Name: a seminiferous tubule squash technique for the cytological analysis of spermatogenesis using the mouse model
Uploaded: 2018-02-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model at JoVE.com

이 작품 NIGMS (R01GM11755) P.W.J.에 의해 및 훈련 그랜트 친목에서 미국 국립 암 연구소 (NIH) (CA009110) S.R.W. 하 재 혁에 의해 지원 되었다

마우스를 사용 하 여 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 존스 홉킨스 대학에 의해 승인 되었다. 실험 청소년 (20-26 일 산 후, dpp)에서 수행한 C57BL/6J 마우스, spermatogenesis 반동기 첫 번째 물결의 활용. 그러나,이 기술은 또한 수행할 수 있습니다 성인 쥐를 사용 하 여.
1. 해 부 및 마우스 seminiferous tubules의 절연
<ol><li>수정/세포 솔루션 및 항 체 희석 버퍼 (ADB) 표 1 및 표 2에 설명 된 준비.</li>
	<li>버퍼링 하는 인산 염 (1 x PBS, pH 7.4), x 1의 3 mL와 함께 한 35 mm 페 트리 접시와 마우스 당 수정/세포 솔루션의 2 mL와 함께 또 다른 35 m m 접시를 준비 합니다.</li>
	<li>자 궁 경관 탈 구 또는 CO2 질을 통해 마우스를 희생 하 고 70% 에탄올과 복 부 복 부를 스프레이. 살 균가 위, V 자형 오프닝 만들기를 사용 하 여 abdominopelvic 구멍을 엽니다. Testes, 집게를 사용 하 여 epididymal 지방 패드를 제거 그리고 tunica albuginea방해 하지 마십시오. 1 x PBS를 포함 하는 35 mm 페 트리 접시에 testes를 놓습니다. 참고: 관심14의 풍부한 세포 인구를 관찰 하기 위해 spermatogenesis의 첫 번째 파도 이용 한다. Spermatogenesis의 특정 단계 다른 마우스 연령대 (표 3)에 농축 된다.</li>
	<li>날카로운 흘린된 집게와 조직 puncturing 의해 tunica albuginea 고환 제거 하 고 느슨한 seminiferous tubules를 수집. 새로운 35 mm 페 트리 접시 수정/세포 솔루션의 2 개 mL를 포함 하는 tubules를 전송 합니다.</li>
	<li>실 온에서 5 분에 대 한 수정/세포 솔루션에서 tubules를 품 어.</li>
</ol>2입니다. seminiferous tubules의 준비
<ol><li>액체 차단 펜으로 슬라이드의 가장자리를 표시 하 여 폴 리-L-리 신 코팅된 유리 슬라이드를 준비 합니다.</li>
	<li>유리 슬라이드 중심에 수정/세포 솔루션의 100 µ L를 적용 됩니다.</li>
	<li>소독 집게를 사용 하 여와 위를 부드럽게 떨어져 seminiferous tubules 애타게. 오래 개별 관 절단 길이 약 20 m m를 세그먼트화합니다. 참고: centrosomes와 같은 장기간된 통 노출에 민감한 구조를 시각화, 1 x PBS에는 tubules를 먼저 분리 후 직접 말하다 tubules의 표면에 폴 리 리 신 슬라이드 수정 세포 솔루션의 100 µ L에 코팅.</li>
	<li>수정/세포 솔루션을 포함 하는 준비 된 폴 리-L-리 신 코팅된 유리 슬라이드에 5 개의 20 밀리미터 긴 seminiferous 관 세그먼트를 전송 합니다.</li>
	<li>1.5에서 3.0 m m 세그먼트로 살 균가 위 말하다 seminiferous tubules를 사용 하 여.</li>
	<li>사용 하 여 살 균 겸 정렬할 관 세그먼트를 유리 슬라이드에 없습니다 조직을 중복, tubules는 균등 하 게 배포. 참고: 유리 슬라이드에 관 세그먼트의 최적의 번호 20와 40 사이입니다.</li>
</ol>3. 부 수 seminiferous tubules의
<ol><li>분산된 seminiferous 관 세그먼트는 벤치탑에 포함 된 유리 슬라이드를 전송 합니다. 스쿼시 단계 조직 손실을 방지 하려면 실험실 지우기를 사용 하 여 과잉 액체를 제거 합니다.</li>
	<li>유리 슬라이드 위에 coverslip (22 x 60-1.5 m m)를 적용 하 고 10-20 초에 대 한 손바닥의 발뒤꿈치와 압력을 적용. 그것은 seminiferous tubules에서 spermatocytes를 분산 하도록 충분 한 힘을 적용 해야 합니다. 참고: 해 부 현미경 사용 하 여 모든 관 세그먼트 중단은 퇴치 단계를 최적화 하는 tubules를 관찰 합니다.</li>
