MG wird unterstützt durch Zuschüsse, K08DK101608 und R03DK111473 von den National Institutes of Health, März des Dimes Foundation Grant Nr. 5-FY17-79, die Kinder Discovery Institute of Washington University und St. Louis Children Hospital und dem Department of Pediatrics an der Washington University School of Medicine, St. Louis. CJL stützt sich auf R01DK104946 (PI: Silverman), die Kinder Discovery Institute of Washington University und St. Louis Children Hospital.

Alle tierische Verfahren in dieser Studie wurden von entweder der Washington University in St. Louis institutionelle Animal Care und Use Committee (Protokoll 20160187) oder institutionelle Tierbetreuung University of Pittsburgh und Use Committee (Protokoll 14103918) genehmigt. Menschlichen fetalen Dünndarm in weniger als 24 Wochen Schwangerschaft wurde im Einklang mit der University of Pittsburgh Leitlinien für die Auftragsvergabe des anatomischen Gewebe nach Institutional Review Board Genehmigung (Protokoll PRO14100537) von der University of erhalten. Pittsburgh Gesundheit Wissenschaften Gewebebank durch ein ehrlicher Makler-System. Anonymisierte Muttermilch oder pasteurisierte Spender Muttermilch wurde mit einem Verzicht auf der Zustimmung von der University of Pittsburgh Institutional Review Board erhalten.
(1) Krypta Isolation und Gründung der Enteroids von neugeborenen Mäusen oder vorzeitige menschlichen Dünndarm
<ol><li>Medien-Vorbereitung Hinweis: Medien sollten in der Haube am Vortag Krypta Isolierung vorbereitet werden.<ol>
<li>1,11 L Kulturmedien vorbereiten. Beginnen Sie mit 1 L Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) mit 4,5 g/L Glucose und L-Glutamin und 110 mL fetalen Bovine Serum (FBS) (Endkonzentration 10 %), 11 mL Penicillin-Streptomycin (Endkonzentration 1 %) und 1,1 mL sterile Insulin (final Konzentration von 0,1 %).</li>
		<li>500 mL PBS-Antibiotikum Mischung zubereiten. Beginnen Sie mit 500 mL 1 x Dulbeccos Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS) mit 10 % FBS und 5 mL Gentamicin (Endkonzentration 1 %), 1 mL Amphotericin B (Endkonzentration 0,2 %) und 5 mL Penicillin-Streptomycin (Endkonzentration 1 %).</li>
		<li>Bereiten Sie 30 mL Cell Disruption Medien #1. Bereiten Sie zuerst 30 mL Nährmedien. Fügen Sie 600 µL 0,5 M Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) (Endkonzentration 10 mM), 300 µL Gentamicin (Endkonzentration 1 %) und 60 µL Amphotericin B (Endkonzentration 0,2 %).</li>
		<li>Bereiten Sie 30 mL Cell Disruption Medien #2. Bereiten Sie zuerst 30 mL Nährmedien. Fügen Sie 300 µL 0,5 M EDTA (Endkonzentration 5 mM), 300 µL Gentamicin (Endkonzentration 1 %) und 60 µL Amphotericin B (Endkonzentration 0,2 %).</li>
		<li>Bereiten Sie 50 mL Krypta Kulturmedien ohne Wachstumsfaktoren. Messen von 33,4 mL 1 x erweiterte DMEM/F-12 und 10 mL FBS (Endkonzentration 20 %).<ol>
<li>Hinzufügen von 500 µL Penicillin-Streptomycin (Endkonzentration 1 %), 500 µL L-Glutamin (Endkonzentration 1 %), 500 µL Gentamicin (Endkonzentration 1 %), 100 µL Amphotericin B (Endkonzentration 0,2 %), 2,5 µL 1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane Sulfonsäure (HEPES) (Endkonzentration 0,05 mM), 500 µL 100 mM N-Acetylcystein (Endkonzentration 1 mM), 500 µL 100 x n-2-Beilage, 1 mL 50 x serumfreien Ergänzung (z.B.B-27) abzüglich Vitamin A und 500 µL 1 mM 100 x Y-27632.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bereiten Sie 1 mL Krypta Nährmedien mit Wachstumsfaktoren. Bereiten Sie zuerst 1 mL der Krypta Nährmedien ohne Wachstumsfaktoren. Fügen Sie 2,5 µL 40 µg/mL Wnt3a (Endkonzentration 100 ng/mL), 1 µL 100 µg/mL Birne (Endkonzentration 100 ng/mL), 2 µL 250 µg/mL R-Spondin (Endkonzentration 500 ng/mL) und 0,5 µL 100 µg/mL EGF (Endkonzentration 50 ng/mL).</li>
	</ol></li>
	<li>Krypta Isolierung
	<ol>
<li>Ort solubilisiert Basalmembran Extrakt (siehe Tabelle der Materialien) auf Eis Auftauen vor Beginn. Hinweis: Halten Sie Basalmembran auf Eis, oder es werden polymerisieren.</li>
		<li>In Übereinstimmung mit den institutionellen Animal Care und Use Committee Protokoll für Mäuse mehr als 14 Tage alt, einschläfern Mäuse mit zwei Methoden der Euthanasie mit der zweiten wird ein physischer Verfahren, um Tod zu gewährleisten. Hinweis: Für Mäuse unter 14 Tage alt, ist Enthauptung das Standardverfahren mit einer Schere.</li>
		<li>Mit Schere und Pinzette, machen Sie einen vertikalen Schnitt auf der Mittellinie des Bauches, durch die Haut und Bauchfell, über die gesamte Länge des Abdomens. Verbrauchsteuern im Dünndarm aus dem Magen, der Blinddarm mit Schere und das Mesenterium mit einer Pinzette entfernen. Hinweis: Zwei Wochen alten männliche und weibliche C57BL/6J Maus Welpen, je 5,5-7 g, dienten zur Krypta Isolierung. Jedem Alter oder Größe Maus kann zur Krypta Isolierung verwendet werden.</li>
