Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen in der Zellbiologie zu beantworten, wie, wie wichtig Spannung bei der Befriedigung des Spindel-Checkpoints ist und welche Rolle spielt die Spindelbefestigung im Chromosomverhalten in Miose? Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es sich um eine nichttödliche Technik handelt, die es dem Experimentator ermöglicht, Verspannungen auf eine lebende Zelle anzuwenden oder sie neu zu positionieren. Bereiten Sie zunächst einen 75 mal 25 Millimeter großen Schlitten mit einem kreisförmigen Loch von 20 Millimetern aus der Mitte vor.
Dann laufen Sie eine 25 mal 25 Millimeter Nummer 1,5 Abdeckung Schlitz durch eine Brötchenbrenner Flamme für zwei Sekunden. Tragen Sie Vakuumfett um den Rand des Lochs in der Glasrutsche auf. Als nächstes legen Sie den Deckel über das Loch und drücken Sie es, um eine enge Dichtung zu bilden.
Drehen Sie den Schlitten um, und füllen Sie die neu erstellte Sezierstrecke gut mit Halocarbonöl. Nachdem Sie einige erwachsene männliche Grillen erhalten haben, verwenden Sie eine Sezierendereine, um die dorsale Oberfläche parallel zur langen Achse des Bauches direkt hinter den Flügelknospen zu durchschneiden. Dann drücken Sie vorsichtig den Bauch, um die Hoden durch den Schnitt im Exoskelett zu drücken.
Mit Zangen die isolierten Hoden in den Sezierenbrunnen geben. Verwenden Sie unter dem Sezieren des Mikroskops feine Zeigezangen, um die Hoden in kleinere Stücke aufzuteilen und Fett zu entfernen. Dann verteilen Sie den Inhalt der Hoden unter dem Öl auf der Oberfläche des Deckschlitzes.
Den Inhalt der Hoden weiter verbreiten, bis der Streuteil mit bloßem Auge kaum sichtbar ist. Bei Bedarf können zusätzliche ölbelastete Sezierbrunnen verwendet werden. Legen Sie zunächst das Ende eines Glasrohrs in die Flamme des Brötchenbrenners.
Halten Sie das Ende der Schläuche, um einen 150-Grad-Winkel und einen erweiterten Bereich aus schmalen Glasschläuchen zu schaffen. Brechen Sie die Schläuche im dünnen Bereich, so dass der dünne Bereich, der sich aus dem zuvor erstellten Winkel erstreckt, etwa 10 Millimeter lang ist. Schmelzen Sie mit der Mikroschmiede die Spitze der Glasnadel und bilden einen 45-Grad-Winkel zwischen der Nadel und dem Platindraht der Mikroschmiede.
Ziehen Sie dann das Glas vom Draht weg und schalten Sie gleichzeitig die Hitze aus. Legen Sie das zuvor vorbereitete Dia auf die Bühne eines invertierten Phasenkontrastmikroskops. Suchen Sie dann die teilenden Zellen und zentrieren Sie sie im Sichtfeld mit der geringstmöglichen Vergrößerung.
Legen Sie die Mikronadel in den Nadelhalter des Mikromanipulators. Positionieren Sie dann die Mikronadel manuell im Lichtpfad des Mikroskops. Fokussieren Sie das Mikroskop mehrere Brennebenen über der Ebene, die die Zellen enthält.
Als Nächstes verwenden Sie den Joystick-Controller, um die Mikronadel mehrmals neu zu positionieren, um den Schatten der Nadel in den x- und y-Achsen zu finden. Passen Sie die Nadelposition nach, bis die Position der Spitze sichtbar ist, und passen Sie dann die Position der Nadel entlang der z-Achse an, bis die Spitze im Fokus steht. Als nächstes konzentrieren Sie sich erneut auf die Zellen, und fokussieren Sie das Mikroskop direkt über der Zellebene.
Richten Sie dann die Position der Nadel so ein, dass die Spitze in dieser Brennebene im Fokus steht. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit dem höheren Vergrößerungsziel und einer höheren Empfindlichkeitseinstellung. Konzentrieren Sie sich erneut auf die Zellen, und passen Sie ihre Position an, damit sie in der Mitte des Sichtfeldes verbleiben.
Verwenden Sie den Joystick, um die Mikronadel zu steuern, während sie Chromosomen in der Zelle schiebt. Stellen Sie sicher, dass die Nadelspitze in der Ebene über den Zellen verbleibt. Um das Chromosom zu bewegen, konzentrieren Sie sich auf ein Chromosom in der Nähe der Oberseite der Zelle.
Passen Sie dann die z-Achse am Joystick an, um die Nadelspitze in den Fokus zu rücken, und bewegen Sie die Nadel mit dem Joystick in x und y. Legen Sie die Spitze der Nadel direkt auf das von Interesse, und drücken Sie es in die gewünschte Richtung. Tragen Sie genügend Spannung auf, um das Chromosom von der Spindel zu trennen.
Platzieren Sie das Chromosom schließlich an einer beliebigen Stelle innerhalb der Zelle. Mit diesem Protokoll ist es möglich, ein Chromosom mit Mikromanipulation neu zu positionieren, Spannung auf sich zu nehmen und ein Chromosom vollständig von einer Spindel zu lösen. In diesem Beispiel wurden zwei manipulierte Chromosomen daran gehindert, sich wieder an die Spindel anzuheften, indem sie ständig mit einer Mikromanipulationsnadel genuddelt wurden.
Nach der Beherrschung können Proben für manipulationsbereit vorbereitet werden, und der Mikromanipulator kann in 15 bis 20 Minuten positioniert werden. Mikromanipulationsexperimente können von wenigen Sekunden bis zu mehreren Stunden dauern. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, Chromosomen auf der Seite der Zelle am weitesten vom Deckbedeckungsschlupf zu manipulieren.
Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Zellbiologie, um den Spindel-Checkpoint in Heuschrecken und betenden Mantis zu erforschen.