	<li>슬라이드 집게를 사용 하 여, 즉시 플래시 동결 액체 N2 의 작은 dewar의 유리 슬라이드 15 초, 또는 액체 거품 중단 될 때까지. Immunolabeling는 즉시, 직선 모서리 면도날으로 coverslip 제거, 좋은 팁 집게 또는 21-게이지 바늘. 참고: 최적의 결과 immunolabel에 대 한 즉시 슬라이드 (4 단계 참조). 그러나,이 시점에서 슬라이드 수 유지-80 ° C에서 최대 2 주 동안. 단백질 및 세포 구조물의 수명을 최대화 하기 위해 즉시 드라이 아이스 또는-80 ° C 냉장고에 슬라이드를 저장 하 고 슬라이드에는 coverslip 유지. Immunolabeling 슬라이드를 저장 하는 경우 단계 3.3에에서 설명 된 대로 15 초 동안 액체 N2 에서 슬라이드를 immersing 하 여는 coverslip을 제거 합니다.</li>
</ol>4입니다. 마운트 seminiferous tubules의 Immunolabeling
<ol><li>공영 방송, 그리고 세 번 1 x PBS를 포함 하는 50 mL Coplin jar에 5 분 동안 세척 x 1에 슬라이드를 담가. 참고: 결코 허용 슬라이드 immunolabeling 동안 완전히 건조.</li>
	<li>1-2 h 습도 챔버에 차단 유리 슬라이드에 항 체 희석 버퍼의 1 mL를 적용 합니다.</li>
	<li>항 체 희석 버퍼를 제거 하 고 기본 항 체 항 체 희석 버퍼 습도 챔버에에서 희석의 100 µ L를 적용. 참고: 최상의 결과 얻으려면 기본 항 체 4 ° c.에 하룻밤을 품 어 취재는 coverslip 또는 parafilm으로 슬라이드 하 여 항 체 (예: 50 µ L)의 작은 볼륨을 사용 합니다. 유효성을 검사 하 고 기본 항 체15최적화.</li>
	<li>1 x PBS를 포함 하는 50 mL Coplin jar에 5 분에 대 한 세 번 슬라이드를 씻어. 참고: 을 강화 하기 위해 세척 Coplin 단지 작은 자석 저 어 막대를 사용 하 여 선동 낮은 속도로 자기 저 어 접시에 장소 또는 낮은 속도로 탁상 믹서에 Coplin jar를 배치.</li>
	<li>실내 온도에 습도 챔버에 1 ~ 1.5 h에 대 한 항 체 희석 버퍼에 희석 이차 항 체의 100 µ L를 적용 합니다. 사진 fluorophore 활용 된 항 체의 표백 피하기 위해 어두운 상자에서 슬라이드를 품 어. 참고: 취재는 coverslip 또는 parafilm으로 슬라이드 하 여 항 체 (예: 50 µ L)의 작은 볼륨을 사용 합니다.</li>
	<li>1 x PBS를 포함 하는 50 mL Coplin jar에 5 분에 대 한 두 번 슬라이드를 씻어.</li>
	<li>장착 매체 포함 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1.5 µ g/mL)에서 슬라이드를 탑재 하 고 coverslips (22 x 60-1.5 m m)를 적용 합니다.</li>
	<li>슬라이드를 보존 하는 coverslips 이동에서 방지 투명 매니큐어와 슬라이드 coverslips 인감.</li>
</ol>5. 분석 및 이미징 관 스쿼시 준비
<ol><li>Epifluorescence 현미경을 사용 하 여 정확한 z 축 이동 하 고 이미지 캡처에 대 한 고해상도 카메라 자동 무대. 또는 사용 하는 레이저 confocal 현미경. 참고: 이 단계에 대 한 모든 사용 가능한 하드웨어와 소프트웨어를 사용 합니다. 예를 들어 그림 1 과 그림 2 에 표시 된 이미지를 자이 스 셀 관찰자 Z1 오카-플래시 4.0 CMOS 카메라에 연결 하 고 Zeiss 선 2012 블루 에디션 이미지 소프트웨어와 함께 분석을 사용 하 여 점령 했다.</li>
	<li>스쿼시 준비의 품질을 결정 하는 20 X 목표를 사용 하 여 슬라이드를 평가 합니다. 좋은 품질 슬라이드는 균등 하 게 배포 되는 핵의 단층. 참고: 슬라이드의 일부 섹션은 다른 사람 들 보다 더 있을 수 있습니다, 그리고 어디 슬라이드의 최고의 지역 높은 확대를 사용 하 여 추가 분석을 위해 찾을 수 있습니다의 좌표를 참고 것이 좋습니다.</li>
	<li>높은 확대 목표 (예: 63 X 또는 X 100), 핵의 일관 된 단층 되는 슬라이드의 캡처 영역을 사용 하 여. 영역 선택 위쪽을 설정 하 고 Z-스택 모든 초점에 빛을 캡처 되도록 낮은. 참고: Z-스택 위와 더 낮은 한계 사이 촬영의 최적의 수 이미지 수집 소프트웨어에 의해 일반적으로 지정 하 고 각 목표에 대 한 다른.</li>
	<li>이미지 프로세싱 소프트웨어를 사용 하 여 컴파일하려면 깊이 확장된 초점 이미지. 소프트웨어 스택에서 각 Z-, 초점에 빛을 결합 하 고 관 스쿼시 준비의 최적의 이미징에 대 한 필수적입니다.</li>
</ol>