		<li>Krypta Isolierung, Lage Darm gerade, frisch geernteten Dünndarm vorzubereiten und den Darm längs entlang seiner gesamten Länge mit einer Schere schneiden. Hinweis: Maus und menschlichen Darm können in ähnlicher Weise zubereitet werden.</li>
		<li>Saubere Hocker aus Darm durch sanft schütteln den Darm hin und her in einer PBS-Antibiotikum-Mischung gefüllt Petrischale mit Pinzette.</li>
		<li>Eine 50 mL konische Rohr 30 mL Cell Disruption Medien #1 hinzufügen. Geschnitten Sie der Darm in 0,5 cm Länge Stücke direkt in das Rohr. Legen Sie das Rohr in einem Eiskübel und sanft schütteln im Shaker mit niedrigster Geschwindigkeit für 15 min.</li>
		<li>Während das Gewebe auf den Shaker, erhalten Sie 24 oder 48-Well Platten um Krypten wachsen, wenn die Enteroids für RNA oder DNA-Protein isoliert verwendet werden. Einsatz 8-Well-Kammer Folien, Krypten zu wachsen, wenn die Enteroids für ganze verwendet werden montieren konfokale Bildgebung.</li>
		<li>Fügen Sie in der Haube 15 µL der Basalmembran am unteren Rand jedes gut von 24 oder 48-Well-Platte hinzu. Wenn Kammer Folien verwenden, fügen Sie unten jeder Kammer 9 µL der Basalmembran. Hinweis: Stellen Sie die Lautstärke der Basalmembran entsprechend der Größe der Platte bei Bedarf.</li>
		<li>Schnell die Basalmembran mit der Pipettenspitze so verteilt, dass die Basalmembran eine dünne Schicht auf der Unterseite des Brunnens bildet. Legen Sie die Platte bei 37 ° C im Brutschrank für 30 min an der Basalmembran zu polymerisieren zu ermöglichen. Hinweis: Wenn die Basalmembran keine dünne Schicht ist oder Basalmembran Luftblasen enthält die Krypten nicht befestigen.</li>
		<li>Nach 15 min auf einen Shaker filtern Sie das Gewebe durch ein 100 µm-Sieb. Die Durchströmung zu verwerfen.</li>
		<li>Eine neue 50 mL konische Rohr 30 mL Cell Disruption Media #2 hinzufügen. Gewebe aus Sieb entfernen und Hinzufügen der Röhre.</li>
		<li>Legen Sie das Rohr in einem Eiskübel und sanft schütteln im Shaker mit niedrigster Geschwindigkeit für 15 min.</li>
		<li>Nach 15 min auf den Shaker filtern Sie Gewebe durch ein 100 µm-Sieb. Halten Sie Durchströmung bei diesem Schritt für den Fall, dass Ertrag niedrig in späteren Schritten ist. Hinweis: Alle Strömung durch Rohre muss auf Eis gehalten werden.</li>
		<li>Hinzufügen einer neuen 50 mL konische Rohr 15 mL DMEM mit 4,5 g/L Glucose und L-Glutamin. Gewebe aus Sieb entfernen und Hinzufügen der Röhre. Kräftig schütteln Sie das Rohr von hand 10 S. Filter durch ein 100 µm-Sieb und sammeln Sie Durchströmung zu. Wiederholen Sie, bis der Durchfluss durch keine Partikel enthält.</li>
		<li>In der Haube filtern Sie die Durchströmung von vorherigen Schritt in ein neues 50 mL konische Röhrchen mit 70 µm Siebe für Maus Gewebe oder 100 µm Siebe für menschliches Gewebe. Hinweis: Haben Sie zusätzliche Siebe im Standby-Modus und gießen Sie langsam wie Siebe mit Ablagerungen verstopfen.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie das Rohr bei 200 X g für 8 min bei 4 ° C und Platz direkt in einen Eiskübel in der Kapuze. Entfernen Sie den Überstand durch Pipette ohne zu stören das Pellet. Aufschwemmen Sie Pellet mit gewünschten Gesamtbetrag der Krypta Nährmedien ohne Wachstumsfaktoren. Hinweis: Die angereicherten Krypten sind die "sandig" Schicht des Pelletofens. Jede erfordert gut 250 µL der Krypta Nährmedien ohne Wachstumsfaktoren.</li>
	</ol></li>
	<li>Einrichtung von enteroids
	<ol>
<li>Platte der Krypta Medien Mischung direkt auf der Basalmembran.</li>
		<li>Überprüfen Sie Krypten mit einem Mikroskop um sicherzustellen, dass die Isolierung Prozess erfolgreich war. Hinweis: Zellen und Kugeln der Zellen sind erwünscht. Ca. 100 einzelnen Krypten sind pro Bohrloch beschichtet.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C für 3 h Krypten zur Einhaltung der Basalmembran ermöglichen. Hinweis: Diese Inkubation ist mit Krypta Nährmedien ohne Wachstumsfaktoren.</li>
		<li>Abnehmen Sie die Medien und überschüssige Krypten, die konnte nicht angehängt werden mit einer Pipette P-200 langsam. Hinweis: Stören Sie die Basalmembran nicht, wie die beigefügten Krypten verdrängt werden können.</li>
		<li>Fügen Sie langsam 250 µL der Krypta Nährmedien mit Wachstumsfaktoren in jede Vertiefung. Hinweis: Für 24-48-Well Platten oder Kammer gleitet, 250 µL der Krypta Nährmedien mit Wachstumsfaktoren ist ausreichend.</li>
