Gamete Collection und In-Vitro-Fertilisation von Astyanax mexicanus

Astyanax mexicanus, auch bekannt als der blinde mexikanische Höhlenfisch, entwickelt sich zu einem Modellorganismus für eine Vielzahl von Forschungsfeldern in der biologischen Wissenschaft, insbesondere im Verständnis der Evolution adaptiver genetischer Merkmale. Diese Art besteht aus einer Fluss-Behausungs-Oberflächenmorphung und einer Höhlen-Wohnung Morph, die es uns erlaubt zu analysieren, wie zwei Populationen der gleichen Art im Laufe der Zeit auseinandergingen. Damit diese Forschung stattfinden kann, müssen wir jedoch in der Lage sein, gesunde, zeitgerechte Embryonen und hybride Outcrosses zu erhalten.

Während diese Art leicht gepflegt und im Labor gezüchtet wird, laichen die Fische hauptsächlich in den Nachtstunden, was es schwierig macht, frisch gelegte Embryonen tagsüber zu erhalten. In diesem Protokoll zeigen wir, wie wir durch die Akklimatisierung von Astyanax mexicanus an veränderte Lichtzyklen und Temperaturänderungen in der Lage sind, Brutzyklen auf eine bequemere Tageszeit zu verschieben. Als nächstes zeigen wir, wie man geeignete Elternfische identifiziert und Gameten von anästhesierten Männchen und Weibchen sammelt.

Schließlich zeigen wir, wie man lebensfähige Nachkommen mittels In-vitro-Fertilisation produziert und diskutieren Anzeichen einer erfolgreichen Befruchtung. Wir erwarten, dass dieses Protokoll es ermöglicht, Verfahren wie die Injektion genetischer Konstrukte und die Entwicklungsanalyse während der normalen Arbeitszeiten einfach durchzuführen. Darüber hinaus kann diese Technik nützlich sein, um hybride Outcrosses zwischen allen Höhlen- und Oberflächenpopulationen zu erstellen.

Richten Sie Fischtanks in einem undurchsichtigen, vollständig geschlossenen Durchfluss-Aquakultursystem ein, das mehrere Tanksreihen enthält. Halten Sie die Temperatur jedes Tanks mit einem unabhängigen Heizelement, das verwendet wird, um die Temperatur während des Grundierungsprozesses manuell zu ändern. Richten Sie einzelne Zeilen so ein, dass jeweils separate Fotoperioden aktiviert werden.

Installieren Sie Türen in jeder Reihe, die geschlossen werden können, um zu verhindern, dass Licht eindringt oder entweicht. Der automatisierte Controller kann die Manipulation aller Photoperioden mit der geringsten Störung des Fisches ermöglichen. Rüsten Sie das Rack mit einem roten Arbeitslicht und Verdunkelungsvorhängen für den Zugang während der dunklen Stunden.

Entfernen Sie die gewünschten Fische aus allgemeinen Systemregalen und legen Sie sie in Zuchtregalen, um die Photoperiode 14 Tage vor der Grundierung zu justieren. Dadurch können sich die Fische an eine neue Umgebung gewöhnen. Halten Sie die Fische in dieser Zeit mit der installierten Wasserheizung bei 22,8 Grad Celsius.

Die normale Fotoperiode beträgt sechs a.m. bis 8 p.m Licht und 8 p.m.

bis sechs a.m.dark. Für Lichtzyklus-Rack verschieben Sie die Photoperiode auf 10 p.m. auf 12 p.m.

licht, und 12 p.m. bis 10 p.m. dunkel, indem Sie den Timer einstellen, der das Licht im Rack antreibt.

Sobald die Fische akklimatisiert sind, beginnen Sie, die Tiere zum Laichen zu grundieren. Dies ist ein Verfahren, das insgesamt sechs Tage dauert. Ändern Sie in dieser Zeit die Temperatur, um die Eizellenproduktion mit einem installierten Wasserheizungssystem zu grundieren.

