Diese Publikation wurde gefördert durch die Europäische Union Horizont 2020 Forschung und Innovation Programm unter der Marie Sklodowska-Curie Finanzhilfevereinbarung keine 642893 (IMPRESS), das Amt Kosten (COST Action FA 1205, AQUAGAMETE) und das Research Centre of Excellence- 1476-4/2016/FEKUT.

Alle Verfahren für die Arbeit mit Europäischen Aals beschrieben in diesem Protokoll wurden genehmigt durch den Ausschuss der Ethik der Tier Experimente an der Universitat Politècnica de València, nach den spanischen Gesetzen und Vorschriften kontrollieren die Experimente und Verfahren an lebenden Tieren.
1. Fisch-Wartung
<ol><li>Bringen Sie die Europäischen Aale in einer Forschungseinrichtung und steckte sie in ein 200 L-Aquarien mit einem Kreislaufsystem. Verwenden Sie Thermostate und Kühler, um eine Temperatur von konstant 20 ° C zu halten.</li>
	<li>Halten Sie den Fisch bei schlechten Lichtverhältnissen zu vermeiden Stress22 und nichts zu essen während des Experiments.</li>
	<li>Halten Sie die Fische im Süßwasser in den ersten 3 Tagen. Dann 1/3 des Wassers ändern und füllen Sie mit Meerwasser täglich bis zu einem Salzgehalt von 37,0 ± 0,3 g/L.</li>
</ol>2. hormonelle Behandlung
Hinweis: Die hormonelle Behandlung besteht aus wöchentlichen Injektionen von humanes Choriongonadotropin (hCG) während der gesamten Dauer des Experiments (9 Wochen).
<ol><li>Bereiten Sie das hCG Hormon im Voraus in einer Konzentration von 1 IU/µL durch verdünnen das Hormon in Kochsalzlösung (0,9 % NaCl). Hinweis: Das Hormon kann beibehalten werden verdünnt bei dieser Konzentration für über eine Woche bei-18 ° C.</li>
	<li>Um die Fische zu betäuben, bereiten Sie einen 40 L flexibler Eimer mit 5 L Wasser.<ol>
<li>Verdünnen Sie in einem 250 mL-Kolben 300 mg Benzocain in 100 mL 70 % igem Ethanol.</li>
		<li>Gießen Sie die verdünnte Benzocain in den Eimer (Endkonzentration 0,36 mM) und gut mischen. Dies ist für eine endgültige Benzocain Konzentration von 60 mg/L.</li>
		<li>Übertragen Sie die Fische einzeln, mit Benzocain ins Wasser und warten Sie einige Sekunden, bis die Benzocain wirkt und die Fische richtig betäubt. Hinweis: Um zu bestätigen, dass die Fische betäubt ist, legen Sie den Fisch in Rückenlage und überprüfen Sie, ob es noch in dieser Position bleibt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwalten das Hormon, wiegen die Fische und das hCG Hormon in einer Dosis von 1,5 IU/g Fisch in 1,5 mL Kunststoffhülse vorbereiten.<ol>
<li>Füllen Sie eine 1 mL Spritze mit dem hCG-Hormon aus dem Kunststoffrohr.</li>
		<li>Legen Sie den betäubten Fisch in Rückenlage und mit der Hilfe oder der Spritze, injizieren Sie das Hormon sorgfältig im Bereich intraperitoneal zu.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die Aquarien die Fische wieder und überwachen sie bis vollständig erholt. Hinweis: Die hormonelle Verwaltung muss wöchentlich in das Experiment durchgeführt werden. Normalerweise beginnen die Europäischen Aale Spermating nach 6-7 Wochen hormonelle Behandlung.</li>
</ol>(3) Spermien Sampling
<ol><li>Um die beste Qualitätsproben zu erhalten, extrahieren Sie Sperma 24 h nach der hormonellen Verwaltung6,23.</li>
	<li>Den Fisch mit Benzocain zu betäuben, wie unter Punkt 2.2 beschrieben.</li>
	<li>Legen Sie den betäubten Fisch in Rückenlage, reinigen Sie den Genitalbereich mit einem Spritzer von destilliertem Wasser und trocknen mit Papier, Kot Kontamination in den Genitalbereich oder versehentliche Sperma Aktivierung durch Kontakt mit Meerwasser aus dem Aquarien zu vermeiden.</li>
	<li>Platzieren die Finger auf beide Seiten des Fisches, massieren Sie vorsichtig drücken seitlich aus der Brustflossen im Genitalbereich, das Sperma heraus zu zwingen.<ol>
<li>Wiederholen Sie die Massage, bis keine mehr Sperma aus der Geschlechtsöffnung kommt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sammeln Sie das Sperma in 15 mL-Kunststoff-Rohre mit Hilfe einer Vakuumpumpe.</li>
	<li>Verdünnen Sie die extrahierten Sperma 01:10 in veränderter Tanaka´s Extender Lösung24 (137 mM NaCl, 76,2 mM Nahco33, in destilliertem Wasser) bei 4 ° c. Hinweis: Das Sperma in die Extender-Lösung bei 4 ° c aufzubewahren.</li>
</ol>(4) Bewertung der Qualität der Spermien
<ol><li>Bereiten Sie künstliche Meerwasser13 (in mM: NaCl 354.7, MgCl2 52,4, CaCl2 9,9, Na2SO4 28,2, KCl 9.4, in destilliertem Wasser) mit 2 % Rinderserumalbumin (BSA) (W:v), pH-Wert, 8.2, Osmolalität auf 1100 mOsm/kg einstellen und pflegen es bei 4 ° c, um bakterielles Wachstum zu vermeiden.</li>
	<li>Öffnen Sie die Software für computergestützte Spermiogramm (CASA), und wählen Sie das Fisch-Sperma-Modul.<ol>
<li>Klicken Sie auf Eigenschaften , um das System-Setup der Software zu öffnen. Dort legen Sie die Capture-Optionen mit 60 Bildern pro Sekunde. Wählen Sie negative Phase Optik, Makler-Kammer und 10 X-Skalierung.</li>
		<li>Wählen Sie dann auf die Analysewerte Fisch als Spezies und Partikel Bereich größer als 2 µm2 und kleiner als 20 µm2.</li>
		<li>Auf die Parameter Geschwindigkeit festgelegt zu langsam , wenn Zellen bewegen sich zwischen 10 und 45 µm/s, auf Mittel , beim Wechsel zwischen 45 und 100 µm/s festgelegt und setzen Sie auf schnelle wenn schneller als 100 µm/s bewegen. Hinweis: Spermien mit Geschwindigkeit langsamer als 10 µm/s unbewegten galten.</li>
		<li>Wählen Sie die progressive Werte als 80 % der Geradheit (STR) und speichern Sie die Eigenschaften.</li>
		<li>Klicken Sie auf Feld zu erfassen (öffnet ein Fenster mit der live-Bilder von der Kamera werden). Hinweis: Das EDV-gestützte Sperma-Analyse-System wird durch ein Mikroskop, eine Kamera und eine Bildanalyse-Software gebildet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Auf der Zählkammer 4 µL von künstlichem Meerwasser und fügen Sie 0,5 µL Lösung Spermien (Spermien mit Extender-Lösung verdünnt hinzu).<ol>
<li>Konzentrieren Sie das Bild mit der Lupe bei 10facher Vergrößerung in der negativen Phase. 15 s nach der Aktivierung, klicken Sie auf erfassen - Video in das EDV-gestützte Sperma-Analyse-Software.</li>
		<li>Analysieren Sie jede Probe in dreifacher Ausfertigung und wählen Sie Proben mit einem Motilität höher als 70 % für die Kryokonservierung. Hinweis: Es ist sehr wichtig, nur qualitativ hochwertige Spermien für den Erfolg dieses Protokolls Kryokonservierung auszuwählen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(5) Sperma Einfrieren Methode
<ol><li>Bereiten Sie vorab Flüssigstickstoff (ca. 2,5 L) in ein 34 x 34 cm x 30 cm und 5 cm dicken Styropor-Box. Hinweis: Aufrechterhaltung eines flüssigen Stickstoff von 4-5 cm Höhe zu allen Zeiten.<ol>
<li>Bauen Sie eine schwebende Struktur, um die Spermien vorher einfrieren. Verwenden Sie 2 Stück Styropor (20 x 5 cm) zu, mit 2 Kunststoff-Rohre zu binden Sie und legen Sie die Struktur auf dem flüssigen Stickstoff. Diese Struktur muss über den flüssigen Stickstoff in einer ungefähren Höhe von 3 cm über der Oberfläche (Abbildung 1) schweben.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56835/56835fig1.jpg"> Abbildung 1 . Schematische Zeichnung der schwimmenden Struktur zum vorab Einfrieren in flüssigem Stickstoff. Die Struktur besteht aus zwei Stücken mit geringer Dichte Styropor 20 cm x 4 cm x 5 cm verbunden mit Kunststoff-Rohre von 14 cm. Die Halme sind über die Kunststoffrohre 3 cm über dem flüssigen Stickstoff gelegt. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56835/56835fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<ol start="2"><li>Bereiten Sie die Kryokonservierung Lösung durch Mischen von Spermien, Extender-Lösung und Methanol im Verhältnis 1:8:1 in 1,5 mL Kunststoff Rohre und vorsichtig umrühren.</li>