		<li>Ersetzen Sie die Medien alle 2 Tage mit frischem Krypta Nährmedien mit Wachstumsfaktoren für 5 Tage vor Behandlungen, um optimale Anhaftung und Wachstum zu ermöglichen.</li>
	</ol></li>
</ol>(2) Maus Brust Milch Kollektion
<ol><li>Ihre Welpen für 6 h vor dem Melken trennen Sie Naturfreibad C57BL/6J stillende postpartale 7-12 Tage.</li>
	<li>Betäuben Sie den stillenden Damm mit Isofluran über eine Nase Kegel zu und verwalten Sie eine subkutane Injektion von Oxytocin bei 0,15 IU/kg Körpergewicht. Warten Sie 3 Minuten vor dem Melken Verfahren.</li>
	<li>Sauger mit 70 % Ethanol vor dem Melken Verfahren reinigen und trocknen lassen.</li>
	<li>Extrahieren Sie Milch aus Zitzen ein zu einem Zeitpunkt mit einer menschlichen elektrische Milchpumpe mit Silikonschlauch in eine 5 mL-Sammelröhrchen Maus Zitzen angepasst. Hinweis: Optimale Milchpumpen haben zwei Einstellungen, eine für Geschwindigkeit und eine für die Absaugung. Es empfiehlt sich, mit den niedrigsten Einstellungen jedes starten und beide langsam erhöhen, bis die Milch gewonnen wird. Im Idealfall werden Gesamtausbeute ~ 500 µL - 1 mL der Maus Muttermilch pro stillende Mutter.</li>
	<li>Sofort aliquoten Muttermilch und Store bei-80 ° C. Hinweis: Vermeiden Sie Frost/Tau-Zyklen.</li>
	<li>Behandlung von Enteroids am 5. Tag mit 50 µL/mL Muttermilch Maus pro mL der Krypta Nährmedien mit Wachstumsfaktoren für 24 h bei 37 ° C.</li>
</ol>3. gesamte montieren Sie Färbung des Enteroids
<ol><li>
Vorbereitung der Reagenzien
	<ol>
<li>Bereiten Sie 16 mL 1 X PBS pro 8 Brunnen.</li>
		<li>1 X PBS pro 8 Brunnen 2 mL 4 % Paraformaldehyd (PFA) vorbereiten.</li>
		<li>Vorbereitung 2 mL 0,1 % Triton x-100 mit 1 X PBS-Puffer pro 8 Brunnen.</li>
		<li>Bereiten Sie 24 mL PBS-Tween (PBST ist 0,1 % Tween 20 in 1 X PBS) pro 8 Brunnen.</li>
		<li>Bereiten Sie 2 mL 10 % normale Esel Serum (NDS) in 0,1 % PBST (10 % NDS/PBST) pro 8 Brunnen.</li>
		<li>Bereiten Sie 4 mL 1 % NDS in 0,1 % PBST (1 % NDS/PBST) pro 8 Brunnen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Färbung von Tag 1
	<ol>
<li>Aspirieren von Behandlungen und Enteroids mit PBS waschen. Fügen Sie 250 µL 4 % PFA pro Bohrloch. Legen Sie auf Rotator für 1-2 h bei 4 ° C. Entfernen Sie die 4 % PFA mit Pipette.</li>
		<li>Waschen 4 Mal mit 250 µL/Well 1 x PBS. Setzen Sie auf Rotator für 10 min bei Raumtemperatur (RT). Hinweis: Es ist möglich, Platte für 1-2 Tage bei 4 ° C zu speichern, wenn nötig.</li>
		<li>Fügen Sie 250 µL/Well 0,1 % Triton x-100. Inkubation für 1 h bei RT. Entfernen Sie 0,1 % Triton x-100 mit Pipette.</li>
		<li>Waschen 4 Mal mit 250 µL/Well 1 x PBS. Legen Sie auf Rotator für 15 min bei RT</li>
		<li>Fügen Sie 250 µL/Well 10 % NDS/PBST. 45 min bei RT. Entfernen Sie inkubieren 10 % NDS/PBST mit Pipette.</li>
		<li>250 µL/Well Primärantikörper, verdünnt 1/250 in 1 % NDS/PBST hinzufügen und über Nacht bei 4 ° c inkubieren Hinweis: Die optimale Antikörper Verdünnung variiert je nach Hersteller.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Färbung von Tag 2
	<ol>
<li>Mindestens 5 Mal für 4-5 Std. mit 250 µL/Well PBST waschen. Setzen Sie auf Rotator bei 4 ° C zwischen jedem Waschgang.</li>
		<li>Fügen Sie 250 µL/Well Sekundärantikörper, verdünnt 1/1.000 in 1 % NDS/PBST. Die Platte in Folie wickeln und über Nacht bei 4 ° c inkubieren</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Färbung von Tag 3
	<ol>
<li>Fügen Sie 250 µL/Well nuklearen 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) für 15 min. Fleck. Hinweis: Halten Sie die Platte in der Dunkelheit.</li>
		<li>Waschen Sie 6 Mal mit 250 µL/Well PBST. Setzen Sie auf Rotator für 10 min bei 4 ° C zwischen jedem Waschgang.</li>
		<li>Mount Deckglas auf Kammer schieben mit Montage Medien.</li>
		<li>Nehmen Sie Bilder mit einem 40 X Objektiv confocal Mikroskop und ebenso Rendern in ein Raster-Grafik-Editor (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Patel, R. M., Denning, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+use+of+prebiotics,+probiotics,+and+postbiotics+to+prevent+necrotizing+enterocolitis:+what+is+the+current+evidence?.">Therapeutic use of prebiotics, probiotics, and postbiotics to prevent necrotizing enterocolitis: what is the current evidence?.</a> Clin Perinatol. 40 (1), 11-25 (2013).</li><li>Caplan, M. S., Jilling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+concepts+in+necrotizing+enterocolitis.">New concepts in necrotizing enterocolitis.</a> Curr Opin Pediatr. 13 (2), 111-115 (2001).</li><li>Henry, M. C., Moss, R. 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Die Autoren haben nichts preisgeben und frei von Interessenkonflikten.