<ol>
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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis+in+the+immature+mouse+proceeds+faster+than+in+the+adult.">Spermatogenesis in the immature mouse proceeds faster than in the adult.</a> Int J Androl. 5 (3), 282-294 (1982).</li><li>Rodriguez, I., Ody, C., Araki, K., Garcia, I., Vassalli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+early+and+massive+wave+of+germinal+cell+apoptosis+is+required+for+the+development+of+functional+spermatogenesis.">An early and massive wave of germinal cell apoptosis is required for the development of functional spermatogenesis.</a> EMBO J. 16 (9), 2262-2270 (1997).</li><li>Kangasniemi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+basal+and+FSH+dependent+cyclic+AMP+production+in+rat+seminiferous+tubules+staged+by+an+improved+transillumination+technique.">Modulation of basal and FSH dependent cyclic AMP production in rat seminiferous tubules staged by an improved transillumination technique.</a> Anat Rec. 227 (1), 62-76 (1990).</li><li>Martianov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late+arrest+of+spermiogenesis+and+germ+cell+apoptosis+in+mice+lacking+the+TBP-like+TLF/TRF2+gene.">Late arrest of spermiogenesis and germ cell apoptosis in mice lacking the TBP-like TLF/TRF2 gene.</a> Mol Cell. 7 (3), 509-515 (2001).</li><li>Henriks&#233;n, K., Parvinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+apoptosis+of+male+germ+cells+in+the+rat:+Mechanisms+of+cell+death+studied+by+supravital+squash+preparations.">Stage-specific apoptosis of male germ cells in the rat: Mechanisms of cell death studied by supravital squash preparations.</a> Tissue Cell. 30 (6), 692-701 (1998).</li></ol>

저자는 공개 없다.

마우스는 셀룰러 이벤트 spermatogenesis 동안 meiotic 진행을 제어 하는 공부에 대 한 유용한 모델 유기 체 입증. 또한, 그것 때문에 많은 이벤트와 같은 종료 meiotic 의향에서 내가 spermatogenesis의 연구 들만 하는 도구를 개발 하는 데 필요한, 성적으로 동종이 형. 이 프로토콜 seminiferous 관 스쿼시 방법을 시각화 및 서로 다른 단계의 마우스 spermatogenesis의 연구에 설명합니다. 이 방법은 세포 무결성을 보존 ?...