	<li>Mit Hilfe einer Pipette 480 µL der Kryokonservierung Lösung in 500 µL Strohhalme hinzufügen und bei Bedarf durch die Schließung ein Ende mit Modelliermasse markieren.</li>
	<li>Setzen Sie das Stroh auf dem schwimmenden Gerät in einer Höhe von 3 cm über dem flüssigen Stickstoff für 3 min. Dann setzen Sie das Stroh in den flüssigen Stickstoff.</li>
	<li>Übertragen Sie nach 10-15 min die Strohhalme in einen flüssigen Stickstoff Vorratstank mit lange Pinzette und halten sie jederzeit in flüssigen Stickstoff getaucht. Hier können die Spermien auf unbestimmte Zeit gespeichert werden.</li>
</ol>(6) Auftauen Methode
<ol><li>Vorbereiten einer Styropor-Box mit flüssigem Stickstoff, wie im Schritt 5.1 beschrieben, und bereiten ein Wasserbad mit ein 3 L Becherglas mit Leitungswasser bei 40 º c.</li>
	<li>Übertragen Sie die Strohhalme mit gefrorenen Spermien aus dem Speichertank in Styropor-Box mit flüssigem Stickstoff mit lange Pinzette.<ol>
<li>Setzen Sie jeden Strohhalm in einem Wasserbad bei 40 º c für 13 s.</li>
		<li>Gießen Sie das Sperma in ein Kunststoffrohr 1,5 mL durch die geschlossenen Enden des Strohs mit einer Schere schneiden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analysieren Sie Samenzellenmotilität mit computergestützten Sperma-Analyse-System, wie im Schritt 4.1 erläutert.</li>
	<li>Halten Sie 100 µL der Spermien, die Lebensfähigkeit der Spermien mit einem Durchflusszytometer zu analysieren.</li>
</ol>7. die Durchflusszytometrie
<ol><li>Verwenden Sie eine fluoreszierende Kit mit Propidium Jodid (PI), das ist eine rote fluoreszierende Substanz, die Flecken die Kerne von abgestorbenen Zellen und eine Membran-permeationsfähigen nuklearen fluoreszierende Verbindung, dass grüne Flecken die Kerne von lebenden Zellen.<ol>
<li>Bereiten Sie das grün fluoreszierende Färbelösung durch Verdünnung aus der Stammlösung (1 mM) 01:10 in Tanaka´s Medium, eine funktionierende Lösung von 100 µM.</li>
		<li>Verdünnen Sie die PI-Lösung nicht. Die Stammlösung liegt bei 2,4 mM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Für jede Probe nehmen 50 µL der frischen oder aufgetauten Spermien und fügen Sie 0,5 µL grün fluoreszierende arbeiten Färbelösung (Endkonzentration 1 µM) und 2 µL der PI-Lösung (Endkonzentration 100 µM).</li>
	<li>Inkubieren Sie die Proben, die die Farbstoffe (PI und grüne fluoreszierende Färbung) in der Dunkelheit für 5 min.<ol>
<li>Die Proben in 500 µL Tanaka´s Extender Lösung verdünnen und mit dem Durchflusszytometer analysiert.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Schalten Sie das Durchflusszytometer und erstellen Sie ein neues Protokoll mit mindestens 2 Grundstücke: SS melden Vs FS Log und FL1 Vs FL3. Hinweis: Beide, grüne fluoreszierende Färbung und Propidium Jodid mit Wellenlänge sichtbaren Lichts angeregt werden kann. Wenn Sie an DNA gebunden, die maximale Fluoreszenzemission dieser Farbstoffe sind 516 nm und 617 nm, beziehungsweise.<ol>
<li>Passen Sie die Spannungen der verschiedenen Laser: SS = 199; FS = 199; FL1 = 377; FL3 = 372</li>
		<li>Einrichten der Erwerb Einstellungen Accord auf maximale Ereignisse = 5000 oder 15 s (die Endkonzentration der Probe sollte etwa 1 Million Zellen/ml). Lesen Sie die Probe mit einem LOW -Flow.</li>
		<li>Wählen Sie den Lesemodus Single Tube Positions-Modus behoben.</li>
		<li>Legen Sie die Probe in die richtige Anzahl an das Karussell</li>
		<li>Lesen Sie die Probe (Drücken von F9) und speichern Sie die Daten in eine Excel-Datei (durch Drücken von F7) zur weiteren Analyse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>ICES_Working_Group_on_Eels. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Report of the 2011 Session of the Joint EIFAAC/ICES Working Group on Eels. , 246 (2011).</li><li>Moriarty, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+Catches+of+Elver+of+1928-1988.">European Catches of Elver of 1928-1988.</a> Int. Rev. Hydrobiol. 75 (6), 701-706 (1990).</li><li>Dekker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractal+geometry+of+the+European+eel+stock.">The fractal geometry of the European eel stock.</a> ICES J. Mar. Sci. 57 (1), 109-121 (2000).</li><li>Jacoby, D., Gollock, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anguilla anguilla. The IUCN red list of threatened species. Version 2014.2. , (2014).</li><li>Asturiano, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+hCG+as+spermiation+inducer+on+European+eel+semen+quality.">Effects of hCG as spermiation inducer on European eel semen quality.</a> Theriogenology. 66 (4), 1012-1020 (2006).</li><li>P&#233;rez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+maturation+and+spermiation+in+the+male+European+eel:+assessment+of+sperm+quality+throughout+treatment.">Induction of maturation and spermiation in the male European eel: assessment of sperm quality throughout treatment.</a> J. Fish Biol. 57 (6), 1488-1504 (2000).</li><li>Gallego, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+the+effects+of+thermal+regime+and+alternative+hormonal+treatments+on+the+reproductive+performance+of+European+eel+males+(Anguilla+anguilla)+during+induced+sexual+maturation.">Study of the effects of thermal regime and alternative hormonal treatments on the reproductive performance of European eel males (Anguilla anguilla) during induced sexual maturation.</a> Aquaculture. 354, 7-16 (2012).</li><li>Asturiano, J. F., S&#248;rensen, S. R., P&#233;rez, L., Lauesen, P., Tomkiewicz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+Production+of+Larvae+Using+Cryopreserved+Sperm:+Effects+of+Preservation+Temperature+and+Cryopreservation+on+European+Eel+Sperm+Fertilization+Capacity.">First Production of Larvae Using Cryopreserved Sperm: Effects of Preservation Temperature and Cryopreservation on European Eel Sperm Fertilization Capacity.</a> Reprod. Domestic Anim. 51 (4), 485-491 (2016).</li><li>Di Biase, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-treatment+with+androgens+during+artificial+induction+of+maturation+in+female+eel,+Anguilla+anguilla:+Effects+on+egg+production+and+early+development.">Co-treatment with androgens during artificial induction of maturation in female eel, Anguilla anguilla: Effects on egg production and early development.</a> Aquaculture. 479, 508-515 (2017).</li><li>Lokman, P., Wylie, M. J., Downes, M., Di Biase, A., Damsteegt, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+induction+of+maturation+in+female+silver+eels,+Anguilla+australis:+The+benefits+of+androgen+pre-treatment.">Artificial induction of maturation in female silver eels, Anguilla australis: The benefits of androgen pre-treatment.</a> Aquaculture. 437, 111-119 (2015).</li><li>Mylonas, C. C., Duncan, N. J., Asturiano, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+manipulations+for+the+enhancement+of+sperm+production+in+cultured+fish+and+evaluation+of+sperm+quality.">Hormonal manipulations for the enhancement of sperm production in cultured fish and evaluation of sperm quality.</a> Aquaculture. , (2016).