Das Darmepithel besteht aus vielen zellulären Subtypen, die sind verantwortlich für die Bereitstellung von Host-Abwehr von Krankheitserregern, Darm Barriere Integrität, und in der Pathogenese verschiedener Krankheiten durchbrochen werden kann. Während Tiermodelle einige Facetten der Krankheit zusammenfassen können, bietet die ex-Vivo -Modell des Enteroids, abgeleitet aus dem Dünndarm von Mäusen und Menschen eine Plattform, um die Auswirkungen der verschiedenen Behandlungen zu testen. Die Bedeutung des Ent...

Nekrotisierende Enterokolitis ist (NEC) die führende Ursache des Todes von Magen-Darm-Erkrankung bei Frühgeborenen, die betreffen fast 1 in 10 Neugeborenen vor 29 Wochen Schwangerschaft1,2,3. Die Hälfte der Säuglinge mit NEC Fortschritte, die schwerste Form, wo überleben befindet sich nur 10-30 %4,5. In den Vereinigten Staaten einem geschätzten 2 Milliarden USD pro Jahr ausgegeben werden, Behandlung von Säuglingen mit NEC6,7, doch weder die Überlebensrate noch Therapie hat in den vergangenen 30 Jahren verändert. Die Pathogenese der NEC zeichnet sich durch intestinale Verletzungen und beeinträchtigt mukosalen Heilung8,9,10,11, jedoch die Signalwege führt zu einer verschärften entzündliche Reaktion und Mechanismen, die Entzündung umzukehren bleiben unvollständig verstanden.
Die Verwaltung der menschlichen Muttermilch hat sich herausgestellt, die nur Schutzstrategie gegen NEC für Frühgeborene zu sein. Wir haben bereits gezeigt, dass Muttermilch gegen NEC Entwicklung durch Hemmung des angeborenen Immunsystems Rezeptor Abgabe-wie Rezeptors 4 (TLR4) in das Darmepithel über den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR schützt) Signalisierung Weg11. Ergänzung der Muttermilch auf eine experimentelle NEC Formel gedämpft, die entzündliche Reaktion in NEC wie durch Hemmung der Enterozyten Apoptose und Wiederherstellung der Enterozyten Verbreitung in einer Weise, die abhängig von epidermalen Wachstum war, gesehen Factor (EGF) und EGFR-11. In einer weiteren Studie konnte gezeigt werden, dass Nitrat, ein weiterer Bestandteil der Muttermilch, trägt zu seiner schützenden Natur durch Modulation der intestinalen Perfusion, im Vergleich zu Säuglingsnahrung, die Nitrat fehlt und kann dazu beitragen, die erhöhte Häufigkeit von NEC in Formel gefüttert Kleinkinder12,13. Andere Verbindungen, die in der Muttermilch, die nachweislich in den Schutz gegen NEC einbezogen sind Muttermilch-Oligosaccharide, L-Arginin, Glutamin und Lactoferrin14,15,16, 17,18,19. Diese positiven Elemente der Muttermilch zeigen die Notwendigkeit, seine Verwendung in der Prävention von NEC, aber auch betonen, wie wichtig es ist, die Mechanismen, Signalisierung, Wege und zelluläre Effekte wie Muttermilch ist den Schutz gegen NEC Vermittlung beteiligt .
In Ordnung, weiter zu studieren die Schutzeigenschaften der Muttermilch in einem Mausmodell der NEC, entwickelten wir eine neuartige, einfach zu bedienende-Technik durch die Maus Muttermilch aus einem narkotisierten Damm mit einer elektrischen Muttermilch Pumpe11,12 extrahiert werden können . Diese Strategie des Erwerbs von Maus-Muttermilch ist vorteilhaft, nicht nur weil Muttermilch Pumpen leicht zugänglich und effizient bei der Beschaffung von Muttermilch, sondern auch weil diese Methode ermöglicht eine artspezifische Brust Milch Analysen. Infolgedessen, wir können die Auswirkungen der Maus Muttermilch mit denen des menschlichen abgepumpte Milch vergleichen sowie pasteurisiert menschlichen Spender Milch von einer Milch-Bank in artspezifische Modelle. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung der Brust Milchkomponenten in Bezug auf ihren Beitrag zur Prävention von NEC. Andere Forscher haben Brust Milch Extraktionsverfahren entwickelt, aber diese Techniken sind manuell und erfordert in der Regel mehr als ein Labor Mitglied20,21,22. Hier ist eine einfache Technik, die genutzt werden kann, indem Sie ändern eine menschliche elektrische Milchpumpe um Milch von einer Maus zu sammeln vorgestellt. Diese Technik kann auch auf andere Arten angewendet werden.
Um die Signalwege mit NEC angemessen zu verhören, sind Modellsysteme erforderlich, um die verschiedenen Zelltypen im Krankheitsprozess betroffenen bewerten. Hier diskutieren wir ein solches Modell - Enteroids- und deren Etablierung von Mäusen und menschlichen Dünndarm. Menschlichen Darm Enteroids (HIEs) bieten vor allem bedeutende versprechen, denn sie eine innovative, genetisch vielfältigen ex Vivo Menschmodell bieten um die Untersuchung pathophysiologischer Prozesse zu unterstützen, die im Magen-Darm-Trakt stattfinden 23. Enteroids sind gefunden worden, um langfristige kultiviert werden und kann für spätere Verwendung23eingefroren werden, und im Gegensatz zu menschlichen Darm Organellen (Chios), deren Kulturen von induzierbaren pluripotente Stammzellen entwickelt werden, Enteroids entstehen aus Stammzellen innerhalb von isolierten Darm Krypten24. Enteroids erfordern weniger Wartung, kann schnell25infiziert, und kann leicht festgestellt werden, da Darm Krypten als Chios23differenzierter sind. Deshalb bieten HIEs viele Vorteile gegenüber bestehenden Techniken, weil sie entwickelt werden können, um regionsspezifische kompositorischen und funktionellen Eigenschaften des menschlichen Magen-Darm-Epithel23aufweisen. Die Verwendung von Enteroids ist eine hochwirksame Wahl wenn diese ein menschliches Modell des Darmes, mit Einhaltung der Region-spezifische Einschränkungen und Ease of Use. Hier zeigen wir die Technik der Isolierung und Aufrechterhaltung primäre Stammzellen gewonnenen kleinen Darm Enteroids von Mäusen und menschlichen Säuglingen verfrüht.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM) with 4.5 g/L Glucose and L-Glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humulin N (Insulin)</td>
			<td>Eli Lilly And Company</td>
			<td>0002-8315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mM L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-Ethane Sulfonic Acid (HEPES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x N-2 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x B-27 Supplement Minus Vitamin A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>08-0085SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x ROCK Inhibitor Y-27632, Dihydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse Wnt3a Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1324-WN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse R-Spondin 1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3474-RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 x 10 mm Cell Culture Petri Dish</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030700112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030722116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030723112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Well Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>154534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;M Sterile Cell Strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;M Sterile Cell Strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate-Buffered Saline (PBS), pH 7.2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>20012-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum (NDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope Leica TCS SP8 X</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop CS6</td>
			<td>Adobe Systems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G 1.5 Inch Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>792632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxytocin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O3251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Double Electric Breast Pump</td>
			<td>Lansinoh</td>
			<td>044677530163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Round Bottom Test Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Stoppers</td>
			<td>Frey Scientific</td>
			<td>560761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB15580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Mki67 primer F: 5&#39;-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3&#39; R: 5&#39;-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3&#39;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