감수 분열은 DNA 복제의 단일 라운드 세포 분열의 2 연속 라운드 뒤 복잡 한 세포 이벤트입니다. 여러 감수 분열-특정 이벤트는 정확한 염색체 분리 되도록 감수 분열의 초기 단계에서 조정 해야 합니다. 이러한 이벤트 등 동종 재결합, 자매의 공동 방향의 완료 첫번째 meiotic 사단 그리고 homologs 사이 chiasmata 해결 하려면 cohesin 복합물의 stepwise 손실 동안 kinetochores. 이러한 프로세스의 정확한 규정은 비 옥도 유지 하 고 유전 발달 장애 및 자연 유산1발생할 수 있습니다 염색체 missegregation 이벤트를 방지 하기 위해 필요 합니다.
감수 분열의 주요 이벤트는 남성과 여성 모두에서 자리를 차지할 하는 동안 중요 한 시간적 및 기계적 차이 spermatogenesis 및 oogenesis2사이 존재 한다. 예를 들어 여성 감수 분열, 의향 배아 개발 하는 동안 발생 하 고 dictyate 단계에서 사춘기까지 체포 중 반면, spermatogenesis 사춘기와 체포 하지 않고 성인 생활 내내 파도에 진행 개시. 남성과 여성의 감수 분열의 차이 특히 spermatocytes에 oocytes 이러한 프로세스 평가 쪽으로 음식을 장만 하는 방법을 개발 하는 필요를 강조 한다. 현재, chromatin 스프레드3,,45의 사용에 의존 meiotic 진행을 주로 평가 합니다. Chromatin 스프레드 meiotic 염색체를 공부 하는 데 유용 동안, 그들은 세포 구조 스핀 들 microtubules, centrosomes, 핵 봉투, telomere 첨부 파일 등의 평가 방지 하는 세포 무결성을 유지 하 실패. 라이브 이미징 및 장기 자란 기술을 크게 고급 여성 감수 분열;에 대 한 우리의 이해 그러나 전체 그대로 셀 시각화를 유사한 방법, 자주 spermatogenesis6,7의 연구에 대 한 구현 됩니다. 남성 감수 분열을 통해 동적 이벤트를 시각화 하기 위해 우리 빠르게 마우스 spermatocytes8,9개발의 cytological 기능을 평가 하기 위해 설립 된 관 스쿼시 기술을 적응 시켰다. 여기 설명 하는 방법을 spermatogenesis의 다른 단계 동안 여러 세포 구조의 연구를 활성화 하는 세포의 무결성을 유지 합니다.
이 관 스쿼시 기술은 면역 형광 현미경을 통해 세포 구조의 평가 대 한 허용 하는 전체 셀 접근 이다. Haematoxylin 오신 파라핀 포함 testes, 및 cryosections의 immunofluorescent 라벨의 얼룩 등 남성 쥐에서 meiotic 진행을 시각화 하기 위해 일반적인 조직학 접근 허용 meiotic 진행에 대 한 광범위 한 개요. 그러나, 이러한 기술을 감수 분열10,11에 걸쳐 발생 하는 이벤트의 자세한 분석을 위해 필요한 범위 내에 단일 셀을 해결 하기 위해 실패 합니다. 대체 기술을 meiotic 프로세스를 시각화 하는 격리 하 고 수정 핵 자료3,,45spermatocyte 중요 한 chemiosmotic 중단에 의존 합니다. 이러한 화학 치료 기본 spermatocytes 다른 세포 유형의 관찰을 방해. Namekawa에 의해 최근에 설명된 방법 격리 spermatocytes의 핵 건축을 보존 하기 위해 연구 커뮤니티 활성화 하지만 cytospin 및 일부 실험실4쉽게 사용할 수 없을 수 있는 액세서리를 사용 해야 합니다. 대조적으로, 관 스쿼시 기술에는 대부분 세포 생물학 실험실에서 일반적으로 표준 장비를 필요 합니다.
여기 설명 하는 관 스쿼시 방법은 시각화 sertoli 세포, 등 spermatogonia, 기본 및 보조 spermatocytes spermatids seminiferous 관 내의 다양 한 셀 형식에 사용할 수 있습니다. 여 청소년 쥐에서 spermatogenesis 근처 동기 첫 번째 물결에이 기술을 결합해, 그들은 감수 분열12진행 spermatogenic 세포의 풍부한 인구를 가능 하다. 이 프로세스는 spermatogenesis 초기 의향 이벤트 등을 통해 프로세스의 상세한 분석, g 2/미와 분열 anaphase 전환 및 spermiogenesis를 허용합니다. 또한, 관 스쿼시 준비 시각화 염색체 (예: interchromatid 도메인 (Icd) 및 kinetochores)와 centrosomes (centrioles 및 pericentriolar 재료/행렬)의 cytological 기능을 사용할 수 있습니다. 스쿼시 메서드 chromatin 확산과 단백질 추출 등 다른 실험 방법 동시에 손쉽게 수행할 수 있습니다. 또한,이 기술은 성공적으로 수정 되었습니다 직접 시각화13슬라이드에 생활 spermatogenic 셀을 입금.
여기 설명 하는 방법을 야생-타입 C57BL/6J 마우스에서 g 2/미 전환 분석 전체 셀 seminiferous 관 스쿼시 기술을 포함 한다. 첫 번째 meiotic 부문 입력 기본 spermatocytes의 cytological 기능 관찰 meiotic 스핀 들에 면역 형광 검사 현미경 검사 법으로 시각화 했다. 이 다재 다능 한 기술은 다른 meiotic 단계와 다른 세포 유형 시각화를 쉽게 수정할 수 있습니다. 기술은 의무가 DNA와 RNA 물고기 접근 등 대체 시각화 전략 이기도합니다.