</li><li>Ohta, H., Izawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diluent+for+cool+storage+of+the+Japanese+eel+(Anguilla+japonica)+spermatozoa.">Diluent for cool storage of the Japanese eel (Anguilla japonica) spermatozoa.</a> Aquaculture. 142 (1-2), 107-118 (1996).</li><li>Pe&#241;aranda, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+Eel+Sperm+Diluent+for+Short-term+Storage.">European Eel Sperm Diluent for Short-term Storage.</a> Reprod. Domestic Anim. 45 (3), 407-415 (2010).</li><li>Ohta, H., Kagawa, H., Tanaka, H., Unuma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+by+the+environmental+concentration+of+ions+of+the+potential+for+motility+in+Japanese+eel+spermatozoa.">Control by the environmental concentration of ions of the potential for motility in Japanese eel spermatozoa.</a> Aquaculture. 198 (3), 339-351 (2001).</li><li>Asturiano, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Media+and+methods+for+the+cryopreservation+of+European+eel+(Anguilla+anguilla)+sperm.">Media and methods for the cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) sperm.</a> Fish Physiol. Biochem. 28 (1), 501-502 (2003).</li><li>Asturiano, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physio-chemical+characteristics+of+seminal+plasma+and+development+of+media+and+methods+for+the+cryopreservation+of+European+eel+sperm.">Physio-chemical characteristics of seminal plasma and development of media and methods for the cryopreservation of European eel sperm.</a> Fish Physiol. Biochem. 30 (3), 283-293 (2004).</li><li>Szab&#243;, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+European+eel+(Anguilla+anguilla)+sperm+using+different+extenders+and+cryoprotectants.">Cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) sperm using different extenders and cryoprotectants.</a> Acta. Biol. Hung. 56 (1-2), 173-175 (2005).</li><li>M&#252;ller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+sperm+of+farmed+European+eel+Anguilla+anguilla.">Cryopreservation of sperm of farmed European eel Anguilla anguilla.</a> J World Aquac Soc. 35 (2), 225-231 (2004).</li><li>Pe&#241;aranda, D. S., P&#233;rez, L., Gallego, V., Jover, M., Asturiano, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+European+eel+sperm+cryopreservation+method+by+preventing+spermatozoa+movement+activation+caused+by+cryoprotectants.">Improvement of European eel sperm cryopreservation method by preventing spermatozoa movement activation caused by cryoprotectants.</a> Cryobiology. 59 (2), 119-126 (2009).</li><li>Marco-Jim&#233;nez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+European+eel+(Anguilla+anguilla)+spermatozoa:+effect+of+dilution+ratio,+foetal+bovine+serum+supplementation,+and+cryoprotectants.">Cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) spermatozoa: effect of dilution ratio, foetal bovine serum supplementation, and cryoprotectants.</a> Cryobiology. 53 (1), 51-57 (2006).</li><li>Asturiano, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+sperm+cryopreservation+on+the+European+eel+sperm+viability+and+spermatozoa+morphology.">Effect of sperm cryopreservation on the European eel sperm viability and spermatozoa morphology.</a> Reprod. Domestic Anim. 42 (2), 162-166 (2007).</li><li>Mordenti, M., Di Biase, A., Sirri, R., Modugno, S., Tasselli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Sexual+Maturation+in+Wild+Female+European+Eels+(Anguilla+anguilla)+in+Darkness+and+Light.">Induction of Sexual Maturation in Wild Female European Eels (Anguilla anguilla) in Darkness and Light.</a> Isr. J. Aquac. 64, (2012).</li><li>Ohta, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+induction+of+maturation+and+fertilization+in+the+Japanese+eel,+Anguilla+japonica.">Artificial induction of maturation and fertilization in the Japanese eel, Anguilla japonica.</a> Fish Physiol. Biochem. 17 (1), 163-169 (1997).</li><li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+cryopreservation+of+sperm+of+Japanese+eel.">Long-term cryopreservation of sperm of Japanese eel.</a> J. Fish Biol. 60 (1), 139-146 (2002).</li><li>Gallego, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subpopulation+pattern+of+eel+spermatozoa+is+affected+by+post-activation+time,+hormonal+treatment+and+the+thermal+regimen.">Subpopulation pattern of eel spermatozoa is affected by post-activation time, hormonal treatment and the thermal regimen.</a> Reprod. Fertil. Dev. 27 (3), 529-543 (2015).</li><li>Asturiano, J. F., Cabrita, E., Horv&#225;th, &. #. 1. 9. 3. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress,+challenges+and+perspectives+on+fish+gamete+cryopreservation:+A+mini-review.">Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review.</a> Gen. Comp. Endocrinol. , (2016).</li><li>Kime, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer-assisted+sperm+analysis+(CASA)+as+a+tool+for+monitoring+sperm+quality+in+fish.">Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish.</a> Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 130 (4), 425-433 (2001).</li><li>Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+measurement+of+sperm+motility+and+factors+affecting+sperm+quality+in+cultured+fish.">The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish.</a> Aquaculture. 234 (1-4), 1-28 (2004).</li><li>Verstegen, J., Iguer-Ouada, M., Onclin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+assisted+semen+analyzers+in+andrology+research+and+veterinary+practice.">Computer assisted semen analyzers in andrology research and veterinary practice.</a> Theriogenology. 57 (1), 149-179 (2002).</li><li>Magnotti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+and+vitrification+of+fish+semen:+a+review+with+special+emphasis+on+marine+species.">Cryopreservation and vitrification of fish semen: a review with special emphasis on marine species.</a> Rev. Aquacult. , (2016).</li><li>Dziewulska, K., Rzemieniecki, A., Czerniawski, R., Domaga&#322;a, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-thawed+motility+and+fertility+from+Atlantic+salmon+(Salmo+salar+L.)+sperm+frozen+with+four+cryodiluents+in+straws+or+pellets.">Post-thawed motility and fertility from Atlantic salmon (Salmo salar L.) sperm frozen with four cryodiluents in straws or pellets.</a> Theriogenology. 76 (2), 300-311 (2011).</li><li>Babiak, I., Bolla, S., Ottesen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suitable+methods+for+cryopreservation+of+semen+from+Atlantic+halibut,+Hippoglossus+hippoglossus+L.">Suitable methods for cryopreservation of semen from Atlantic halibut, Hippoglossus hippoglossus L.</a> Aquac. Int. 16 (6), 561-572 (2008).</li><li>M&#252;ller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Japanese+eel+(Anguilla+japonica+Temminck+&amp;+Schlegel,+1846)+propagation+using+cryopreserved+sperm+samples.">Japanese eel (Anguilla japonica Temminck &amp; Schlegel, 1846) propagation using cryopreserved sperm samples.</a> J. Appl. Ichthyol. 33 (3), 550-552 (2017).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Dieses Protokoll beschreibt den gesamten Prozess für die Europäischen Aals Reifung, Handhabung und Sperma Kryokonservierung. Die hier beschriebenen Haltungsbedingungen sind optimal für schnelle Reifung und Produktion von großen Mengen von qualitativ hochwertigen Spermien in dieser Spezies 6,7,25. Der Erfolg dieses Protokolls Kryokonservierung und seine mögliche Verwendung für die Befruchtung nach dem Auftauen hängen stark...