breast milk enhances growth of enteroids: an ex vivo model of cell proliferation

Menschlichen kleinen intestinalen Enteroids ergeben sich aus den Krypten und wenn Sie in einer Stammzellnische angebaut enthalten alle Epithelzelle Typen. Die Fähigkeit, menschliche Enteroid ex Vivo Kultur Systeme einzurichten sind wichtig, Modell Darm Pathophysiologie und studieren die bestimmten zellulären Reaktionen beteiligt. In den letzten Jahren sind Enteroids von Mäusen und Menschen, passagiert und Querneigung Weg für die zukünftige Verwendung in mehreren Labors auf der ganzen Welt kultiviert wird. Diese Enteroid-Plattform kann verwendet werden, testen Sie die Auswirkungen der verschiedenen Behandlungen und Medikamente und welche Auswirkungen auf verschiedene Zelltypen im Darm ausgeübt werden. Hier ein Protokoll für die Gründung der primäre Stammzellen gewonnenen kleinen intestinalen Enteroids abgeleitet von neugeborenen Mäusen und vorzeitige menschlichen Darm wird zur Verfügung gestellt. Darüber hinaus wurde dieses Enteroid-Kultur-System eingesetzt, um die Auswirkungen der artspezifische Muttermilch zu testen. Maus-Muttermilch erhalten Sie effizient mit einer veränderten menschliche Milchpumpe und ausgedrückt Maus Milch kann dann für weitere Forschung Experimente verwendet werden. Wir zeigen nun die Auswirkungen der zum Ausdruck gebrachten Maus, Mensch, und Spender Muttermilch auf das Wachstum und die Verbreitung von Enteroids von neugeborenen Mäusen oder vorzeitige menschlichen Dünndarm abgeleitet.

