Name: a seminiferous tubule squash technique for the cytological analysis of spermatogenesis using the mouse model
Uploaded: 2018-02-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
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Diese Arbeit wurde unterstützt durch NIGMS (R01GM11755), P.W.J und ein Training Stipendium Stipendium vom National Cancer Institute (NIH) (CA009110), S.R.W. und j.h.

Die Verwendung von Mäusen nahm die institutionellen Animal Care und verwenden Ausschuss der Johns Hopkins University. Experimente wurden durchgeführt auf Juvenile (20-26 Tage Post-Partum, Dpp) Mäusen C57BL/6J, unter Ausnutzung der halbsynchrone erste Welle der Spermatogenese. Jedoch kann diese Technik auch mit Erwachsenen Mäusen durchgeführt werden.
1. Präparation und Isolierung von seminiferous Röhrchen Maus
<ol><li>Bereiten Sie den Fix/Lyse Lösung und Antikörper Verdünnungspuffer (ADB) in Tabelle 1 und Tabelle 2beschrieben.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 35-mm-Petrischale mit 3 mL 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (1 X PBS, pH 7,4) und ein weiteres 35-mm-Gericht mit 2 mL Lösung/Lyse Lösung per Mausklick.</li>
	<li>Opfern Sie die Maus durch zervikale Dislokation oder CO2 Erstickung zu und sprühen Sie ventrale Abdomen mit 70 % Ethanol. Öffnen Sie die Abdominopelvic Hohlraum mit sterile Schere, so dass eine v-förmige Öffnung. Dann entfernen Sie die Hoden durch Ziehen an der epididymal Fettpolster mit Pinzette und nicht zu stören der Tunica Albuginea. Legen Sie die Hoden in einer 35-mm-Petrischale mit 1 X PBS. Hinweis: Nutzen Sie die erste Welle der Spermatogenese, um ein angereichertes Zellpopulation Interesse14zu beobachten. Bestimmte Stufen der Spermatogenese sind bei verschiedenen Maus ab (Tabelle 3) angereichert.</li>
	<li>Entfernen Sie der Hoden Tunica Albuginea durch Punktion des Gewebes mit scharfen spitzen Pinzette und sammeln Sie lose seminiferous Röhrchen. Übertragen Sie die Tubuli auf eine neue 35 mm Petrischale mit 2 mL Lösung/Lyse Lösung.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Tubuli in die Verlegenheit/Lyse-Lösung für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
</ol>2. Vorbereitung von seminiferous Röhrchen
<ol><li>Bereiten Sie einen Poly-L-Lysin beschichtete Objektträger umreißen die Ränder der Folie mit einem flüssigen Blocker Stift.</li>
	<li>Gelten Sie 100 µL Fix/Lyse-Lösung für die Mitte der Folie Glas.</li>
	<li>Mit sterilen Pinzette und Schere sanft zu necken auseinander seminiferous Röhrchen. Schneiden Sie lange einzelne Röhrchen Segmente ca. 20 mm Länge. Hinweis: Strukturen, die empfindlich auf Fixativ über längere Zeit, z. B. die Zentrosomen zu visualisieren, die Tubuli zuerst in 1 X PBS zu trennen, dann direkt Hackfleisch Tubuli auf der Oberfläche des Poly-Lysin-Folien in 100 µL Fix-Lyse Lösung beschichtet.</li>
	<li>Übertragen Sie fünf 20 mm lange seminiferous Röhrchen Segmente auf die vorbereiteten Poly-L-Lysin beschichtetes Glas-Folie mit Fix/Lyse Lösung.</li>
	<li>Mit steriler Schere Hackfleisch seminiferous Röhrchen in 1,5 bis 3,0 mm Segmente.</li>
	<li>Verwendung von sterilen Pinzette die Röhrchen Segmente auf dem Objektträger so anordnen, dass kein Gewebe übergreift, und die Tubuli sind gleichmäßig verteilt. Hinweis: Die optimale Anzahl von Röhrchen Segmente auf einen Glasobjektträger liegt zwischen 20 und 40.</li>
</ol>3. Quetschen von seminiferous Röhrchen
<ol><li>Die Glas-Folie mit verstreuten seminiferous Röhrchen Segmente auf einer Tischplatte zu übertragen. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit mit einem Labor abwischen zu verlieren Gewebe während der Squash-Schritt.</li>
	<li>Wenden Sie ein Deckglas (22 x 60-1,5 mm) auf den Objektträger und Druck mit der Ferse des Palm für 10-20 Sekunden. Es ist wichtig, genügend Kraft, Spermatozyten von seminiferous Röhrchen zu zerstreuen. Hinweis: Beobachten Sie die Röhrchen mit einem Dissektion Mikroskop um die quetschen Schritt zu optimieren, so dass alle Röhrchen Segmente gestört werden.</li>
	<li>Mit Folie Pinzette, sofort Blitz Einfrieren der Objektträger in einem kleinen Dewar Flüssigkeit N2 für 15 Sekunden, oder bis die Flüssigkeit aufhört zu blubbern. Wenn Immunolabeling umgehend entfernen das Deckglas mit einer geraden Kante Rasierklinge, feine Spitze Zange oder 21-Gauge-Nadel. Hinweis: Um optimale Ergebnisse zu erzielen, Immunolabel Folien sofort (siehe Schritt 4). Jedoch können an dieser Stelle Folien bei-80 ° C bis zu zwei Wochen lang beibehalten werden. Um die Lebensdauer von Proteinen und Zellstrukturen zu maximieren, sofort lagern Sie die Folien auf Trockeneis oder Übertragung auf-80 ° C Gefrierschrank, und das Deckglas auf der Folie. Wenn Immunolabeling Folien gespeichert, entfernen Sie das Deckglas durch Eintauchen der Folien in flüssigen N2 für 15 Sekunden, wie unter Punkt 3.3 beschrieben.</li>