In den letzten 25 Jahren haben die Anzahl der europäische Aal (Anguilla Anguilla) an der europäischen Küste ankommen um 90 % 1,2,3stetig abgenommen. Es gibt mehrere Faktoren, die diese drastischen einschließlich Infektionen, Verschmutzung, Überfischung und Zerstörung von Lebensräumen zu erklären. All dies hatte einen profunden Effekt auf dieser Art, führt die Einbeziehung des Europäischen Aals auf der International Union for Conservation of Nature (IUCN) Liste als kritisch gefährdet 4. Die Entwicklung der Techniken und Protokolle für die Fortpflanzung in Gefangenschaft sind daher notwendig.
Die Reifung des Europäischen Aals in Gefangenschaft wird durch hormonelle Behandlung 5,6,7 erreicht, aber die Produktion von Gameten bei beiden Geschlechtern ist schwierig, 8synchronisieren. Obwohl die Entwicklung neuer Androgen Implantate zeigt Oogenese in Aalen 9,zu beschleunigen ist10, das Timing der endgültige Reifung bei Frauen immer noch höchst variabel und schwierig zu steuern, 11. Daher sind kurzfristiger Lagerung von Samenzellen 12,13,14 und Kryokonservierung Techniken für Reproduktionsmanagement machen Gamete Synchronisation unnötige 8notwendig.
Kryokonservierung von Spermien des Europäischen Aals wurde seit 2003 15,16entwickelt. Mehrere Forscher entwickelt erfolgreiche Protokolle mit Dimethyl Sulfoxid (DMSO) oder Methanol als Kryoprotektanten 16,17,18,19,20. Obwohl beide Protokolle erfolgreich im Einsatz sind, ist die erhaltene Zellviabilität aufgetauten Spermien kryokonserviert mit DMSO geringer als bei Methanol 20,21. Darüber hinaus Aal Sperma wird bei Kontakt mit DMSO aktiviert und erfordert mehr mühsam Sperma Manipulation 19, Methanol ist daher ein geeigneter Kryoprotektivum für europäische Aal Spermien als DMSO.
Hier wird das Protokoll für optimales Handling und hormonelle Behandlung des Europäischen Aals beschrieben werden. Darüber hinaus werden auch die besten Europäischen Aals Sperma Kryokonservierung Protokoll unter Verwendung von Methanol als einem Kryoprotektivum und ein Protokoll für die Beurteilung der Qualität der Spermien in dieser Spezies beschrieben.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="538">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:151px;">AQUACEN BENZOCA&#205;NA +D2A2:D24</td>
			<td style="width:128px;">AQUACEN</td>
			<td style="width:119px;">3394ESP</td>
			<td style="width:141px;">Benzocaine</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NaCl</td>
			<td>Avantor&#160;</td>
			<td>3624-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Syringe</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>305501</td>
			<td>Syringe 1 mL</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">FC500</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Air pump 100</td>
			<td>EHEIM</td>
			<td>4011708370032</td>
			<td>Modified for suction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Eppendorf 1.5</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>175508</td>
			<td>Plastic tubes 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Falcon tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>175747</td>
			<td>Plastic tubes 15 mL</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Flexible bucket</td>
			<td>Fiel</td>
			<td>1040101</td>
			<td>40 L, Black color.</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Ethanol</td>
			<td>Guinama SL</td>
			<td>Mg96270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cyopreservation straws&#160;</td>
			<td>IMV Technologies</td>
			<td>14550</td>
			<td>500 &#181;L straws</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Live/Dead Sperm Viability Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L7011</td>
			<td>Cytometer Kit</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Modelling clay</td>
			<td>JOVI</td>
			<td>Art 30</td>
			<td>4 different colors</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Precision scale PCB</td>
			<td>KERN &#38; Sohn GmbH</td>
			<td>PCB35002</td>
			<td>Digital scale</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Saline solution Vitulia 0.9%</td>
			<td>Laboratorios Ern, S.A.</td>
			<td>C.N. 999790.8</td>
			<td>Saline solution</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Forceps</td>
			<td>Levantina de Lab. SL</td>
			<td>3710025</td>
			<td>30 cm metal forceps</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Scissors</td>
			<td>Levantina de Lab. SL</td>
			<td>3700014</td>
			<td>Scissors 14cm</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Ovitrelle (r-hCG)</td>
			<td>Merck SL</td>
			<td>EMEA/H/C/000320</td>
			<td>Human chorionic gonadotropin</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Nikon Eclipse 80i</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">CaCl2</td>
			<td>Panreac Quimica SAU</td>
			<td>2112211210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Na2SO4</td>
			<td>Panreac Quimica SAU</td>
			<td>3257091611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NaHCO3</td>
			<td>Panreac Quimica SAU</td>
			<td>1416381210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">782M Camera</td>
			<td>Proiser</td>
			<td>782M</td>
			<td>Camera for CASA</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">ISAS v1</td>
			<td>Proiser</td>
			<td>ISAS v1</td>
			<td>CASA software</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">SpermTrack-10</td>
			<td>Proiser</td>
			<td>SpermTrack-10</td>
			<td>Countig chamber for CASA</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Beaker Pyrex 3L</td>
			<td>PYREX</td>
			<td>2110668</td>
			<td>Glass beaker 3L</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Flask Pyrex 250 GL-45</td>
			<td>PYREX</td>
			<td>21801365</td>
			<td>Glass flask 250 mL</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">KCl</td>
			<td>Scharlab SL</td>
			<td>PO02000500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Methanol</td>
			<td>Scharlab SL</td>
			<td>ME03061000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">MgCl2</td>
			<td>Scharlab SL</td>
			<td>MA00370500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>05482</td>
			<td>Bovine serum albumina</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Styrofoam box</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>34x34x30 cm and 5cm thick</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