Zuerst wollten wir untersuchen, ob die Muttermilch ausgedrückt oder pasteurisierte Spender Muttermilch wirkten sich auf kleinen Darm Enteroids. In der Tat erhöht die Muttermilch und Spender Muttermilch das Wachstum des Neugeborenen Maus (Abbildung 1A) und vorzeitige menschlichen abgeleiteten Enteroids (Abbildung 1 b).
Da die Muttermilch das Wachstum der kleinen intest...

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Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

Muttermilch fördert Wachstum der Enteroids: ein Ex-Vivo -Modell der Zellproliferation

Dieses Protokoll beschreibt, wie eine Enteroid-Kultur-System von Neugeborenen Maus oder vorzeitige menschlichen Darm sowie eine effiziente Methode um Milch von Mäusen zu sammeln.

Human small intestinal enteroids are derived from the crypts and when grown in a stem cell niche contain all of the epithelial cell types. The ability to ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

19.4K Aufrufe.  Washington University School of Medicine. Dieses Protokoll beschreibt, wie eine Enteroid-Kultur-System von Neugeborenen Maus oder vorzeitige menschlichen Darm sowie eine effiziente Methode um Milch von Mäusen zu sammeln.

Serie: Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.

Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.

Nährstoff Verordnung durch kontinuierliche Zufuhr für eine groß angelegte Expansion von Mammalian Cells in Sphäroiden

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Forschung

Biotechnik

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its progression. Although the mechanisms involved in promoting breast cancer growth have been intensively studied using monocultures of breast cancer cells such as MCF-7 cells, the contribution of other cell types, such as vascular and lymphatic endothelial cells that are intimately involved in tumor growth, has not been investigated in depth. Cell-cell interaction plays a key role in tumor growth and progression. Neoangiogenesis, or the development of vessels, is essential for tumor growth, whereas the lymphatic system serves as a portal for cancer cell migration and subsequent metastasis. Recent studies provide evidence that vascular and lymphatic endothelial cells can significantly influence cancer cell growth. These observations imply a need for developing in vitro models that would more realistically reflect breast cancer growth processes in vivo. Moreover, restrictions in animal research require the development of ex vivo models to elucidate better the mechanisms involved.
This article describes the development of breast cancer spheroids composed of both breast cancer cells (estrogen receptor-positive MCF-7 cells) and vascular and/or lymphatic endothelial cells. The protocol describes a detailed step-by-step approach in creating dual-cell spheroids using two different approaches, hanging drop (gold standard and cheap) and 96-well U-bottom plates (expensive). In-depth instructions are provided for how to delicately pick up the formed spheroids to monitor growth by microscopic sizing and assessing viability using dead and live cell staining. Moreover, procedures to fix the spheroids for sectioning and staining with growth-specific antibodies to differentiate growth patterns in spheroids are delineated. Additionally, details for preparing spheroids with transfected cells and methods to extract RNA for molecular analysis are provided. In conclusion, this article provides in-depth instructions for preparing multi-cell spheroids for breast cancer research.

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Crosstalk between mammary epithelial cells and endothelial cells importantly contributes to breast cancer progression, tumor growth, and metastasis. In this study, spheroids have been made from breast cancer cells together with vascular and/or lymphatic endothelial cells and demonstrate their applicability as an in vitro system for breast cancer research.

Brustepithel- und Endothelzell-Sphäroide als potenzielles funktionelles In-vitro-Modell für die Brustkrebsforschung

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...

Krebsforschung

Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to digest solid food. This process is termed suckling-to-weaning transition and results in the replacement of neonatal epithelium with adult epithelium which goes hand in hand with metabolic and morphological adjustments. These complex developmental changes are the result of a genetic program that is intrinsic to the intestinal epithelial cells but can, to some extent, be modulated by extrinsic factors. Prolonged culture of mouse primary intestinal epithelial cells from late fetal period, recapitulates suckling-to-weaning transition in vitro. Here, we describe a detailed protocol for mouse fetal intestinal organoid culture best suited to model this process in vitro. We describe several useful assays designed to monitor the change of intestinal functions associated with suckling-to-weaning transition over time. Additionally, we include an example of an extrinsic factor that is capable to affect suckling-to-weaning transition in vivo, as a representation of modulating the timing of suckling-to-weaning transition in vitro. This in vitro approach can be used to study molecular mechanisms of the suckling-to-weaning transition as well as modulators of this process. Importantly, with respect to animal ethics in research, replacing in vivo models by this in vitro model contributes to refinement of animal experiments and possibly to a reduction in the use of animals to study gut maturation processes.

This protocol describes how to mimic suckling-to-weaning transition in vitro using mouse late fetal intestinal organoids cultured for 30 days.

Rekapitulation saugen-zu-Weaning Transition In Vitro mit fetalen Intestinal Organoiden

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to ...

