Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie cellulaire, telles que, quelle est l’importance de la tension dans la satisfaction du point de contrôle fuseau, et quel est le rôle sur l’attachement fuseau dans le comportement chromosomique dans la miose? Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’une technique non létale qui permet à l’expérimentateur d’appliquer une tension ou de repositionner des chromosomes dans une cellule vivante. Pour commencer, préparez une glissière de 75 x 25 millimètres avec un trou circulaire de 20 millimètres de diamètre découpé au centre.
Ensuite, exécutez une fente de couverture de 25 par 25 millimètres 1,5 à travers une flamme de brûleur bunsen pendant deux secondes. Appliquer la graisse sous vide autour du bord du trou dans la glissière en verre. Ensuite, placez le couvercle glisser sur le trou et appuyez dessus pour former un joint serré.
Retournez la glissade et remplissez bien la dissection nouvellement créée d’huile d’halocarbone. Après avoir obtenu des grillons mâles adultes, utilisez des ciseaux disséquants pour couper à travers la surface dorsale parallèle au long axe de l’abdomen, directement derrière les bourgeons de l’aile. Puis, serrez doucement l’abdomen pour pousser les testicules à travers la coupe dans l’exosquelette.
À l’aide de forceps, placer les testicules isolés dans le puits de dissection. Sous le microscope disséquant, utiliser des forceps de pointage fins pour diviser les testicules en petits morceaux, et enlever toute graisse. Ensuite, étalez le contenu des testicules sous l’huile à la surface de la fente du couvercle.
Continuer à répandre le contenu des testicules jusqu’à ce que la partie de propagation soit à peine visible à l’œil nu. D’autres puits de dissection chargés d’huile peuvent être utilisés si nécessaire. Tout d’abord, placez l’extrémité d’un tube de verre dans la flamme du brûleur bunsen.
Tenez l’extrémité du tube pour créer un angle de 150 degrés et une zone étendue de tubes en verre étroits. Casser le tube dans la région mince de sorte que la région mince s’étendant de l’angle précédemment créé est d’environ 10 millimètres de long. À l’aide de la microforge, faire fondre la pointe de l’aiguille en verre, formant un angle de 45 degrés entre l’aiguille et le fil de platine de la microforge.
Ensuite, retirez le verre du fil tout en éteignez simultanément le feu. Placez la diapositive préparée précédemment sur la scène d’un microscope à contraste de phase inversé. Ensuite, trouvez les cellules de division et centrez-les dans le champ de vision en utilisant le grossissement le plus bas possible.
Placez le microneedle dans le porte-aiguille du micromanipulateur. Ensuite, placez manuellement le microneedle dans la trajectoire lumineuse du microscope. Concentrez le microscope plusieurs plans focaux au-dessus du plan contenant les cellules.
Ensuite, utilisez le contrôleur joystick pour repositionner le microneedle plusieurs fois pour trouver l’ombre de l’aiguille dans les axes x et y. Réajustez la position de l’aiguille jusqu’à ce que la position de la pointe soit visible, puis ajustez la position de l’aiguille le long de l’axe z jusqu’à ce que la pointe soit au point. Ensuite, recentrer sur les cellules, et concentrer le microscope juste au-dessus du plan cellulaire.
Ensuite, réajustez la position de l’aiguille de sorte que la pointe est au point dans ce plan focal. Répétez ce processus à l’aide de l’objectif de grossissement plus élevé et d’un réglage de sensibilité plus élevé. Recentrer sur les cellules, et ajuster leur position, de sorte qu’ils restent au centre du champ de vision.
Utilisez le joystick pour contrôler le microneedle car il pousse les chromosomes autour de l’intérieur de la cellule. Assurez-vous que la pointe de l’aiguille reste dans le plan au-dessus des cellules. Pour déplacer le chromosome, concentrez-vous sur un chromosome près du haut de la cellule.
Ensuite, ajustez l’axe z sur le joystick pour mettre la pointe de l’aiguille au point, et déplacez l’aiguille avec le joystick en x et y. Placez le bout de l’aiguille directement sur le chromosome d’intérêt, et poussez-le dans la direction désirée. Appliquez suffisamment de tension pour séparer le chromosome du fuseau.
Enfin, placez le chromosome n’importe où dans la cellule. En utilisant ce protocole, il est possible de repositionner, d’appliquer une tension et de détacher complètement un chromosome d’un fuseau à l’aide de micromanipulation. Dans cet exemple, deux chromosomes manipulés ont été empêchés de se rattacher au fuseau en étant continuellement poussés avec une aiguille de micromanipulation.
Une fois maîtrisés, les échantillons peuvent être préparés pour manipulation, et le micromanipulateur peut être positionné en 15 à 20 minutes. Les expériences de micromanipulation peuvent prendre de quelques secondes à plusieurs heures. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de manipuler les chromosomes sur le côté de la cellule le plus éloigné de la feuille de couverture.
Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine de la biologie cellulaire pour explorer le point de contrôle des broches dans les sauterelles et la mante religieuse.
