이 방법은 스핀들 체크포인트를 만족시키는 데 긴장이 얼마나 중요한지, 미오증의 염색체 동작에서 스핀들 부착의 역할은 무엇입니까와 같은 세포 생물학의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 실험자가 살아있는 세포에서 장력을 적용하거나 염색체를 재배치할 수 있는 비치명적인 기술이라는 것입니다. 시작하려면 75~25mm 슬라이드를 중앙에서 20mm 직경의 원형 구멍으로 준비합니다.
그런 다음 25 mm 25 mm 번호 1.5 커버 슬릿을 번젠 버너 불꽃을 통해 2 초 동안 실행합니다. 유리 슬라이드의 구멍 가장자리 주위에 진공 그리스를 적용합니다. 그런 다음 덮개를 구멍 위에 놓고 눌러 단단한 씰을 형성합니다.
슬라이드를 뒤집어 할로카본 오일로 새로 생성된 해부를 잘 채웁니다. 일부 성인 남성 크리켓을 얻은 후, 바로 날개 싹 뒤에 복부의 긴 축에 평행 등쪽 표면을 통해 절단 해부 가위를 사용합니다. 그런 다음 복부를 부드럽게 짜서 외골격의 컷을 통해 고환을 밀어 냅니다.
집게를 사용하여 격리된 고환을 해부에 잘 배치합니다. 해부 현미경에서 미세 한 포인팅 포셉을 사용하여 고환을 작은 조각으로 나누고 지방을 제거하십시오. 그런 다음, 커버 슬릿의 표면에 오일 아래에 고환의 내용을 확산.
확산 부분이 육안으로 거의 보이지 않게 될 때까지 고환의 내용을 계속 퍼뜨라. 필요한 경우 추가 오일 하중 해부 우물을 사용할 수 있습니다. 첫째, 분젠 버너의 불꽃에 유리 튜브의 끝을 배치합니다.
튜브의 끝을 잡고 150도 각도와 좁은 유리 튜브의 확장 영역을 만듭니다. 얇은 영역에서 튜브를 끊어 이전에 생성된 각도에서 연장되는 얇은 영역은 약 10밀리미터 길이입니다. 마이크로포지를 사용하여 유리 바늘의 끝을 녹여 마이크로포지의 바늘과 백금 와이어 사이에 45도 각도를 형성합니다.
그런 다음 열을 끄면서 유리를 와이어에서 멀리 당깁니다. 이전에 준비된 슬라이드를 반전된 위상 대비 현미경의 단계에 놓습니다. 그런 다음, 분할 세포를 찾아 가능한 가장 낮은 배율을 사용하여 시야에서 그들을 중도한다.
마이크로니들(microneedle)을 마이크로 조작기의 바늘 홀더에 넣습니다. 그런 다음 현미경의 광 경로에 마이크로 니들(microneedle)을 수동으로 배치합니다. 현미경을 포함 하는 평면 위에 여러 초점 평면을 집중.
다음으로 조이스틱 컨트롤러를 사용하여 마이크로니들을 여러 번 재배치하여 x 및 y 축에서 바늘의 그림자를 찾습니다. 팁의 위치가 보일 때까지 바늘 위치를 재조정한 다음, 팁이 초점이 될 때까지 z 축을 따라 바늘의 위치를 조정합니다. 다음으로, 세포에 다시 초점을 맞추고, 세포 평면 바로 위에 현미경을 집중합니다.
그런 다음 바늘의 위치를 재조정하여 팁이 초점 평면에 초점을 맞출 수 있도록하십시오. 더 높은 배율 목표와 더 높은 감도 설정을 사용하여 이 프로세스를 반복합니다. 셀에 다시 초점을 맞추고 위치를 조정하므로 시야의 중심에 남아 있습니다.
조이스틱을 사용하여 세포 내부의 염색체를 밀어 내면서 마이크로니들을 제어합니다. 바늘 끝이 셀 위의 평면에 남아 있는지 확인합니다. 염색체를 이동하려면 셀 상단 근처의 염색체에 집중하십시오.
그런 다음 조이스틱의 z 축을 조정하여 바늘 끝을 초점으로 가져오고 조이스틱으로 바늘을 x와 y로 이동합니다. 바늘 의 끝을 관심있는 염색체에 직접 놓고 원하는 방향으로 밀어 넣습니다. 염색체를 스핀들에서 분리하기에 충분한 장력을 가합니다.
마지막으로, 세포 내의 어느 곳에서나 염색체를 놓습니다. 이 프로토콜을 사용하면 미세 조작을 사용하여 스핀들에서 염색체를 재배치, 적용 및 완전히 분리할 수 있습니다. 이 예에서는, 2개의 조작된 염색체는 현미경 조작 바늘로 지속적으로 움직여 스핀들로 다시 붙이는 것을 막았습니다.
일단 마스터되면 샘플은 조작을 위해 준비 될 수 있으며 미세 조작기를 15 ~ 20 분 안에 배치 할 수 있습니다. 마이크로 조작 실험은 몇 초에서 몇 시간까지 어디서나 걸릴 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 커버 슬립에서 가장 멀리 세포의 측면에 염색체를 조작하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.
개발 후, 이 기술은 세포 생물학 분야의 연구원들이 메뚜기의 스핀들 체크포인트를 탐구하고 사마귀를 기도하는 길을 열었습니다.