Am ersten Tag steigen die Temperaturen von 22,8 Grad Celsius auf 24,4 Grad Celsius. Am zweiten Tag steigen die Temperaturen von 24,4 Grad Celsius auf 26,1 Grad Celsius. An Tag drei und vier halten die Temperaturen bei 26,1 Grad Celsius.

Fische werden während des Tages laichen bereit sein und IVF kann durchgeführt werden. Am fünften Tag sinkt die Temperatur von 26,1 Grad Celsius auf 24,4 Grad Celsius. Am sechsten Tag sinkt die Temperatur von 24,4 Grad Celsius auf 22,8 Grad Celsius.

Stellen Sie eine Sieben-Tage-Lücke bereit, bevor Sie diesen Temperaturzyklus wiederholen. Wir empfehlen, die Fische weiterhin in dieser Fotoperiode zu halten, da dies die Gesamtzeit reduziert, die der Fisch benötigt, um sich an den verschobenen Lichtzyklus anzupassen. Beginnen Sie mit dem Einlegen eines befeuchteten Gewebes in einen Petrischalendeckel und schließen Sie die Schale, um eine befeuchtete Kammer zu schaffen und zu verhindern, dass die Eizellen während des Entnahmeprozesses austrocknen.

Als nächstes wählen Sie eine Frau für die Sammlung. Gravid-Fische mit großen hervorstehenden Bauch werden wahrscheinlich die beste Wahl für dieses Verfahren sein. Immobilisieren Sie ein Weibchen mit gekühltem Wasser und legen Sie es in supine Position in einem befeuchteten Schwamm Tierhalter.

Einmal positioniert blot die ventrale Seite des Fisches mit einem empfindlichen Gewebe wischen als Kontakt mit Wasser wird dazu führen, dass die Eizellen zu aktivieren. Halten Sie das Weibchen zwischen Daumen und Zeigefinger. Drücken Sie vorsichtig gegen die Seitenseiten der koelomischen Höhle in Richtung der Urogenitalöffnung, während Sie den Finger leicht rollen.

Sammeln Sie die ausgedrückten Eizellen mit einem Einweg-Spachtel. Diese auf die befeuchtete Petrischale übertragen. Mehrere Kupplungen von Eizellen können in der gleichen Schale kombiniert werden, wenn bestimmte Abstammungsdaten nicht benötigt werden.

Nach der Abholung kehren Sie die Fische vorsichtig in einen mit Systemwasser gefüllten Bergungstank zurück. Wählen Sie ein Männchen für die Sammlung. Es gibt keine äußerlich sichtbaren Anzeichen von männlicher Gamete-Qualität.

Jedoch, Fisch sollte gesund im Aussehen vor der Verwendung in diesem Verfahren erscheinen. Immobilisieren Sie ein Männchen mit gekühltem Wasser und legen Sie ihn in supine Position in einem befeuchteten Schwamm Tierhalter. Blot die ventrale Seite des Fisches mit einem empfindlichen Gewebe wischen als Kontakt mit Wasser wird die milt aktivieren.

Legen Sie das Ende eines Kapillarrohrs vorsichtig an der Urogenitalöffnung ab. Vertreiben Sie milt, indem Sie sanften Druck auf die Seiten der Fische mit Dem Daumen und Zeigefinger ausüben. Beginnen Sie distal zu den Kiemen, die sich in Richtung der urogenitalen Öffnung bewegen.

Sammeln Sie die Milt am Ende eines Kapillarrohrs. Eine schonende Absaugung kann durch verwendung eines Aspiratorrohres erforderlich sein. Vermeiden Sie Kot, der mit der Milt vertrieben werden kann.

Geben Sie die Milt in ein leeres 1,5-Milliliter-Zentrifugenrohr und verdünnen Sie mit dem doppelten Volumen des Spermien-Extenders E400. Auf Eis bleiben. Milt von mehreren Männern kann zusammen gepoolt werden, wenn bestimmte Abstammungsdaten nicht benötigt werden.