<table><tbody><tr><td>16% Paraformaldehyde Aqueous</td><td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Quality Biological</td><td>119-069-161</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A1470</td><td></td></tr><tr><td>Horse Serum</td><td>Sigma</td><td>H-1270</td><td></td></tr><tr><td>35mm x 10mm Petri Dish, Sterile, non-treated</td><td>CellTreat</td><td>P886-229638</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine coated glass slides</td><td>Sigma</td><td>P0425-72EA</td><td></td></tr><tr><td>Liquid Blocker Pen</td><td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td><td>71310</td><td></td></tr><tr><td>Humid Box</td><td>Evergreen</td><td>240-9020-Z10</td><td></td></tr><tr><td>Wheaton Coplin Glass Staining Dish for 5 or 10 Slides</td><td>Fisher</td><td>08-813E</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Cover Slides (22mmx60mm)</td><td>Fisher</td><td>12-544-G</td><td></td></tr><tr><td>Clear Nail Polish</td><td>Amazon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Microsopes&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>SteREO Discovery.V8</td><td>Zeiss</td><td>495015-0001-000&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Observer Z1</td><td>Zeiss</td><td>4109431007994000</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss ZEN 2012 blue edition image software</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ORCA-Flash 4.0 CMOS camera</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Primary Antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Mouse anti-SYCP3</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-74569</td><td>1 in 50</td></tr><tr><td>Rabbit anti-SYCP3</td><td>Fisher (Novus)</td><td>NB300-231</td><td>1 in 1000</td></tr><tr><td>Goat anti-SCP3</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-20845</td><td>1 in 50</td></tr><tr><td>Human anti-Centromere Protein</td><td>Antibodies Incorporated</td><td>15-235</td><td>1 in 100</td></tr><tr><td>Mouse anti-alpha tubulin</td><td>Sigma</td><td>T9026</td><td>1 in 1000</td></tr><tr><td>Mouse anti-AIM1</td><td>BD Biosciences</td><td>611082</td><td>1 in 200</td></tr><tr><td>Mouse anti-&amp;gamma;H2AX</td><td>Thermo Fisher</td><td>MA1-2022</td><td>1 in 500</td></tr><tr><td>Mouse anti-CENT3</td><td>Abnova</td><td>H00001070-M01</td><td>1 in 200</td></tr><tr><td>Rabbit anti-pericentrin</td><td>Abcam</td><td>ab4448</td><td>1 in 200</td></tr><tr><td>Rabbit anti-REC8</td><td>Courtesy of&amp;nbsp; Dr. Karen Schindler</td><td>N/A</td><td>1 in 1000</td></tr></tbody></table>

a seminiferous tubule squash technique for the cytological analysis of spermatogenesis using the mouse model

남성에서 meiotic 진행 높은 규제 셀룰러 이벤트 수의 공동된 작업을 필요로 하는 프로세스입니다. 감수 분열 중 발생 하는 오류는 불 임, 임신 손실 또는 유전자 결함이 발생할 수 있습니다. 사춘기와 성인 기 통해 계속의 개시에 개시, spermatocytes의 연속 반동기 파도 spermatogenesis 받아야 하 고 궁극적으로 단일 정자를 형성 한다. 마우스 spermatocytes meiotic 개시 진행의 첫 번째 파도 (10 dpp) 산 10 일 후에 나타납니다 하 고 35 dpp에서 성숙한 정자로 seminiferous tubules의 루멘으로 해제 됩니다. 따라서, 그것은 관심의 매우 풍부한 인구를 얻기 위하여이 발달 시간 창 내에서 마우스를 이용 하입니다. 희귀 세포 단계의 분석 이전 마우스는 tubules 내 세포 인구의 다양성을 증가 하는 연속 spermatogenic 파도의 기여 금 때문에 더 어렵습니다. 여기 설명 하는 방법을 spermatogonia, spermatocytes, 및 spermatids를 포함 하 여 쥐의 seminiferous tubules 내 세포의 cytological 평가 위한 쉽게 구현 된 기술입니다. 관 스쿼시 기술 격리 된 남성 생식 세포의 무결성을 유지 하 고 세포 구조를 다른 기술로 쉽게 시각화 하지의 시험 있습니다. 설명 하기 위해이 관 스쿼시 기술의 가능한 애플 리 케이 션, 스핀 들 어셈블리 spermatocytes 내가 전환 분열에 의향을 통해 진행 (g 2/미 전환) 모니터링 했다. 또한, centrosome 중복, meiotic 섹스 염색체 비활성화 (MSCI), 및 염색체 꽃다발 형성이 관 스쿼시 메서드를 사용 하 여 관찰 될 수 있다 cytological 구조의 사례로 평가 됐다. 이 기술은 spermatogenesis 동안 돌연변이 또는 외 인 섭 동에 의해 발생 하는 특정 결함을 정확 하 게 사용할 수 있습니다 따라서, 우리의 분자 spermatogenesis 이해에 기여.

