay inhibitors, we homogenized the fecal samples in a buffer containing detergents and protease inhibitors. We also submitted the samples to different methodologies to concentrate PrPSc on the basis of protein precipitation using sodium phosphotungstic acid, and centrifugal force. Finally, the feces extracts were tested by optimized RT-QuIC which included substrate replacement in the protocol to improve the sensitivity of detection. Thus, we established a protocol for sensitive detection of CWD prion seeding activity in feces of pre-clinical and clinical cervids by RT-QuIC, which can be a practical tool for non-invasive CWD diagnosis.

Here, we present a protocol to describe a simple, fast and efficient prion amplification technique, the real-time quaking-induced conversion (RT-QuIC) method.

Echtzeit-Beben-induzierte Umwandlung Test zur Erkennung von CWD Prionen in Fäkalien

The RT-QuIC technique is a sensitive in vitro cell-free prion amplification assay based mainly on the seeded misfolding and aggregation of recombinant ...

Culture Methods to Determine the Limit of Detection and Survival in Transport Media of Campylobacter Jejuni in Human Fecal Specimens

A culture from human stool for diagnosis of Campylobacter-based intestinal illness takes several days, a wait that taxes the fortitude of the physician and the patient. A culture is also prone to false negative results from random loss of viability during specimen handling, overgrowth of other fecal flora, and poor growth of several pathogenic Campylobacter species on traditional media. These problems can confound clinical decisions on patient treatment and have limited the field from answering fundamental questions on Campylobacter growth and infections. We describe a procedure that estimates the lower limit of bacterial numbers that can be detected by a culture and a method for quantifying survival of C. jejuni in media used for transport of this fragile organism. Knowing this information, it becomes possible to set clinically relevant detection thresholds for diagnostic tests and address unstudied issues of whether non-symptomatic colonization is prevalent, if co-infection with other enteric pathogens is common, or if bacterial load correlates with symptoms or serious sequelae. The study also included testing of 1,552 prospectively collected patient diarrheal fecal specimens that were initially classified by conventional culture and further tested by a new enzyme immunoassay. Positive and discrepant specimens were then screened by four molecular methods to assign true-positive or true-negative status. The 5 non-culture methods showed complete agreement on all 48 positive and discrepant specimens, while the culture mis-identified 14 (28%). The specimens that were incorrectly identified by culture included 13 false negative and 1 false positive sample. This basic protocol can be used with multiple Campylobacter spp. and will allow the numbers of Campylobacter bacteria that produce symptoms of gastroenteritis in humans to be determined and for prevalence rates to be updated.

Culture Methods to Determine the Limit of Detection and Survival in Transport Media of Campylobacter Jejuni in Human Fecal Specimens

Although stool culture for Campylobacter is imprecise, it is still considered the gold standard for identification. Methods to determine the limit of detection and survival in transport media of C. jejuni in human stool are described and compared with a new immunoassay with better accuracy.

Kulturmethoden zur Bestimmung der Grenze der Detektion und des Überlebens in Transportmedien von Campylobacter Jejuni in humanen Fäkalproben

A culture from human stool for diagnosis of Campylobacter-based intestinal illness takes several days, a wait that taxes the fortitude of the physician ...

Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis

Glomerular cell death is a pathological feature of myeloperoxidase anti neutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis (MPO-AAV). Extracellular deoxyribonucleic acid (ecDNA) is released during different forms of cell death including apoptosis, necrosis, necroptosis, neutrophil extracellular traps (NETs) and pyroptosis. Measurement of this cell death is time consuming with several different biomarkers required to identify the different biochemical forms of cell death. Measurement of ecDNA is generally conducted in serum and urine as a surrogate for renal damage, not in the actual target organ where the pathological injury occurs. The current difficulty in investigating ecDNA in the kidney is the lack of methods for formalin fixed paraffin embedded tissue (FFPE) both experimentally and in archived human kidney biopsies. This protocol provides a summary of the steps required to stain for ecDNA in FFPE tissue (both human and murine), quench autofluorescence and measure the ecDNA in the resulting images using a machine learning tool from the publicly available open source ImageJ plugin trainable Weka segmentation. Trainable Weka segmentation is applied to ecDNA within the glomeruli where the program learns to classify ecDNA. This classifier is applied to subsequent acquired kidney images, reducing the need for manual annotations of each individual image. The adaptability of the trainable Weka segmentation is demonstrated further in kidney tissue from experimental murine anti-MPO glomerulonephritis (GN), to identify NETs and ecMPO, common pathological contributors to anti-MPO GN. This method provides objective analysis of ecDNA in kidney tissue that demonstrates clearly the efficacy in which the trainable Weka segmentation program can distinguish ecDNA between healthy normal kidney tissue and diseased kidney tissue. This protocol can easily be adapted to identify ecDNA, NETs and ecMPO in other organs.

Extracellular DNA (ecDNA) released during cell death is proinflammatory and contributes to inflammation. Measurement of ecDNA at the site of injury can determine the efficacy of therapeutic treatment in the target organ. This protocol describes the use of a machine learning tool to automate measurement of ecDNA in kidney tissue.

Überwachtes maschinelles Lernen zur Semiquantifizierung der extrazellulären DNA bei Glomerulonephritis

Glomerular cell death is a pathological feature of myeloperoxidase anti neutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis (MPO-AAV). Extracellular ...

Therapeutic Evaluation of Fecal Microbiota Transplantation in an Interleukin 10-Deficient Mouse Model

With the development of microecology in recent years, the relationship between intestinal bacteria and inflammatory bowel disease (IBD) has attracted considerable attention. Accumulating evidence suggests that dysbiotic microbiota plays an active role in triggering or worsening the inflammatory process in IBD and that fecal microbiota transplantation (FMT) is an attractive therapeutic strategy since transferring a healthy microbiota to IBD patient could restore the appropriate host-microbiota communication. However, the molecular mechanisms are unclear, and the efficacy of FMT has not been very well established. Thus, further studies in animal models of IBD are necessary. In this method, we applied FMT from wild-type C57BL/6J mice to IL-10 deficient mice, a widely used mouse model of colitis. The study elaborates on collecting fecal pellets from the donor mice, making the fecal solution/suspension, administering the fecal solution, and monitoring the disease. We found that FMT significantly mitigated the cardiac impairment in IL-10 knockout mice, underlining its therapeutic potential for IBD management.

The interaction of genetic susceptibility, mucosal immunity, and intestinal microecological environment is involved in the pathogenesis of inflammatory bowel disease (IBD). In this study, we applied fecal microbiota transplantation to IL-10 deficient mice and investigated its impact on colonic inflammation and heart function.

Therapeutische Bewertung der fäkalen Mikrobiota-Transplantation in einem Interleukin-10-defizienten Mausmodell

With the development of microecology in recent years, the relationship between intestinal bacteria and inflammatory bowel disease (IBD) has attracted ...