Entwicklungsbiologie

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine mammary gland is composed of two distinct epithelial cell compartments, serving different functions: the outer, contractile myoepithelial compartment and the inner, secretory luminal compartment. Here, we describe a method by which the cells comprising these compartments are isolated and then combined to investigate their individual lineage contributions to mammary gland morphogenesis and differentiation. The method is simple and efficient and does not require sophisticated separation technologies such as fluorescence activated cell sorting. Instead, we harvest and enzymatically digest the tissue, seed the epithelium on adherent tissue culture dishes, and then use differential trypsinization to separate myoepithelial from luminal cells with ~90% purity. The cells are then plated in an extracellular matrix where they organize into bilayered, three-dimensional (3D) organoids that can be differentiated to produce milk after 10 days in culture. To test the effects of genetic mutations, cells can be harvested from wild type or genetically engineered mouse models, or they can be genetically manipulated prior to 3D culture. This technique can be used to generate mosaic organoids that allow investigation of gene function specifically in the luminal or myoepithelial compartment.

The mammary gland is a bilayered structure, comprising outer myoepithelial and inner luminal epithelial cells. Presented is a protocol to prepare organoids using differential trypsinization. This efficient method allows researchers to separately manipulate these two cell types to explore questions concerning their roles in mammary gland form and function.

Generierung von Mosaik-Mammary-Organoiden durch Differential-Trypsinisierung

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...

Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem cells (ISCs) and progeny that progressively migrate and differentiate toward the tip of the villi. These processes, essential for gastrointestinal homeostasis, have been extensively studied using multiple approaches. Ex vivo technologies, especially primary cell cultures have proven to be promising for understanding intestinal epithelial functions. A long-term primary culture system for mouse intestinal crypts has been established to generate 3-dimensional epithelial organoids. These epithelial structures contain crypt- and villus-like domains reminiscent of normal gut epithelium. Commonly, termed &#8220;enteroids&#8221; when derived from small intestine and &#8220;colonoids&#8221; when derived from colon, they are different from organoids that also contain mesenchyme tissue. Additionally, these enteroids/colonoids continuously produce all cell types found normally within the intestinal epithelium. This in vitro organ-like culture system is rapidly becoming the new gold standard for investigation of intestinal stem cell biology and epithelial cell physiology. This technology has been recently transferred to the study of human gut. The establishment of human derived epithelial enteroids and colonoids from small intestine and colon has been possible through the utilization of specific culture media that allow their growth and maintenance over time. Here, we describe a method to establish a small intestinal and colon crypt-derived system from human whole tissue or biopsies. We emphasize the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

We describe a method to establish human enteroids from small intestinal crypts and colonoids from colon crypts collected from both surgical tissue and biopsies. In this methodological article, we present the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

Gründung des Menschen Epithelial Enteroids und Colonoids von Whole Gewebe und Biopsie

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

Medizin

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves composed of a number of terminal duct lobular units made of secretory alveoli and converging ducts1. In mice, a similar architecture is observed at pregnancy in which ducts and alveoli are interspersed within the connective tissue stroma. The mouse mammary gland epithelium is a tree like system of ducts composed of two layers of cells, an inner layer of luminal cells surrounded by an outer layer of myoepithelial cells denoted by the confines of a basement membrane2. At birth, only a rudimental ductal tree is present, composed of a primary duct and 15-20 branches. Branch elongation and amplification start at the beginning of puberty, around 4 weeks old, under the influence of hormones3,4,5. At 10 weeks, most of the stroma is invaded by a complex system of ducts that will undergo cycles of branching and regression in each estrous cycle until pregnancy2. At the onset of pregnancy, a second phase of development begins, with the proliferation and differentiation of the epithelium to form grape-shaped milk secretory structures called alveoli6,7. Following parturition and throughout lactation, milk is produced by luminal secretory cells and stored within the lumen of alveoli. Oxytocin release, stimulated by a neural reflex induced by suckling of pups, induces synchronized contractions of the myoepithelial cells around the alveoli and along the ducts, allowing milk to be transported through the ducts to the nipple where it becomes available to the pups 8. Mammary gland development, differentiation and function are tightly orchestrated and require, not only interactions between the stroma and the epithelium, but also between myoepithelial and luminal cells within the epithelium9,10,11. Thereby, mutations in many genes implicated in these interactions may impair either ductal elongation during puberty or alveoli formation during early pregnancy, differentiation during late pregnancy and secretory activation leading to lactation12,13. In this article, we describe how to dissect mouse mammary glands and assess their development using whole mounts. We also demonstrate how to evaluate myoepithelial contractions and milk ejection using an ex-vivo oxytocin-based functional assay. The effect of a gene mutation on mammary gland development and function can thus be determined in situ by performing these two techniques in mutant and wild-type control mice.

This method describes how to dissect and assess mammary gland development and function from mice. Excised mammary glands are assessed for the degree of development using whole mount while milk ejection is evaluated using an oxytocin-based myoepithelial cell contraction assay.

Evaluation der Brustdrüse Entwicklung und Funktion in Mausmodellen

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Biologie

Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell monolayers. Although they cannot completely model in vivo complexity, they retain some functionality of the original organ. In cancer models, organoids are commonly used to study tumor cell invasion. This protocol aims to develop and characterize organoids from the normal and irradiated mouse mammary gland tissue to evaluate the radiation response in normal tissues. These organoids can be applied to future in vitro cancer studies to evaluate tumor cell interactions with irradiated organoids. Mammary glands were resected, irradiated to 20 Gy and digested in a collagenase VIII solution. Epithelial organoids were separated via centrifugal differentiation, and 3D organoids were developed in 96-well low-adhesion microplates. Organoids expressed the characteristic epithelial marker cytokeratin 14. Macrophage interaction with the organoids was observed in co-culture experiments. This model may be useful for studying tumor-stromal interactions, infiltration of immune cells, and macrophage polarization within an irradiated microenvironment.