</ol>4. Immunolabeling der berittenen seminiferous Röhrchen
<ol><li>Tauchen Sie die Folie in 1 x PBS und drei Mal für 5 min in ein 50 mL Coplin JAR-Datei mit 1 X PBS waschen. Hinweis: Lassen Sie niemals die Folien zu trocken während der Immunolabeling.</li>
	<li>Gelten Sie 1 mL der Antikörper Verdünnungspuffer auf den Objektträger für 1-2 h in eine feuchte Kammer sperren.</li>
	<li>Entfernen Sie die Antikörper Verdünnungspuffer und 100 µL Primärantikörper in Verdünnungspuffer Antikörper in eine feuchte Kammer verdünnt. Hinweis: Inkubieren Sie für beste Ergebnisse primären Antikörper über Nacht bei 4 ° c Verwenden Sie kleinere Mengen von Antikörpern (z. B. 50 µL) durch die Folie mit einem Deckglas oder Parafilm abdecken. Überprüfen Sie und optimieren Sie Primärantikörper15.</li>
	<li>Spülen Sie Folien drei Mal für 5 min in ein 50 mL Coplin JAR-Datei mit 1 X PBS. Hinweis: Verbessern Waschungen, agitieren Coplin Gläser mithilfe einer kleinen magnetischen Stir Bar und auf einem Teller magnetische Rühren bei niedriger Drehzahl, platzieren oder das Coplin Glas auf eine Tischplatte Mixer bei geringer Geschwindigkeit.</li>
	<li>Wenden Sie 100 µL der Sekundärantikörper in Verdünnungspuffer Antikörper für 1 bis 1,5 h in eine feuchte Kammer bei Raumtemperatur verdünnt an. Inkubieren Sie die Folien in einer dunklen Box Foto Ausbleichen der Fluorophor konjugierten Antikörpern zu vermeiden. Hinweis: Verwenden Sie kleinere Mengen von Antikörpern (z. B. 50 µL) durch die Folie mit einem Deckglas oder Parafilm abdecken.</li>
	<li>Spülen Sie Dias zwei Mal für 5 min in ein 50 mL Coplin JAR-Datei mit 1 X PBS.</li>
	<li>Montieren Sie die Folien in Eindeckmittel mit 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI, 1,5 µg/mL) und wenden Sie Deckgläsern (22 x 60-1,5 mm).</li>
	<li>Versiegeln der Deckgläsern, die Folien mit klaren Nagellack zu bewahren die Folien und verhindern, dass die Deckgläsern bewegt.</li>
</ol>5. Analyse und bildgebenden Röhrchen Squash Vorbereitungen
<ol><li>Verwenden Sie ein Epifluoreszenz-Mikroskop mit automatisierten Bühne, die präzise Bewegung der z-Achse und eine hochauflösende Kamera für Bildaufnahme ermöglicht. Alternativ können Sie einen Laser confocal Mikroskop. Hinweis: Verwenden Sie alle verfügbaren Hardware und Software für diesen Schritt. Beispielsweise wurden in Abbildung 1 und Abbildung 2 angezeigten Bilder mit ein Zeiss Cell Observer Z1 mit einer ORCA-Flash 4.0 CMOS Kamera verknüpft und analysiert mit dem Zeiss ZEN 2012 blau Edition Image-Software erfasst.</li>
	<li>Beurteilen Sie die Folien mit einer 20 X Objektiv zur Bestimmung der Qualität der Squash-Vorbereitung. Gute Qualität Folien haben eine Monolage von Kernen, die gleichmäßig verteilt sind. Hinweis: Einige Bereiche der Folie können besser sein als andere, ist es sinnvoll, beachten die Koordinaten, wo die besten Regionen der Folie zur weiteren Analyse mit stärkerer Vergrößerung gefunden werden kann.</li>
	<li>Verwendung mit höherer Vergrößerung Ziel (z.B. 63 X oder 100 X), Gefangennahme Regionen der Folie eine konsequente Monoschicht der Kerne. Sobald ein Bereich ausgewählt ist, den oberen und unteren Sie Z-Stapel um sicherzustellen, dass alle im Fokus Licht eingefangen wird. Hinweis: Die optimale Anzahl der Z-Stapel gefangen zwischen der oberen und unteren Grenzwert bezeichnet man in der Regel durch die Bild-Datenerfassungs-Software und unterscheidet sich für jedes Ziel.</li>
	<li>Verwenden Sie die Bildverarbeitungs-Software, um eine erweiterte Tiefenbild Fokus zu kompilieren. Die Software verbindet das Licht im Fokus von jedem Z-Stapel und ist wichtig für die optimale Darstellung von Röhrchen Squash Vorbereitungen.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Mäuse haben sich als nützliche Modellorganismus für die zelluläre Ereignisse, die meiotische Fortschreiten in der Spermatogenese regieren zu studieren. Weiter, es ist notwendig, kümmerten sich um die Untersuchung der Spermatogenese, weil viele Veranstaltungen, wie z. B. Ausstieg aus meiotischen Prophase ich Werkzeuge zu entwickeln, sind sexuell dimorphen. Dieses Protokoll beschreibt eine seminiferous Röhrchen Squash Methode zur Visualisierung und Studium der verschiedenen Phasen der Maus Spermatogenese. Diese Metho...

