Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im kardiovaskulären Bereich über die Auswirkungen der extrazellulären Matrix während verschiedener physiologischer und Entwicklungsstadien des Herzens zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie eine vergleichende Analyse zwischen fetalen und erwachsenen extrazellulären Matrizen ermöglicht, indem eine ähnliche Dezellularisierungsmethode auf beide Arten von Gewebe angewendet wird. So wurde diese Methode erfolgreich auf andere Organe angewendet, wie chirurgische Resektionen von Krebspatienten, die die Untersuchung der extrazellulären Matrix in verschiedenen Kontexten erleichterten.
Beginnen Sie damit, die fetalen und erwachsenen Mausherzen kurz mit eiskaltem PBS zu spülen. Dann legen Sie das Gewebe unter ein Sezieren Mikroskop und verwenden gerade kleine Schere, um die Vorhöfe, rechten Ventrikel, und die Septa aus den erwachsenen Mausherzen zu entfernen. Den linken Ventrikel in eine neue Petrischale geben und die linke ventrikelfreie Wand in zwei Millimeter dicke Längsstreifen teilen.
Die Verwendung von erwachsenen Maus linken Ventrikel Explants von einer homogenen Größe ist entscheidend für eine konsistente Dezellularisierung Effizienz. Verwenden Sie das Skalpell und die gezackte Pinzette mit gekrümmter Spitze, um den Papillenmuskel zu entfernen, bevor Sie ein zwei mal zwei Millimeter großes Raster verwenden, um die Streifen weiter in kleinere Gewebefragmente zu zerkleinern. Wenn das gesamte Gewebe gehackt wurde, spülen Sie die Stücke kurz mit genügend PBS ab, um die Expflanzen zu bedecken.
Und übertragen Sie die fetalen Herzen und Stücke des erwachsenen Herzgewebes in einzelne 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhren, die 250 Mikroliter optimale Schnitttemperatur oder OCT-Verbindung pro Tube enthalten. Dann frieren Sie die Herzgewebeproben in Trockeneis gekühlt isopentane für die Lagerung bei negativen 80 Grad Celsius. Um die kryokonservierten Gewebe zu dezellularisieren, legen Sie die gefrorenen Proben in eine Petrischale, die genügend PBS enthält, um die Expflanzen vollständig zu bedecken.
Nachdem das OCT geschmolzen ist, tauchen Sie die Proben in eine neue Petrischale von PBS und waschen Sie die Proben dreimal auf einem Shaker für 10 bis 15 Minuten bei 60 U/min pro Wäsche. Nach der letzten Wäsche, fügen Sie einen Milliliter arbeitenden hypotonischen Puffer zu jedem Brunnen einer sterilen 24-Well-Gewebekulturplatte und verwenden Sie feine Zange, um ein Fragment auf jeden Brunnen zu übertragen. Inkubieren Sie die Platte bei 25 Grad Celsius für 18 Stunden, bei 165 Umdrehungen pro Minute, gefolgt von drei einstündigen Wäschen in einem Milliliter PBS pro Brunnen und Waschen.
Nach der letzten Wäsche einen Milliliter frisch zubereitetes Natriumdodecylsulfat oder Eine SDS-Lösung für eine 24-Stunden-Inkubation bei 25 Grad Celsius zu jedem Brunnen geben. Spülen Sie die Proben am nächsten Tag mit drei 20-minütigen Waschungen in einem Milliliter hypotonischen Waschpuffer pro Wäsche, gefolgt von der Zugabe von einem Milliliter DNase-Behandlungslösung zu jedem Brunnen für eine dreistündige Inkubation bei 37 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation sollten die dezellularisierten Proben ihre gelatineartige Konsistenz verlieren.