Organoids developed from mouse mammary glands were irradiated and characterized to assess epithelial traits and interactions with immune cells. Irradiated organoids can be used to better evaluate cell-cell interactions that may lead to tumor cell recruitment in irradiated normal tissue.

Wachstum und Charakterisierung der bestrahlten Organoide aus den Brustdrüsen

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell ...

Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue architecture. In current layer-by-layer extrusion bioprinting, individual cells are extruded in a bioink together with complex spatial and temporal cues to promote hierarchical tissue self-assembly. However, this biofabrication technique relies on complex interactions among cells, bioinks and biochemical and biophysical cues. Thus, self-assembly may take days or even weeks, may require specific bioinks, and may not always occur when there is more than one cell type involved. We therefore developed a technique to directly bioprint pre-formed 3D breast epithelial spheroids in a variety of bioinks. Bioprinted pre-formed 3D breast epithelial spheroids sustained their viability and polarized architecture after printing. We additionally printed the 3D spheroids onto vascular endothelial cell networks to create a co-culture model. Thus, the novel bioprinting technique rapidly creates a more physiologically relevant 3D human breast model at lower cost and with higher flexibility than traditional bioprinting techniques. This versatile bioprinting technique can be extrapolated to create 3D models of other tissues in additional bioinks.

The goal of this protocol is to directly bioprint breast epithelial cells as multicellular spheroids onto pre-formed endothelial networks to rapidly create 3D breast-endothelial co-culture models which can be used for drug screening studies.

Direkter Bioprinting von 3D Multizellulären Brustsphäroiden auf Endotheliale Netzwerke

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue ...

In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease affecting preterm infants, characterized by intestinal inflammation and necrosis. Enteroids have recently emerged as a promising system to model gastrointestinal pathologies. However, currently utilized methods for enteroid manipulation either lack access to the apical surface of the epithelium (three-dimensional [3D]) or are time-consuming and resource-intensive (two-dimensional [2D] monolayers). These methods often require additional steps, such as microinjection, for the model to become physiologically translatable. Here, we describe a physiologically relevant and inexpensive protocol for studying NEC in vitro by reversing enteroid polarity, resulting in the apical surface facing outward (apical-out). An immunofluorescent staining protocol to examine enteroid barrier integrity and junctional protein expression following exposure to tumor necrosis factor-alpha (TNF-&#945;) or lipopolysaccharide (LPS) under normoxic or hypoxic conditions is also provided. The viability of 3D apical-out enteroids exposed to normoxic or hypoxic LPS or TNF-&#945; for 24 h is also evaluated. Enteroids exposed to either LPS or TNF-&#945;, in combination with hypoxia, exhibited disruption of epithelial architecture, a loss of adherens junction protein expression, and a reduction in cell viability. This protocol describes a new apical-out NEC-in-a-dish model which presents a physiologically relevant and cost-effective platform to identify potential epithelial targets for NEC therapies and study the preterm intestinal response to therapeutics.

In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

This protocol describes an apical-out necrotizing enterocolitis (NEC)-in-a-dish model utilizing small intestinal enteroids with reversed polarity, allowing access to the apical surface. We provide an immunofluorescent staining protocol to detect NEC-related epithelial disruption and a method to determine the viability of apical-out enteroids subjected to the NEC-in-a-dish protocol.

In vitro Apical-out enteroides Modell der nekrotisierenden Enterokolitis

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease affecting preterm infants, characterized by intestinal inflammation and necrosis. Enteroids have ...

Quantification of Proliferative and Dead Cells in Enteroids

The intestinal epithelium acts as a barrier that prevents luminal contents, such as pathogenic microbiota and toxins, from entering the rest of the body. Epithelial barrier function requires the integrity of intestinal epithelial cells. While epithelial cell proliferation maintains a continuous layer of cells that forms a barrier, epithelial damage leads to barrier dysfunction. As a result, luminal contents can across the intestinal barrier via an unrestricted pathway. Dysfunction of intestinal barrier has been associated with many intestinal diseases, such as inflammatory bowel disease. Isolated mouse intestinal crypts can be cultured and maintained as crypt-villus-like structures, which are termed intestinal organoids or &ldquo;enteroids&rdquo;. Enteroids are ideal to study the proliferation and cell death of intestinal epithelial cells in vitro. In this protocol, we describe a simple method to quantify the number of proliferative and dead cells in cultured enteroids. 5-ethynyl-2&rsquo;-deoxyuridine (EdU) and propidium iodide are used to label proliferating and dead cells in enteroids, and the proportion of proliferating and dead cells are then analyzed by flow cytometry. This is a useful tool to test the effects of drug treatment on intestinal epithelial cell proliferation and cell survival.

The presented protocol uses flow cytometry to quantify the number of proliferating and dead cells in cultured mouse enteroids. This method is helpful to evaluate the effects of drug treatment on organoid proliferation and survival.

Quantifizierung von proliferativen und abgestorbenen Zellen in Enteroiden

The intestinal epithelium acts as a barrier that prevents luminal contents, such as pathogenic microbiota and toxins, from entering the rest of the body. ...