Meiose ist ein komplexes zellulären Ereignis, in dem eine einzelne Runde der DNA-Replikation von zwei aufeinander folgenden Runden der Zellteilung gefolgt. Meiose-spezifische Veranstaltungen müssen während der Anfangsphase der Meiose zu gewährleisten genaue Chromosom Abtrennung koordiniert werden. Diese Ereignisse gehören der Abschluss der homologen Rekombination, Co Ausrichtung der Schwester Kinetochore während die erste meiotische Teilung und der schrittweise Verlust der Cohesin-komplexe, Chiasmata zwischen homologen zu lösen. Präzise Regulation dieser Prozesse ist notwendig, um die Fruchtbarkeit zu erhalten und Chromosom Missegregation Ereignisse zu verhindern, die zu genetischen Entwicklungsstörungen und spontanen Fehlschlag1führen können.
Während die wichtigsten Ereignisse der Meiose in Männchen und Weibchen stattfinden, bestehen erhebliche zeitliche und mechanistische Unterschiede zwischen Spermatogenese und Oogenese2. Zum Beispiel, während der weibliche Meiose, Prophase I tritt während der Embryonalentwicklung und Verhaftungen in der Dictyate-Phase bis zur Pubertät. Im Gegensatz dazu beginnt Spermatogenese um Pubertät und schreitet in Wellen im gesamten Erwachsenenlebens ohne Haftbefehl. Die Unterschiede zwischen männlichen und weiblichen Meiose betont die Notwendigkeit, Methoden zu entwickeln, die speziell zur Beurteilung dieser Prozesse in Spermatozyten und Eizellen gesorgt werden. Derzeit beruht weitgehend meiotic Progression Beurteilung auf der Verwendung von Chromatin breitet sich3,4,5. Während Chromatin breitet sich nützlich für das Studium meiotische Chromosomen sind, Scheitern sie Erhaltung zellulären Integrität, Bewertung von Zellstrukturen wie Spindel Mikrotubuli, Zentrosomen, die Kernhülle und Telomere Anlagen zu verhindern. Live imaging und langfristigen Kultivierung Techniken haben unser Verständnis der weibliche Meiose stark fortgeschritten; ähnliche Konzepte für die gesamte intakten Zelle zu visualisieren sind jedoch weniger häufig für die Untersuchung der Spermatogenese6,7implementiert. Um dynamische Ereignisse in der gesamten männlichen Meiose zu visualisieren, haben wir etablierte Röhrchen Squash Techniken um schnell beurteilen die zytologischen Merkmale entwickeln Maus Spermatozyten8,9angepasst. Die hier beschriebene Methode bewahrt die Integrität der Zelle ermöglicht die Untersuchung von mehreren Zellstrukturen während der verschiedenen Phasen der Spermatogenese.
Diese Röhrchen-Squash-Technik ist eine ganze Zelle Ansatz, der für die Beurteilung der Zellstrukturen durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie ermöglicht. Gemeinsamen histologischen Ansätze zur meiotic Progression bei männlichen Mäusen wie Hämatoxylin und Eosin Färbung von Paraffin eingebettet Hoden und immunofluorescent Kennzeichnung von Cryosections visualisieren ermöglichen einen umfassenden Überblick über die meiotische fortschreiten. Aber nicht diese Techniken, Einzelzellen, soweit dies zur detaillierten Analyse der Ereignisse in der gesamten Meiose10,11zu lösen. Alternative Techniken meiotische Prozesse visualisieren beruhen auf bedeutende chemiosmotischen Unterbrechung der Spermatocyte zu isolieren und beheben von nuklearem Material3,4,5. Diese chemischen Behandlungen behindern die Beobachtung der Zelltypen als primären Spermatozyten. Eine kürzlich beschriebene Methode durch Namekawa ermöglichte die Forschungsgemeinschaft, die nukleare Architektur des isolierten Spermatozyten zu bewahren, aber erfordert den Einsatz von einem Cytospin und Accessoires, die möglicherweise nicht ohne weiteres zur Verfügung stehen einige Labors4. Im Gegensatz dazu erfordert die Röhrchen Squash Technik nur Geräte, die in der Regel standard in den meisten Zelle Biologie Labors.
Die hier beschriebene Röhrchen Squash-Methode lässt sich die unterschiedlichen Zelltypen gefunden innerhalb der seminiferous Röhrchen, einschließlich Sertoli-Zellen, Spermatogonien, primäre und sekundäre Spermatozyten und Spermatids visualisieren. Durch die Kopplung dieser Technik mit der in der Nähe von synchronen erste Welle der Spermatogenese bei jungen Mäusen, ist es möglich, angereicherte Populationen von spermatogenic Zellen zu erhalten, wie sie durch Meiose12 Fortschritte. Dieses Verfahren ermöglicht die detaillierte Analyse der Prozesse innerhalb der gesamten Spermatogenese, wie frühe Prophase Ereignisse, die G2/MI und Metaphase Anaphase Übergänge und Spermiogenesis. Darüber hinaus können Röhrchen Squash Vorbereitungen zur zytologischen Merkmale der Chromosomen (z. B. interchromatid Domains (ICD) und Kinetochore) und Zentrosomen (Centriolen und Pericentriolar Material/Matrizen) zu visualisieren. Die Squash-Methode kann ohne weiteres parallel andere experimentelle Ansätze, wie z.B. Chromatin Spreads und Proteingewinnung durchgeführt werden. Darüber hinaus wurde diese Technik erfolgreich geändert spermatogenic Frischzellen auf Folien für direkte Visualisierung13zu hinterlegen.
Die hier beschriebene Methode beinhaltet eine ganze Zelle seminiferous Röhrchen Squash Technik um den G2/MI Übergang in Wildtyp C57BL/6J Mäuse zu analysieren. Die zytologischen Merkmale des primären Spermatozyten betreten die erste meiotische Teilung wurden mit Immunfluoreszenz-Mikroskopie, beobachten die meiotische Spindel visualisiert. Dieses vielseitige Technik kann leicht geändert werden, um andere meiotische Stufen und verschiedene Zelltypen zu visualisieren. Die Technik ist auch offen für alternative Visualisierung Strategien, wie DNA und RNA Fisch Ansätze.