handling and treatment of male european eels (anguilla anguilla) for hormonal maturation and sperm cryopreservation

In den letzten Jahren haben mehrere Forschungsgruppen an der Entwicklung und Verbesserung neuer Protokolle für den europäischen Aal Umgang und Reifung gearbeitet. Als der noch, erwiesen wöchentliche Injektionen von humanes Choriongonadotropin (hCG) sich Männchen nur 5-6 Wochen nach Behandlungsbeginn, produzieren große Mengen an qualitativ hochwertigen Spermien während mehrerer Wochen argumentativ. Darüber hinaus wurden Sperma Kryokonservierung Protokolle mit verschiedenen Extendern, Kryoprotektanten und Kühlung und Auftauen Mal zuvor für europäische Aal beschrieben. Hier zeigen wir, dass Tanaka´s Extender Lösung direkt verwendet werden kann, für die Befruchtung oder für die Kryokonservierung, wodurch erübrigt die Verwendung von verschiedenen Arten von Lösungen und Verdünnungen. Die Verwendung von Methanol als einem Kryoprotektivum macht dieses Protokoll darüber hinaus einfach zu bedienen wie Methanol hat eine geringe Toxizität und die Spermien nicht aktivieren. Das Sperma muss nicht sofort nach der Zugabe der Kryoprotektivum kryokonserviert werden, und es kann verwendet werden, lange nach aufgetaut werden. Darüber hinaus ist Beweglichkeit der Spermien nach dem Auftauen zwar geringer als die von frischem Sperma nach wie vor hoch. Das Ziel dieser Arbeit soll das verfügbare Protokoll für europäische Aal Handling, Reifung und Kryokonservierung von Spermien zeigen.