여기, 우리가 분열 하는 의향을 겪고 일시적인 세포 인구를 시각화 하 관 스쿼시 메서드 사용 난 (G2/MI) 청소년 야생-타입 마우스 spermatogenesis (24의 첫번째 파를 겪고에서 testes를 수확 하 여 농축 된 전환 민 진 당)입니다. 그림 1 관 스쿼시 메서드를 사용 하 여 구상 될 수 있다 다양 한 셀 단계의 대표 이미지를 묘사. 분열의 농축 내가 spermatocytes 알파-tub...

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A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

이 관 스쿼시 기술의 목표는 빠르게 세포 무결성을 유지 하면서 마우스 spermatocytes를 개발의 cytological 기능을 평가 하기 위해입니다. 이 메서드와 spermatogenesis의 모든 단계의 학문에 대 한 수 있습니다 마우스 감수 분열의 연구에 대 한 다른 생화학 및 분자 생물학적 접근 함께 쉽게 구현할 수 있다.

Spermatogenesis 마우스 모델을 사용 하 여의 Cytological 분석을 위한 Seminiferous 관 스쿼시 기술

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

a-seminiferous-tubule-squash-technique-for-cytological-analysis

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

14.9K 조회수.  Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health. 이 관 스쿼시 기술의 목표는 빠르게 세포 무결성을 유지 하면서 마우스 spermatocytes를 개발의 cytological 기능을 평가 하기 위해입니다. 이 메서드와 spermatogenesis의 모든 단계의 학문에 대 한 수 있습니다 마우스 감수 분열의 연구에 대 한 다른 생화학 및 분자 생물학적 접근 함께 쉽게 구현할 수 있다.

비디오: A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to the next generation. So far, molecular studies of this morphological transition have been hampered by the lack of a method allowing adequate separation of these important steps of spermatid differentiation for subsequent analyses. Earlier attempts at proper gating of these cells using flow cytometry may have been difficult because of a peculiar increase in DNA fluorescence in spermatids undergoing chromatin remodeling. Based on this observation, we provide details of a simple flow cytometry scheme, allowing reproducible purification of four populations of mouse spermatids fixed with ethanol, each representing a different state in the nuclear remodeling process. Population enrichment is confirmed using step-specific markers and morphological criterions. The purified spermatids can be used for genomic and proteomic analyses.

We describe a sorting strategy for mouse spermatids using flow cytometry. Spermatids are sorted into four highly pure populations, including round (spermiogenesis steps 1-9), early elongating (spermiogenesis steps 10-12), late elongating (spermiogenesis steps 13-14) and elongated spermatids (spermiogenesis steps 15-16). DNA staining, size and granulosity are used as selection parameters.

단계 별 마우스 정자의 정렬을 유동 세포 계측법에 의해

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

연구

발생학

Collection of Post-mating Semen from the Female Reproductive Tract and Measurement of Semen Liquefaction in Mice

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called liquefaction. In this study, we show how to collect the post-ejaculated semen from the female reproductive tract in a mouse model. First, adult female mice in the estrus stage were housed in a male&#39;s cage overnight. The next morning, copulation was confirmed by the presence of copulatory plug at the vaginal opening. Female mice with copulatory plugs were euthanized, and each reproductive tract was collected as a whole (vagina, uterus, oviducts, ovaries), ensuring a closed system to contain the semen. The reproductive tract was placed in a 1.5 mL microcentrifuge tube, and the vagina was cut off to release the semen into the tube. To ensure maximum semen volume for analysis, toothless forceps were used to squeeze the uterine horns from ovarian end to vaginal end expelling remaining semen. The whole reproductive tract was then discarded. The semen-containing tube was briefly spun down. A 25 &#956;L capillary pipette was placed into the tube at a 180&#176; angle (parallel to the tube wall). The amount of time used to fill the capillary tube to the 25 &#956;L line was recorded. Semen from a proven male breeder usually takes approximately 60-180 s to fill a 25 &#956;L capillary tube. This semen collection technique can also be used in other downstream applications such as sperm imaging and motility analysis.