<table><tbody><tr><td>16% Paraformaldehyde Aqueous</td><td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Quality Biological</td><td>119-069-161</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A1470</td><td></td></tr><tr><td>Horse Serum</td><td>Sigma</td><td>H-1270</td><td></td></tr><tr><td>35mm x 10mm Petri Dish, Sterile, non-treated</td><td>CellTreat</td><td>P886-229638</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine coated glass slides</td><td>Sigma</td><td>P0425-72EA</td><td></td></tr><tr><td>Liquid Blocker Pen</td><td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td><td>71310</td><td></td></tr><tr><td>Humid Box</td><td>Evergreen</td><td>240-9020-Z10</td><td></td></tr><tr><td>Wheaton Coplin Glass Staining Dish for 5 or 10 Slides</td><td>Fisher</td><td>08-813E</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Cover Slides (22mmx60mm)</td><td>Fisher</td><td>12-544-G</td><td></td></tr><tr><td>Clear Nail Polish</td><td>Amazon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Microsopes&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>SteREO Discovery.V8</td><td>Zeiss</td><td>495015-0001-000&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Observer Z1</td><td>Zeiss</td><td>4109431007994000</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss ZEN 2012 blue edition image software</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ORCA-Flash 4.0 CMOS camera</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Primary Antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Mouse anti-SYCP3</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-74569</td><td>1 in 50</td></tr><tr><td>Rabbit anti-SYCP3</td><td>Fisher (Novus)</td><td>NB300-231</td><td>1 in 1000</td></tr><tr><td>Goat anti-SCP3</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-20845</td><td>1 in 50</td></tr><tr><td>Human anti-Centromere Protein</td><td>Antibodies Incorporated</td><td>15-235</td><td>1 in 100</td></tr><tr><td>Mouse anti-alpha tubulin</td><td>Sigma</td><td>T9026</td><td>1 in 1000</td></tr><tr><td>Mouse anti-AIM1</td><td>BD Biosciences</td><td>611082</td><td>1 in 200</td></tr><tr><td>Mouse anti-&amp;gamma;H2AX</td><td>Thermo Fisher</td><td>MA1-2022</td><td>1 in 500</td></tr><tr><td>Mouse anti-CENT3</td><td>Abnova</td><td>H00001070-M01</td><td>1 in 200</td></tr><tr><td>Rabbit anti-pericentrin</td><td>Abcam</td><td>ab4448</td><td>1 in 200</td></tr><tr><td>Rabbit anti-REC8</td><td>Courtesy of&amp;nbsp; Dr. Karen Schindler</td><td>N/A</td><td>1 in 1000</td></tr></tbody></table>