Sperma aus 18 Aale mit einer Beweglichkeit der Spermien von 70 % oder höher, wurde für diese Studie ausgewählt. Die Ergebnisse zeigten eine Reduktion alle Qualitätsparameter nach dem Auftauen im Vergleich zu denen von frischem Sperma (Tabelle 1 und Abb. 2). Die Ergebnisse der Motilität (bedeuten ± S.E.M, n = 18) zeigten eine höhere Summe Motilität und eine progressive Motilität in frisches Sperma als die totale Motilität und progres...

Watch this Scientific Journal Video about Handling and Treatment of Male European Eels Anguilla anguilla for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation at JoVE.com

Handling and Treatment of Male European Eels Anguilla anguilla for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation

Protokolle für die Europäischen Aals Reifung und Sperma Kryokonservierung wurden in den letzten Jahren verbessert. Dieser Artikel beschreibt die beste Protokoll über humanes Choriongonadotropin (hCG) zur Induktion Reifung und Methanol als Kryoprotektivum verfügbar.

Handhabung und Behandlung der männlichen europäischen Aal (Anguilla Anguilla) für die hormonelle Reifung und Kryokonservierung von Spermien

During the last years, several research groups have been working on the development and improvement of new protocols for the European eel handling and ...

Hi, my name is Juan Asturiano from the Polytechnic University of Valencia, and we are with some of our colleagues from the Szent Istv

handling-treatment-male-european-eels-anguilla-anguilla-for-hormonal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Handling and Treatment of Male European Eels (Anguilla anguilla) for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation

7.8K Aufrufe.  Universitat Politècnica de València. Hi, my name is Juan Asturiano from the Polytechnic University of Valencia, and we are with some of our colleagues from the Szent Istv

Serie: Handling and Treatment of Male European Eels Anguilla anguilla for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

Manipulation und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Ausbau der<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Eizellen, von Intrazytoplasmatische Spermieninjektion gefolgt, um embryonale Entwicklungsstudie

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Isolation and Cryopreservation of Neonatal Rat Cardiomyocytes

Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is difficult and time consuming. The most commonly used cells are neonatal rat cardiomyocytes (NRCMs), which require isolation every time cells are needed. The birth of the rats can be unpredictable. Cryopreservation is proposed to allow for cells to be stored until needed, yet freezing/thawing methods for primary cardiomyocytes are challenging due to the sensitivity of the cells. Using the proper cryoprotectant, dimethyl sulfoxide (DMSO), cryopreservation was achieved. By slowly extracting the DMSO while thawing the cells, cultures were obtained with viable NRCMs. NRCM phenotype was verified using immunocytochemistry staining for &#945;-sarcomeric actinin. In addition, cells also showed spontaneous contraction after several days in culture. Cell viability after thawing was acceptable at 40-60%. In spite of this, the methods outlined allow one to easily cryopreserve and thaw NRCMs. This gives researchers a greater amount of flexibility in planning experiments as well as reducing the use of animals.

The isolation of neonatal rat cardiomyocytes is a time consuming and unpredictable procedure. This study describes methods for cryopreservation and thawing of neonatal rat cardiomyocytes that allows for more efficient use of cells. The thawed NRCMs can be used for various experiments without the need for performing isolations each time.

Isolierung und Kryokonservierung von neonatalen Rattenkardiomyozyten

Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is ...

Modified MicroSecure Vitrification: A Safe, Simple and Highly Effective Cryopreservation Procedure for Human Blastocysts

Clinical embryo vitrification evolved with the development of unique vitrification devices in the 21st century and with the misconception that ultra-rapid cooling in an &#34;open&#34; system (i.e., direct LN2 contact) was a necessity to optimize vitrification success. The dogma surrounding the importance of cooling rates led to unsafe practices subject to technical variation and to the creation of vitrification devices that disregarded important quality-control factors (e.g., ease of use, repeatability, reliability, labeling security, and storage safety). Understanding the quality-control flaws of other devices allowed for the development of a safe, secure, repeatable, and reliable &#181;S-VTF method aimed to minimize intra- and inter-technician variation. Equally important, it combined the availability of two existing FDA-compliant devices: 1) a 0.3-mL ionomeric resin embryo straw with internalized, dual-colored, tamper-proof labeling with repeatable weld seal potential; and 2) shortened, commonly-used, 300-&#181;m ID sterile flexipettes to directly load the embryo(s) in order to create a highly-effective global vitrification device. Like other aseptic, closed vitrification systems (e.g., High Security Vitrification (HSV), Rapid-i, and VitriSafe) effectively used in reproductive medicine, microSecure Vitrification (&#181;S-VTF) has proven that it can achieve high post-warming survival and pregnancy outcomes with its attention to simplicity, and reduced technical variation. Although the 0.3-mL embryo straw containing an internal hydrophobic plug was commercially replaced with a standard semen straw possessing cotton-polyvinyl pyrrolidone (PVP) plugs, it maintained its ionomeric resin composition to ensure weld sealing. However, the cotton plugs can wick out the fluid-embryo contents of the flexipettes upon contact. A modified &#181;S-VTF method was adapted to include an additional internal weld seal before the plug on the device loading side. The added technical step to the &#181;S-VTF procedure has not affected its successful application, as high survival rates (&#62; 95%) and pregnancy rates continue today.