Semen liquefaction is required for sperm to be liberated from the seminal gel. This study provides the procedures for collecting semen from the female reproductive tract post-coitus, and measuring semen liquefaction time.

후에 쥐에 있는 정액 액의 측정 및 여성 재생산 지역에서 정액 짝짓기의 컬렉션

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called ...

Enrichment of Pachytene Spermatocytes and Spermatids from Mouse Testes Using Standard Laboratory Equipment

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete populations is challenging, because the adult testis contains a complex mix of germ cells from all steps of spermatogenesis along with certain populations of somatic cells. Over the past few decades, different techniques such as centrifugal elutriation, fluorescence-activated cell sorting (FACS), and STA-PUT have been successfully applied to the isolation of germ cells. A drawback is that they all require dedicated devices and specialized training. Following principles underlying the STA-PUT method, a simple protocol has been developed for the isolation of pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from mouse testes. After preparing a single cell suspension of testicular cells, specific cell populations are enriched by gravity sedimentation through a discontinuous bovine serum albumin (BSA) density gradient. The cell fractions are then manually collected and microscopically analysed. This modified density gradient for round spermatids (MDR) sedimentation protocol can be widely applied, because it requires only standard laboratory equipment. Furthermore, the protocol requires minimal starting materials, reducing its cost and use of laboratory animals.

Presented here is a protocol for enriching pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from adult mouse testes using a discontinuous bovine serum albumin density gradient with standard laboratory equipment.

표준 실험실 장비를 사용하여 마우스 고환에서 파키텐 정자 세포와 정자의 농축

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete ...

Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses

Spermatogenesis is a unique differentiation process that ultimately gives rise to one of the most distinct cell types of the body, the sperm. Differentiation of germ cells takes place in the cytoplasmic pockets of somatic Sertoli cells that host 4 to 5 generations of germ cells simultaneously and coordinate and synchronize their development. Therefore, the composition of germ cell types within a cross-section is constant, and these cell associations are also known as stages (I&#8211;XII) of the seminiferous epithelial cycle. Importantly, stages can also be identified from intact seminiferous tubules based on their differential light absorption/scatter characteristics revealed by transillumination, and the fact that the stages follow each other along the tubule in a numerical order. This article describes a transillumination-assisted microdissection method for the isolation of seminiferous tubule segments representing specific stages of mouse seminiferous epithelial cycle. The light absorption pattern of seminiferous tubules is first inspected under a dissection microscope, and then tubule segments representing specific stages are cut and used for downstream applications. Here we describe immunostaining protocols for stage-specific squash preparations and for intact tubule segments. This method allows a researcher to focus on biological events taking place at specific phases of spermatogenesis, thus providing a unique tool for developmental, toxicological, and cytological studies of spermatogenesis and underlying molecular mechanisms.

This protocol describes transillumination-assisted microdissection of segments of adult mouse seminiferous tubules representing specific stages of seminiferous epithelial cycle, and cell types therein, and subsequent immunostaining of squash preparations and intact tubule segments.

Spermatogenesis is a unique differentiation process that ultimately gives rise to one of the most distinct cell types of the body, the sperm. ...

<meta charset="utf8"></head><body>배아 발달을 연구하기 위한 Murine Round Spermatid Injection Procedure

Mouse Round Spermatid Injection

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of round spermatid injection (ROSI), oocytes can be successfully fertilized and developed into viable fetuses. In a groundbreaking milestone achieved in 1995, the first mouse fetus was born through ROSI technology. ROSI has since emerged as a pivotal tool for unraveling the intricate mechanisms governing embryonic development and holds significant potential in various applications, including the acceleration of mouse generation and the production of genetically modified mice. In 1996, a milestone was reached when the first human fetus was born through ROSI technology. However, the clinical applications of this method have shown a fluctuating pattern of success and failure. To date, ROSI technology has not found widespread application in clinical practice, primarily due to its low birth efficiency and insufficient validation of fetal safety. This article provides a comprehensive account of the precise methods of performing ROSI in mice, aiming to shed new light on basic research and its potential clinical applications.

<meta charset="utf8"></head><body>마우스 라운드 Spermatid 주입

Here, we introduce a method for performing round spermatid injection (ROSI) in mice, a technique with promising clinical applications and utility for investigating the mechanisms underlying embryonic development.

마우스 라운드 Spermatid 주입

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of ...

Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice

Germ cell transplantation was developed by Dr. Ralph Brinster and colleagues at the University of Pennsylvania in 19941,2. These ground-breaking studies showed that microinjection of germ cells from fertile donor mice into the seminiferous tubules of infertile recipient mice results in donor-derived spermatogenesis and sperm production by the recipient animal2. The use of donor males carrying the bacterial &beta;-galactosidase gene allowed identification of donor-derived spermatogenesis and transmission of the donor haplotype to the offspring by recipient animals1. Surprisingly, after transplantation into the lumen of the seminiferous tubules, transplanted germ cells were able to move from the luminal compartment to the basement membrane where spermatogonia are located3. It is generally accepted that only SSCs are able to colonize the niche and re-establish spermatogenesis in the recipient testis. Therefore, germ cell transplantation provides a functional approach to study the stem cell niche in the testis and to characterize putative spermatogonial stem cells. To date, germ cell transplantation is used to elucidate basic stem cell biology, to produce transgenic animals through genetic manipulation of germ cells prior to transplantation4,5, to study Sertoli cell-germ cell interaction6,7, SSC homing and colonization3,8, as well as SSC self-renewal and differentiation9,10.
Germ cell transplantation is also feasible in large species11. In these, the main applications are preservation of fertility, dissemination of elite genetics in animal populations, and generation of transgenic animals as the study of spermatogenesis and SSC biology with this technique is logistically more difficult and expensive than in rodents. Transplantation of germ cells from large species into the seminiferous tubules of mice results in colonization of donor cells and spermatogonial expansion, but not in their full differentiation presumably due to incompatibility of the recipient somatic cell compartment with the germ cells from phylogenetically distant species12. An alternative approach is transplantation of germ cells from large species together with their surrounding somatic compartment. We first reported in 2002, that small fragments of testis tissue from immature males transplanted under the dorsal skin of immunodeficient mice are able to survive and undergo full development with the production of fertilization competent sperm13. Since then testis tissue xenografting has been shown to be successful in many species and emerged as a valuable alternative to study testis development and spermatogenesis of large animals in mice14.

Protocols for germ cell transplantation and testis tissue xenografting are described. Germ cell transplantation results in donor-derived spermatogenesis in recipient testes and represents a functional reconstitution assay for identification of spermatogonial stem cells (SSCs). Testis tissue xenografting reproduces testis development and spermatogenesis of various donor species in recipient mice.

배아 세포 이식 및 Testis 조직 마우스에 Xenografting

Germ cell transplantation was developed by Dr. Ralph Brinster and colleagues at the University of Pennsylvania in 19941,2. These ground-breaking studies ...

생물학

Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation

Mammalian spermatogenesis is a complex differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous tubules of the testes. Currently, there is no reliable cell culture system allowing for spermatogenic differentiation in vitro, and most biological studies of spermatogenic cells require tissue harvest from animal models like the mouse and rat. Because the testis contains numerous cell types - both non-spermatogenic (Leydig, Sertoli, myeloid, and epithelial cells) and spermatogenic (spermatogonia, spermatocytes, round spermatids, condensing spermatids and spermatozoa) - studies of the biological mechanisms involved in spermatogenesis require the isolation and enrichment of these different cell types. The STA-PUT method allows for the separation of a heterogeneous population of cells - in this case, from the testes - through a linear BSA gradient. Individual cell types sediment with different sedimentation velocity according to cell size, and fractions enriched for different cell types can be collected and utilized in further analyses. While the STA-PUT method does not result in highly pure fractions of cell types, e.g. as can be obtained with certain cell sorting methods, it does provide a much higher yield of total cells in each fraction (~1 x 108 cells/spermatogenic cell type from a starting population of 7-8 x 108 cells). This high yield method requires only specialized glassware and can be performed in any cold room or large refrigerator, making it an ideal method for labs that have limited access to specialized equipment like a fluorescence activated cell sorter (FACS) or elutriator.

The STA-PUT method allows for the separation of different populations of spermatogenic cells based on size and density.

STA-PUT 속도의 침전을 사용하여 정자 형성 세포 유형의 분리

Mammalian spermatogenesis is a complex  differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous  tubules of the testes. Currently, there ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

정자의 세포 학적 분석 : 라이브와 고정 준비<em&gt; 초파리</em&gt; 고환

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Spermatogenesis 마우스 모델을 사용 하 여의 Cytological 분석을 위한 Seminiferous 관 스쿼시 기술

요약

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단계 별 마우스 정자의 정렬을 유동 세포 계측법에 의해

후에 쥐에 있는 정액 액의 측정 및 여성 재생산 지역에서 정액 짝짓기의 컬렉션

표준 실험실 장비를 사용하여 마우스 고환에서 파키텐 정자 세포와 정자의 농축

Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses

마우스 라운드 Spermatid 주입

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