a seminiferous tubule squash technique for the cytological analysis of spermatogenesis using the mouse model

Meiotische Progression bei Männern ist ein Prozess, der die konzertierte Aktion eine Reihe von stark regulierten zelluläre Ereignisse erfordert. Während der Meiose auftretende Fehler können zu Unfruchtbarkeit, Schwangerschaftverlust oder Gendefekte führen. Beginnend mit dem Beginn der Pubertät und während der gesamten Erwachsenenalter, kontinuierliche halbsynchrone Wellen von Spermatozyten Spermatogenese zu unterziehen und letztlich bilden haploide Spermien. Die erste Welle der Maus Spermatozyten unterziehen meiotische Einleitung erscheinen am 10. Tag Post-Partum (10 Dpp) und in das Lumen der seminiferous Röhrchen als reifes Sperma auf 35 Dpp freigesetzt werden. Daher ist es vorteilhaft, Mäuse innerhalb dieser Entwicklungsstörungen Zeitfenster zu nutzen, um hoch angereicherten Populationen von Interesse zu erhalten. Analyse der seltenen Zelle Stadien ist schwieriger bei älteren Mäusen aufgrund des Beitrags von aufeinanderfolgenden spermatogenic Wellen, die die Vielfalt der zellularen Bevölkerungen innerhalb der Tubuli zu erhöhen. Die hier beschriebene Methode ist eine leicht implementierte Technik für die zytologische Auswertung der Zellen innerhalb der seminiferous Röhrchen von Mäusen, einschließlich Spermatogonien, Spermatozyten und Spermatids gefunden. Die Röhrchen Squash Technik bewahrt die Integrität der isolierten männlichen Keimzellen und ermöglicht die Untersuchung der zellulären Strukturen, die mit anderen Techniken nicht einfach visualisiert werden. Um die Anwendungsmöglichkeiten dieser Röhrchen-Squash-Technik zu demonstrieren, wurde Spindel Montage in Spermatozyten voran durch die Prophase, Metaphase, die ich Übergang (G2/MI Übergang) überwacht. Darüber hinaus wurden Centrosome Vervielfältigung, meiotische Geschlechtschromosomen Inaktivierung (MSCI) und Chromosom Blumenstrauß Bildung als Beispiele der zytologischen Strukturen beurteilt, die mit dieser Röhrchen-Squash-Methode beobachtet werden können. Diese Technik kann verwendet werden, um bestimmte Mängel während der Spermatogenese aufzeigen, die durch Mutation oder exogene Störung verursacht werden und trägt somit zum molekularen Verständnis der Spermatogenese.