MicroSecure Vitrification was developed as a non-commercial, aseptic closed vitrification device system that is compliant with FDA good manufacturing and tissue-handling practices. Due to the withdrawal of hydrophobic plugged embryo straws from the industry, the vitrification procedure was modified to include an inner seal before the standard internal cotton plug.

Modifizierte MicroSecure Vitrifikation: Eine sichere, einfache und sehr effektive Kryokonservierung Verfahren für Human Blastozysten

Clinical embryo vitrification evolved with the development of unique vitrification devices in the 21st century and with the misconception that ultra-rapid ...

Maturation of Human Stem Cell-derived Cardiomyocytes in Biowires Using Electrical Stimulation

Human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) have been a promising cell source and have thus encouraged the investigation of their potential applications in cardiac research, including drug discovery, disease modeling, tissue engineering, and regenerative medicine. However, cells produced by existing protocols display a range of immaturity compared with native adult ventricular cardiomyocytes. Many efforts have been made to mature hPSC-CMs, with only moderate maturation attained thus far. Therefore, an engineered system, called biowire, has been devised by providing both physical and electrical cues to lead hPSC-CMs to a more mature state in vitro. The system uses a microfabricated platform to seed hPSC-CMs in collagen type I gel along a rigid template suture to assemble into aligned cardiac tissue (biowire), which is subjected to electrical field stimulation with a progressively increasing frequency. Compared to nonstimulated controls, stimulated biowired cardiomyocytes exhibit an enhanced degree of structural and electrophysiological maturation. Such changes are dependent upon the stimulation rate. This manuscript describes in detail the design and creation of biowires.

The cardiac biowire platform is an in vitro method used to mature human embryonic and induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CM) by combining three-dimensional cell cultivation with electrical stimulation. This manuscript presents the detailed setup of the cardiac biowire platform.

Reifung von humanen Stammzellen abgeleiteten Kardiomyozyten in Biowires Verwendung elektrischer Stimulation

Human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) have been a promising cell source and have thus encouraged the investigation of their ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. Currently, it allows the discrimination of up to 9 murine germ cell populations with high yield and purity. This high-resolution in discrimination and purification is possible due to unique changes in chromatin structure and quantity throughout spermatogenesis. These patterns can be captured by flow cytometry of male germ cells stained with fluorescent DNA-binding dyes such as Hoechst-33342 (Hoechst). Herein is a detailed description of a recently developed protocol to isolate mammalian testicular germ cells. Briefly, single cell suspensions are generated from testicular tissue by mechanical dissociation, double stained with Hoechst and propidium iodide (PI) and processed by flow cytometry. A serial gating strategy, including the selection of live cells (PI negative) with different DNA content (Hoechst intensity), is used during FACS sorting to discriminate up to 5 germ cell types. These include, with corresponding average purities (determined by microscopy evaluation): spermatogonia (66%), primary (71%) and secondary (85%) spermatocytes, and spermatids (90%), further separated into round (93%) and elongating (87%) subpopulations. Execution of the entire workflow is straightforward, allows the isolation of 4 cell types simultaneously with the appropriate FACS machine, and can be performed in less than 2 h. As reduced processing time is crucial to preserve the physiology of ex vivo cells, this method is ideal for downstream high-throughput studies of male germ cell biology. Moreover, a standardized protocol for multispecies purification of mammalian germ cells eliminates methodological sources of variables and allows a single set of reagents to be used for different animal models.

This work describes the standardization of a method to obtain purified germ cell populations from testicular tissue of different mammalian species. It is a straightforward protocol that combines mechanical testis dissociation, staining with Hoechst-33342 and propidium iodide, and FACS sorting, with wide applications in comparative studies of male reproductive biology.

Ein standardisierter Ansatz für Multispezies Reinigung von männlichen männlichen Keimzellen durch mechanische Gewebedissoziation und Durchflusszytometrie

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a hallmark of various pathophysiological conditions including tumor suppression, tissue remodeling and aging. The inducers of cellular senescence in vivo are still poorly characterized. However, a number of stimuli can be used to promote cellular senescence ex vivo. Among them, most common senescence-inducers are replicative exhaustion, ionizing and non-ionizing radiation, genotoxic drugs, oxidative stress, and demethylating and acetylating agents. Here, we will provide detailed instructions on how to use these stimuli to induce fibroblasts into senescence. This protocol can easily be adapted for different types of primary cells and cell lines, including cancer cells. We also describe different methods for the validation of senescence induction. In particular, we focus on measuring the activity of the lysosomal enzyme Senescence-Associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-gal), the rate of DNA synthesis using 5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine (EdU) incorporation assay, the levels of expression of the cell cycle inhibitors p16 and p21, and the expression and secretion of members of the Senescence-Associated Secretory Phenotype (SASP). Finally, we provide example results and discuss further applications of these protocols.

Here, we discuss a series of protocols for induction and validation of cellular senescence in cultured cells. We focus on different senescence-inducing stimuli and describe the quantification of common senescence-associated markers. We provide technical details using fibroblasts as a model, but the protocols can be adapted to various cellular models.

Induktion und Validierung der zellulären Seneszenz in primären humanen Zellen

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

Fluorimetric Techniques for the Assessment of Sperm Membranes

Standard spermiograms describing sperm quality are mostly based on the physiological and visual parameters, such as ejaculate volume and concentration, motility and progressive motility, and sperm morphology and viability. However, none of these assessments is good enough to predict the semen quality. Given that maintenance of sperm viability and fertilization potential depends on membrane integrity and intracellular functionality, evaluation of these parameters might enable a better prediction of sperm fertilization competence. Here, we describe three feasible methods to evaluate sperm quality using specific fluorescent probes combined with fluorescence microscopy or flow cytometry analyses. Analyses assessed plasma membrane integrity using 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and propidium iodide (PI), acrosomal membrane integrity using fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin (FITC-PSA) and mitochondrial membrane integrity using 5,5&#39;,6,6&#39;-tetra-chloro-1,1&#39;,3,3&#39;-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide (JC-1). Combinations of these methods are also presented. For instance, use of annexin V combined with PI fluorochromes enables assessing apoptosis and calculating the proportion of apoptotic sperm (apoptotic index). We believe that these methodologies, which are based on examining spermatozoon membranes, are very useful for the evaluation of sperm quality.

