Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave na biologia celular, como, como, quão importante é a tensão na satisfação do ponto de verificação do eixo, e qual é o papel no apego do eixo no comportamento do cromossomo na miose? A principal vantagem dessa técnica é que é uma técnica não letal que permite ao experimentador aplicar tensão ou reposicionar cromossomos em uma célula viva. Para começar, prepare um slide de 75 por 25 milímetros com um orifício circular de 20 milímetros de diâmetro cortado do centro.
Em seguida, execute uma tampa de 25 por 25 milímetros número 1,5 cortada através de uma chama de bico bunsen por dois segundos. Aplique graxa de vácuo ao redor da borda do orifício na lâmina de vidro. Em seguida, coloque a tampa escorregando sobre o orifício e pressione-a para formar uma vedação apertada.
Vire o slide e encha o poço de dissecção recém-criado com óleo de halocarbono. Depois de obter alguns grilos machos adultos, use a tesoura dissecando para cortar a superfície dorsal paralela ao longo eixo do abdômen, diretamente atrás dos botões de asa. Em seguida, aperte suavemente o abdômen para empurrar os testículos através do corte no exoesqueleto.
Usando fórceps, coloque bem os testículos isolados na dissecação. Sob o microscópio dissecando, use fórceps finos para dividir os testículos em pedaços menores e remover qualquer gordura. Em seguida, espalhe o conteúdo dos testículos sob o óleo na superfície da fenda da tampa.
Continue a espalhar o conteúdo dos testículos até que a porção de propagação mal seja visível a olho nu. Podem ser utilizados poços adicionais de dissecção carregados de óleo, se necessário. Primeiro, coloque a ponta de um tubo de vidro na chama do queimador bunsen.
Segure a extremidade da tubulação para criar um ângulo de 150 graus e uma área estendida de tubos de vidro estreitos. Quebre o tubo na região fina de modo que a região fina que se estende do ângulo previamente criado tem aproximadamente 10 milímetros de comprimento. Usando o microforge, derreta a ponta da agulha de vidro, formando um ângulo de 45 graus entre a agulha e o fio de platina do microforge.
Em seguida, puxe o vidro para longe do fio enquanto simultaneamente desliga o calor. Coloque o slide previamente preparado no estágio de um microscópio de contraste de fase invertido. Em seguida, encontre as células divisórias e centralize-as no campo de visão usando a menor ampliação possível.
Coloque a microagulha no suporte de agulha do micromanipulador. Em seguida, posicione manualmente o microaícedo no caminho de luz do microscópio. Concentre o microscópio de vários planos focais acima do plano contendo as células.
Em seguida, use o controlador de joystick para reposicionar o microagulha várias vezes para encontrar a sombra da agulha nos eixos x e y. Reajuste a posição da agulha até que a posição da ponta esteja visível, em seguida, ajuste a posição da agulha ao longo do eixo z até que a ponta esteja em foco. Em seguida, reconcentrar-se nas células, e concentrar o microscópio logo acima do plano celular.
Em seguida, reajuste a posição da agulha para que a ponta esteja em foco neste plano focal. Repita este processo usando o objetivo de ampliação mais elevado e uma configuração de sensibilidade mais elevada. Refoce-se nas células e ajuste sua posição, para que permaneçam no centro do campo de visão.
Use o joystick para controlar o microaícedo enquanto empurra cromossomos dentro da célula. Certifique-se de que a ponta da agulha permanece no plano acima das células. Para mover o cromossomo, concentre-se em um cromossomo perto do topo da célula.
Em seguida, ajuste o eixo z no joystick para colocar a ponta da agulha em foco, e mova a agulha com o joystick em x e y. Coloque a ponta da agulha diretamente sobre o cromossomo de interesse, e empurre-a na direção desejada. Aplique tensão suficiente para separar o cromossomo do fuso.
Finalmente, coloque o cromossomo em qualquer lugar dentro da célula. Usando este protocolo, é possível reposicionar, aplicar tensão e desprender completamente um cromossomo de um fuso usando micromanipulação. Neste exemplo, dois cromossomos manipulados foram impedidos de recolocar-se ao fuso por ser continuamente cutucado com uma agulha de micromanipulação.
Uma vez dominadas, as amostras podem ser preparadas para manipulação, e o micromanipulador pode ser posicionado em 15 a 20 minutos. Experimentos de micromanipulação podem levar de alguns segundos a várias horas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manipular cromossomos na lateral da célula mais distante do deslizamento da tampa.
Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da biologia celular explorarem o ponto de verificação do fuso em gafanhotos e louva-a-deus.