Hier haben wir die Röhrchen-Squash-Methode verwendet, um vergängliche Zell-Populationen in der Prophase, Metaphase visualisieren ich (G2/MI) Übergang, die angereichert wurden, durch das Ernten von Hoden von juvenile Wildtyp Mäusen durchläuft die erste Welle der Spermatogenese (24 (DPP). Abbildung 1 zeigt repräsentative Bilder von den verschiedenen Phasen der Zelle, die mit den Röhrchen Squash Methode visualisiert werden können. Populationen von Metaph...

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A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

Diese Röhrchen-Squash-Technik soll rasch zytologischen Merkmale entwickeln Maus Spermatozyten unter Beibehaltung der zellulären Integrität zu beurteilen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von allen Stufen der Spermatogenese und neben anderen biochemischen und molekularen biologischen Ansätze zur Erforschung der Maus Meiose leicht umgesetzt werden kann.

Eine Seminiferous Röhrchen-Squash-Technik für die zytologische Analyse der Spermatogenese mit dem Maus-Modell

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

a-seminiferous-tubule-squash-technique-for-cytological-analysis

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

14.9K Aufrufe.  Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health. Diese Röhrchen-Squash-Technik soll rasch zytologischen Merkmale entwickeln Maus Spermatozyten unter Beibehaltung der zellulären Integrität zu beurteilen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von allen Stufen der Spermatogenese und neben anderen biochemischen und molekularen biologischen Ansätze zur Erforschung der Maus Meiose leicht umgesetzt werden kann.

Serie: A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to the next generation. So far, molecular studies of this morphological transition have been hampered by the lack of a method allowing adequate separation of these important steps of spermatid differentiation for subsequent analyses. Earlier attempts at proper gating of these cells using flow cytometry may have been difficult because of a peculiar increase in DNA fluorescence in spermatids undergoing chromatin remodeling. Based on this observation, we provide details of a simple flow cytometry scheme, allowing reproducible purification of four populations of mouse spermatids fixed with ethanol, each representing a different state in the nuclear remodeling process. Population enrichment is confirmed using step-specific markers and morphological criterions. The purified spermatids can be used for genomic and proteomic analyses.

We describe a sorting strategy for mouse spermatids using flow cytometry. Spermatids are sorted into four highly pure populations, including round (spermiogenesis steps 1-9), early elongating (spermiogenesis steps 10-12), late elongating (spermiogenesis steps 13-14) and elongated spermatids (spermiogenesis steps 15-16). DNA staining, size and granulosity are used as selection parameters.

Schritt spezifische Sortierung der Maus Spermatiden durch Durchflusszytometrie

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Collection of Post-mating Semen from the Female Reproductive Tract and Measurement of Semen Liquefaction in Mice

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called liquefaction. In this study, we show how to collect the post-ejaculated semen from the female reproductive tract in a mouse model. First, adult female mice in the estrus stage were housed in a male&#39;s cage overnight. The next morning, copulation was confirmed by the presence of copulatory plug at the vaginal opening. Female mice with copulatory plugs were euthanized, and each reproductive tract was collected as a whole (vagina, uterus, oviducts, ovaries), ensuring a closed system to contain the semen. The reproductive tract was placed in a 1.5 mL microcentrifuge tube, and the vagina was cut off to release the semen into the tube. To ensure maximum semen volume for analysis, toothless forceps were used to squeeze the uterine horns from ovarian end to vaginal end expelling remaining semen. The whole reproductive tract was then discarded. The semen-containing tube was briefly spun down. A 25 &#956;L capillary pipette was placed into the tube at a 180&#176; angle (parallel to the tube wall). The amount of time used to fill the capillary tube to the 25 &#956;L line was recorded. Semen from a proven male breeder usually takes approximately 60-180 s to fill a 25 &#956;L capillary tube. This semen collection technique can also be used in other downstream applications such as sperm imaging and motility analysis.

Semen liquefaction is required for sperm to be liberated from the seminal gel. This study provides the procedures for collecting semen from the female reproductive tract post-coitus, and measuring semen liquefaction time.

Sammlung von Post-Paarung Sperma aus der weiblichen Fortpflanzungsorgane und Messung von Sperma Verflüssigung bei Mäusen

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called ...