Here, we present methodologies to evaluate spermatozoan membrane integrity, a cellular feature associated with sperm fertilization competence. We describe three techniques for the fluorimetric assessment of sperm membranes: simultaneous staining with specific fluorescent probes, fluorescence microscopy, and advanced sperm-dedicated flow cytometry. Examples of combining the methodologies are also presented.

Fluorimetrischen Techniken für die Beurteilung der Spermien Membranen

Standard spermiograms describing sperm quality are mostly based on the physiological and visual parameters, such as ejaculate volume and concentration, ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female reproductive tract. While in vitro studies suggest that sperm of internally fertilizing animals can respond to various cues from their surroundings, the inability to visualize their behavior inside the female reproductive tract creates a challenge for understanding sperm migration and mobility in its native environment. Here, we describe a method using C. elegans that overcomes this limitation and takes advantage of their transparent epidermis. C. elegans males stained with a mitochondrial&#160; dye are mated with adult hermaphrodites, which act as modified females, and deposit fluorescently labeled sperm into the hermaphrodite uterus. The migration and motility of the labeled sperm can then be directly tracked using an epi-fluorescence microscope in a live hermaphrodite. In wild-type animals, approximately 90% of the labeled sperm crawl through the uterus and reach the fertilization site, or spermatheca. Images of the uterus can be taken 1 h after mating to assess the distribution of the sperm within the uterus and the percentage of sperm that have reached the spermatheca. Alternatively, time-lapse images can be taken immediately after mating to assess sperm speed, directional velocity and reversal frequency. This method can be combined with other genetic and molecular tools available for the C.elegans to identify novel genetic and molecular mechanisms that are important in regulating sperm guidance and motility within the female reproductive tract.

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Sperm must successfully navigate through the oviduct to fertilize an oocyte. Here, we describe an assay for measuring sperm migration within the C. elegans hermaphrodite uterus. This assay can provide quantitative data on sperm distribution within the uterus after mating, as well as on speed, directional velocity, and reversal frequency.

Messung der Spermienführung und-beweglichkeit innerhalb der Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...

Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that take place in the cytoplasm in preparation for fertilization and acquisition of totipotency. During oocyte maturation, changes in gene expression depend exclusively on the translation and degradation of maternal messenger RNAs (mRNAs) rather than on transcription. Execution of the translational program, therefore, plays a key role in establishing oocyte developmental competence to sustain embryo development. This paper is part of a focus on defining the program of maternal mRNA translation that takes place during meiotic maturation and at the oocyte-to-zygote transition. In this method paper, a strategy is presented to study the regulation of translation of target mRNAs during in vitro oocyte maturation. Here, a Ypet reporter is fused to the 3&#39; untranslated region (UTR) of the gene of interest and then micro-injected into oocytes together with polyadenylated mRNA encoding for mCherry to control for injected volume. By using time-lapse microscopy to measure reporter accumulation, translation rates are calculated at different transitions during oocyte meiotic maturation. Here, the protocols for oocyte isolation and injection, time-lapse recording, and data analysis have been described, using the Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3&#39; UTR reporter as an example.

This protocol describes a reporter assay to study the regulation of mRNA translation in single oocytes during in vitro maturation.

Definition des Programms der mütterlichen mRNA-Translation während der In-vitro-Reifung mit einem Single Oocyte Reporter Assay

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that ...

Kombination von Bildgebung mit einem Stimulanzien-Verabreichungssystem zur Untersuchung lebender Mausspermien

Real-Time Imaging of Acrosomal Calcium Dynamics and Exocytosis in Live Mouse Sperm

Acrosome exocytosis (AE), in which the sperm&#39;s single exocytotic vesicle fuses with the plasma membrane, is a complex, calcium-dependent process essential for fertilization. However, our understanding of how calcium signaling regulates AE is still incomplete. In particular, the interplay between intra-acrosomal calcium dynamics and the intermediate steps leading to AE is not well-defined. Here, we describe a method that provides spatial and temporal insights into acrosomal calcium dynamics and their relationship to membrane fusion and subsequent exocytosis of the acrosome vesicle. The method utilizes a novel transgenic mouse expressing an Acrosome-targeted Sensor for Exocytosis (AcroSensE). The sensor combines a genetically encoded calcium indicator (GCaMP) fused with mCherry. This fusion protein was specifically designed to enable the concurrent observation of acrosomal calcium dynamics and membrane fusion events. Real-time monitoring of acrosomal calcium dynamics and AE in live AcroSensE sperm is achieved using a combination of high frame-rate imaging and a stimulant delivery system that can target single sperm. This protocol also provides several examples of basic methods to quantify and analyze the raw data. Because the AcroSensE model is genetically encoded, its scientific significance can be augmented by using readily available genetic tools, such as crossbreeding with other mouse genetic models or gene-editing (CRISPR) based methods. With this strategy, the roles of additional signaling pathways in sperm capacitation and fertilization can be resolved. In summary, the method described here provides a convenient and effective tool to study calcium dynamics in a specific subcellular compartment-the sperm acrosome-and how those dynamics regulate the intermediate steps leading to membrane fusion and acrosome exocytosis.

Autor im Rampenlicht: Eine Bildgebungstechnik für lebende Zellen zur Untersuchung der Kalziumsignalgebung und der Akrosom-Exozytose in Mausspermien 

The AcroSensE mouse model and live cell imaging methods described here provide a new approach to studying calcium dynamics in the subcellular compartment of the sperm acrosome and how they regulate intermediate steps leading to membrane fusion and acrosome exocytosis.

Echtzeit-Bildgebung der akrosomalen Kalziumdynamik und Exozytose in lebenden Mäusespermien

Acrosome exocytosis (AE), in which the sperm&#39;s single exocytotic vesicle fuses with the plasma membrane, is a complex, calcium-dependent process ...