Dann waschen Sie die Gewebefragmente dreimal mit einem Milliliter PBS für 20 Minuten pro Wäsche, gefolgt von einer Nachtwäsche in einem Milliliter frischer PBS pro Brunnen bei Raumtemperatur und 60 Umdrehungen pro Minute. Um die Entfernung von zellulären Resten aus dem dezellularisierten Gewebe zu bewerten, fixieren Sie am nächsten Morgen die Proben in einem Milliliter frisch zubereiteten 10%formelneutralen Puffer, ergänzt mit 0,03% wässrigem Eosin pro Brunnen für 2,5 bis drei Stunden bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation die Proben in einem Milliliter PBS pro Brunnen waschen.
Und verwenden Sie eine Einweg-Vinyl-Probenform, um die dezellularisierten Fragmente in histologie-Verarbeitungsgel nach den Spezifikationen des Herstellers zu verkapseln. Übertragen Sie als Nächstes die gekapselten Fragmente auf eine Biopsieverarbeitungs-Einbettkassette. Und verarbeiten Sie die Proben für Paraffineinbettung durch aufeinander folgende 30-Minuten-Inkubationen in aufsteigenden Konzentrationen von Ethanol, isoparaffinische aliphatische Kohlenwasserstofflösung und zwei 56 Grad Celsius Paraffin entsteht.
Nach dem zweiten Paraffin vorkommen, Proben in einem Paraffinblock montieren und mit einem Mikrotom drei Mikrometer dicke Abschnitte erhalten. Überprüfen Sie dann die Dezellularisierungseffizienz, indem Sie die Abschnitte mit Hämatoxylin und Eosin und Massons Trichromflecken nach Standardprotokollen färben. Nach der nächtlichen PBS-Wäsche mit Schütteln 500 Mikroliter frisch zubereitetes DPBS, ergänzt um 2,5 Mikrogramm pro Milliliter Amphotericin B 1%Antibiotikumlösung, auf jedes Gerüst.
Und die Proben ein bis sieben Tage bei vier Grad Celsius lagern. Ersetzen Sie vor dem Sitzen die DPBS-Lösung durch 500 Mikroliter Zellbasalmedium, ergänzt durch Antibiotika. Und die Gerüste eine Stunde bei 37 Grad Celsius bebrüten.
Verwenden Sie am Ende der Inkubation ein Mikroskop, um einen vier Mikroliter Tropfen DPBS in die Mitte eines Brunnens einer 96-Well-Platte pro Gerüst hinzuzufügen. Und verwenden Sie dünne gerade Pinzette, um ein dezellularisiertes Gerüst an die Spitze jedes Tropfens zu übertragen. Entfernen Sie zusätzliche DPBS durch Aspiration und bestätigen Sie, dass das Gerüst nicht gefaltet oder faltig ist.
Wenn die Gerüste an den Rändern getrocknet sind, setzen Sie langsam eine einzelne Zellsuspension der Zellen von Interesse auf der Oberseite jedes Gerüstes. Embryonale Tag 18 dezellularisierte Gewebe sind durch eine hochtransluzente Struktur gekennzeichnet, während erwachsene Explanten ein transluzentes zu weißes Aussehen aufweisen. Hämatoxylin und Eosin und Massons Trichome-Färbungen bestätigen eine effiziente Zellentfernung durch das Vorhandensein poröser Netze.
Das Kernmaterial wird nach der Dezellularisierung um ca. 99,8% reduziert, verglichen mit nicht manipulierten Geweben, was wesentlich ist, um zu vermeiden, dass eine unerwünschte Entzündungsreaktion bei der Implantation ausgelöst wird. Die Zelllebensfähigkeit in sitzenden Gerüsten kann während der In-vitro-Kultur durch Kalkfärbung überwacht werden. Die Terminalanalyse der Zellrepopulation und -verteilung über Gerüste kann auch nach paraffinverarbeitender Weise durchgeführt werden, wie in diesen repräsentativen Bildern eines zentralen Biogerüstabschnitts beobachtet.
Diese Technik ebnete den Forschern den Weg bei der Erforschung der bioaktiven Eigenschaften der extrazellulären Matrix aus fetalen und erwachsenen Mausherzen, aber auch von anderen Geweben.