Enrichment of Pachytene Spermatocytes and Spermatids from Mouse Testes Using Standard Laboratory Equipment

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete populations is challenging, because the adult testis contains a complex mix of germ cells from all steps of spermatogenesis along with certain populations of somatic cells. Over the past few decades, different techniques such as centrifugal elutriation, fluorescence-activated cell sorting (FACS), and STA-PUT have been successfully applied to the isolation of germ cells. A drawback is that they all require dedicated devices and specialized training. Following principles underlying the STA-PUT method, a simple protocol has been developed for the isolation of pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from mouse testes. After preparing a single cell suspension of testicular cells, specific cell populations are enriched by gravity sedimentation through a discontinuous bovine serum albumin (BSA) density gradient. The cell fractions are then manually collected and microscopically analysed. This modified density gradient for round spermatids (MDR) sedimentation protocol can be widely applied, because it requires only standard laboratory equipment. Furthermore, the protocol requires minimal starting materials, reducing its cost and use of laboratory animals.

Presented here is a protocol for enriching pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from adult mouse testes using a discontinuous bovine serum albumin density gradient with standard laboratory equipment.

Anreicherung von Pachyten-Spermatozyten und Spermatien aus Maushoden mit Standard-Laborgeräten

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete ...

Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses

Spermatogenesis is a unique differentiation process that ultimately gives rise to one of the most distinct cell types of the body, the sperm. Differentiation of germ cells takes place in the cytoplasmic pockets of somatic Sertoli cells that host 4 to 5 generations of germ cells simultaneously and coordinate and synchronize their development. Therefore, the composition of germ cell types within a cross-section is constant, and these cell associations are also known as stages (I&#8211;XII) of the seminiferous epithelial cycle. Importantly, stages can also be identified from intact seminiferous tubules based on their differential light absorption/scatter characteristics revealed by transillumination, and the fact that the stages follow each other along the tubule in a numerical order. This article describes a transillumination-assisted microdissection method for the isolation of seminiferous tubule segments representing specific stages of mouse seminiferous epithelial cycle. The light absorption pattern of seminiferous tubules is first inspected under a dissection microscope, and then tubule segments representing specific stages are cut and used for downstream applications. Here we describe immunostaining protocols for stage-specific squash preparations and for intact tubule segments. This method allows a researcher to focus on biological events taking place at specific phases of spermatogenesis, thus providing a unique tool for developmental, toxicological, and cytological studies of spermatogenesis and underlying molecular mechanisms.

This protocol describes transillumination-assisted microdissection of segments of adult mouse seminiferous tubules representing specific stages of seminiferous epithelial cycle, and cell types therein, and subsequent immunostaining of squash preparations and intact tubule segments.

Spermatogenesis is a unique differentiation process that ultimately gives rise to one of the most distinct cell types of the body, the sperm. ...

<meta charset="utf8"></head><body>Verfahren zur Injektion von runden Spermatiden an der Maus zur Untersuchung der Embryonalentwicklung

Mouse Round Spermatid Injection

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of round spermatid injection (ROSI), oocytes can be successfully fertilized and developed into viable fetuses. In a groundbreaking milestone achieved in 1995, the first mouse fetus was born through ROSI technology. ROSI has since emerged as a pivotal tool for unraveling the intricate mechanisms governing embryonic development and holds significant potential in various applications, including the acceleration of mouse generation and the production of genetically modified mice. In 1996, a milestone was reached when the first human fetus was born through ROSI technology. However, the clinical applications of this method have shown a fluctuating pattern of success and failure. To date, ROSI technology has not found widespread application in clinical practice, primarily due to its low birth efficiency and insufficient validation of fetal safety. This article provides a comprehensive account of the precise methods of performing ROSI in mice, aiming to shed new light on basic research and its potential clinical applications.

<meta charset="utf8"></head><body>Runde Maus-Spermatiden-Injektion

Here, we introduce a method for performing round spermatid injection (ROSI) in mice, a technique with promising clinical applications and utility for investigating the mechanisms underlying embryonic development.

Runde Maus-Spermatiden-Injektion

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of ...

Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice

Germ cell transplantation was developed by Dr. Ralph Brinster and colleagues at the University of Pennsylvania in 19941,2. These ground-breaking studies showed that microinjection of germ cells from fertile donor mice into the seminiferous tubules of infertile recipient mice results in donor-derived spermatogenesis and sperm production by the recipient animal2. The use of donor males carrying the bacterial &beta;-galactosidase gene allowed identification of donor-derived spermatogenesis and transmission of the donor haplotype to the offspring by recipient animals1. Surprisingly, after transplantation into the lumen of the seminiferous tubules, transplanted germ cells were able to move from the luminal compartment to the basement membrane where spermatogonia are located3. It is generally accepted that only SSCs are able to colonize the niche and re-establish spermatogenesis in the recipient testis. Therefore, germ cell transplantation provides a functional approach to study the stem cell niche in the testis and to characterize putative spermatogonial stem cells. To date, germ cell transplantation is used to elucidate basic stem cell biology, to produce transgenic animals through genetic manipulation of germ cells prior to transplantation4,5, to study Sertoli cell-germ cell interaction6,7, SSC homing and colonization3,8, as well as SSC self-renewal and differentiation9,10.
Germ cell transplantation is also feasible in large species11. In these, the main applications are preservation of fertility, dissemination of elite genetics in animal populations, and generation of transgenic animals as the study of spermatogenesis and SSC biology with this technique is logistically more difficult and expensive than in rodents. Transplantation of germ cells from large species into the seminiferous tubules of mice results in colonization of donor cells and spermatogonial expansion, but not in their full differentiation presumably due to incompatibility of the recipient somatic cell compartment with the germ cells from phylogenetically distant species12. An alternative approach is transplantation of germ cells from large species together with their surrounding somatic compartment. We first reported in 2002, that small fragments of testis tissue from immature males transplanted under the dorsal skin of immunodeficient mice are able to survive and undergo full development with the production of fertilization competent sperm13. Since then testis tissue xenografting has been shown to be successful in many species and emerged as a valuable alternative to study testis development and spermatogenesis of large animals in mice14.

Protocols for germ cell transplantation and testis tissue xenografting are described. Germ cell transplantation results in donor-derived spermatogenesis in recipient testes and represents a functional reconstitution assay for identification of spermatogonial stem cells (SSCs). Testis tissue xenografting reproduces testis development and spermatogenesis of various donor species in recipient mice.

Germ Cell Transplantation und Hodengewebe in Mäusen Xenografting

Germ cell transplantation was developed by Dr. Ralph Brinster and colleagues at the University of Pennsylvania in 19941,2. These ground-breaking studies ...

Biologie

Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation

Mammalian spermatogenesis is a complex differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous tubules of the testes. Currently, there is no reliable cell culture system allowing for spermatogenic differentiation in vitro, and most biological studies of spermatogenic cells require tissue harvest from animal models like the mouse and rat. Because the testis contains numerous cell types - both non-spermatogenic (Leydig, Sertoli, myeloid, and epithelial cells) and spermatogenic (spermatogonia, spermatocytes, round spermatids, condensing spermatids and spermatozoa) - studies of the biological mechanisms involved in spermatogenesis require the isolation and enrichment of these different cell types. The STA-PUT method allows for the separation of a heterogeneous population of cells - in this case, from the testes - through a linear BSA gradient. Individual cell types sediment with different sedimentation velocity according to cell size, and fractions enriched for different cell types can be collected and utilized in further analyses. While the STA-PUT method does not result in highly pure fractions of cell types, e.g. as can be obtained with certain cell sorting methods, it does provide a much higher yield of total cells in each fraction (~1 x 108 cells/spermatogenic cell type from a starting population of 7-8 x 108 cells). This high yield method requires only specialized glassware and can be performed in any cold room or large refrigerator, making it an ideal method for labs that have limited access to specialized equipment like a fluorescence activated cell sorter (FACS) or elutriator.

The STA-PUT method allows for the separation of different populations of spermatogenic cells based on size and density.

Die Trennung der Spermatogenese Zelltypen Mit STA-PUT Velocity Sedimentation

Mammalian spermatogenesis is a complex  differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous  tubules of the testes. Currently, there ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

Die zytologische Analyse der Spermatogenese: Live-und Fest Zubereitungen aus<em&gt; Drosophila</em&gt; Hoden

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Eine Seminiferous Röhrchen-Squash-Technik für die zytologische Analyse der Spermatogenese mit dem Maus-Modell

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Schritt spezifische Sortierung der Maus Spermatiden durch Durchflusszytometrie

Sammlung von Post-Paarung Sperma aus der weiblichen Fortpflanzungsorgane und Messung von Sperma Verflüssigung bei Mäusen

Anreicherung von Pachyten-Spermatozyten und Spermatien aus Maushoden mit Standard-Laborgeräten

Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses

Runde Maus-Spermatiden-Injektion

Runde Maus-Spermatiden-Injektion

Runde Maus-Spermatiden-Injektion

Germ Cell Transplantation und Hodengewebe in Mäusen Xenografting

Die Trennung der Spermatogenese Zelltypen Mit STA-PUT Velocity Sedimentation

Die zytologische Analyse der Spermatogenese: Live-und Fest Zubereitungen aus