Dieser Schritt kann verwendet werden, um die Arbeitszeit der milt um mehrere Stunden zu verlängern, ist aber nicht für die sofortige Befruchtung erforderlich. Nach der Abholung kehren Sie die Fische vorsichtig in einen mit Systemwasser gefüllten Bergungstank zurück. Mit einer neuen Pipette für jeden Bestand mischen Sie das Sperma durch Pipettieren und/oder Agitieren der Seiten des Rohres vor der Befruchtung als Sperma und Milz und setzen Sie sich in E400 Lösung im Laufe der Zeit.

Geben Sie die milt oder erweiterte milt Lösung in die frisch gesammelten Eizellen. Fügen Sie schnell einen Milliliter Systemwasser in die Kupplung, um die Spermien und Eier für die Befruchtung zu aktivieren. Vermeiden Sie das Mischen oder Aufregen des Schaleninhalts und lassen Sie zwei Minuten für die Befruchtung.

Fügen Sie E2 Embryo-Medien, um die Schale 2/3 voll zu füllen. Je nach Nachbearbeitung können Embryonen entweder sofort für nachgelagerte Anwendungen verwendet werden oder sie können in E2-Embryomedien bei 23 Grad Celsius bis zu fünf Tagen nach der Befruchtung inkubiert werden. An dieser Stelle übertragen wir Embryonen mit Systemwasser in das Hauptumwälzgehäusesystem.

Die Hauptstärke dieser Methode ist die zuverlässige Produktion von Höhlen- und Oberflächenhybriden von Astyanax mexicanus. Herkömmliche Methoden der Hybridproduktion sind aufgrund des Verlusts des zirkadianen Rhythmus im Höhlenmorphotyp von Astyanax mexicanus sehr anspruchsvoll, was zu veränderten Laichzeiten dieser Fische führt. Für ein erfolgreiches IVF-Verfahren in Astyanax mexicanus ist die Qualität der gesammelten Eizellen von großer Bedeutung.

Gravid weibliche Fische mit großen hervorstehenden Bauch sind am ehesten lebensfähige Eizellen freizusetzen, die klar und sogar im Aussehen erscheinen. Das Hinzufügen der gesammelten Milz zu solchen Eizellen führt zur Entwicklung von befruchteten Embryonen in der Regel innerhalb von 20 bis 30 Minuten. Lebensfähige Embryonen werden etwas lichtdurchlässiger, bevor sie in die eine Zellphase des Entwicklungszyklus eintreten.

Unbefruchtete Eizellen erscheinen ungleichmäßiger und undurchsichtiger. Mit IVF, um Hybriden von Tenaja Höhlenfischen und Oberflächenfischen zu erzeugen, kann man eine breite Palette morphologischer Phänotypen untersuchen. Zum Beispiel haben Oberflächen-/Höhlenhybriden Augen, die darauf hinweisen, dass die Anwesenheit von Augen eine dominante Eigenschaft ist.

In Oberflächenhöhlen-F2-Hybriden erhalten wir jedoch eine breite Palette von Augengrößen, was darauf hinweist, dass es mehrere Loci gibt, die die Augengröße in Astyanax mexicanus steuern, was es zu einer quantitativen Eigenschaft macht. Ein weiteres Beispiel ist die Pigmentierung. Unter Beobachtung der F1-Hybride aus Oberflächen- und Höhlenfischen kann der Schluss gezogen werden, dass die Körperpigmentierung ein dominantes Merkmal ist, da die Fische vollständig pigmentiert sind.

In der F2-Generation deutet die Variation der Körperpigmentierung erneut auf ein quantitatives Merkmal hin. Die Kombination dieser phänotypischen Daten mit Sequenzierungsdaten kann die zugrunde liegenden genetischen Loci aufdecken, die für diese Phänotypen verantwortlich sind. In diesem Protokoll lernten wir, wie man die Brutzyklen von Astyanax mexicanus auf bequemere Stunden des Tages verschiebt und gesunde lebensfähige Embryonen mit In-vitro-Fertilisation erhält.

Neben der Arbeit mit Embryon im Frühstadium ermöglicht es auch die zukünftige Erforschung der Spermienkryokonservierung. Die Standardisierung dieser Technik stärkt Astyanax mexicanus als Modellsystem für frühe Entwicklungs- und Genstudien.