Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la biología celular, como, ¿qué importancia es la tensión para satisfacer el punto de control del husillo y cuál es el papel en la fijación del husillo en el comportamiento cromosómica en la miosis? La principal ventaja de esta técnica es que es una técnica no letal que permite al experimentador aplicar tensión o reposicionar cromosomas en una célula viva. Para empezar, prepare un portaobjetos de 75 por 25 milímetros con un agujero circular de 20 milímetros de diámetro cortado fuera del centro.
Luego, ejecuta una cubierta de 25 por 25 milímetros número 1.5 a través de una llama de quemador de bunsen durante dos segundos. Aplique grasa al vacío alrededor del borde del orificio en el portaobjetos de vidrio. A continuación, coloque el resbalón de la cubierta sobre el orificio y presiónelo para formar un sello hermético.
Da la vuelta a la diapositiva y rellena el pozo de disección recién creado con aceite de halocarbono. Después de obtener algunos grillos machos adultos, utilice tijeras diseccionantes para cortar a través de la superficie dorsal paralela al eje largo del abdomen, directamente detrás de los cogollos de las alas. Luego, apriete suavemente el abdomen para empujar los testículos a través del corte en el exoesqueleto.
Usando fórceps, coloque los testículos aislados en el pozo de disección. Bajo el microscopio de disección, utilice fórceps puntiadores finos para dividir los testículos en trozos más pequeños y eliminar cualquier grasa. A continuación, extienda el contenido de los testículos debajo del aceite en la superficie de la abertura de la cubierta.
Continúe extendiendo el contenido de los testículos hasta que la porción de propagación apenas sea visible a simple vista. Si es necesario, se pueden utilizar pozos de disección adicionales cargados de aceite. En primer lugar, coloque el extremo de un tubo de vidrio en la llama del quemador bunsen.
Sostenga el extremo del tubo para crear un ángulo de 150 grados y un área extendida de tubos de vidrio estrechos. Romper el tubo en la región delgada para que la región delgada que se extiende desde el ángulo creado anteriormente sea de aproximadamente 10 milímetros de largo. Usando el microforge, derrita la punta de la aguja de vidrio, formando un ángulo de 45 grados entre la aguja y el alambre de platino del microforja.
A continuación, tire del vidrio lejos del cable mientras apaga simultáneamente el calor. Coloque la diapositiva previamente preparada en el escenario de un microscopio de contraste de fase invertido. A continuación, busque las celdas divisorias y centrarlas en el campo de visión utilizando la ampliación más baja posible.
Coloque el microneedle en el soporte de la aguja del micromaniprógrafo. A continuación, coloque manualmente el microaquí en la trayectoria de luz del microscopio. Enfoque el microscopio varios planos focales por encima del plano que contiene las células.
A continuación, utilice el controlador de joystick para cambiar la posición del micronúleo varias veces para encontrar la sombra de la aguja en los ejes x e y. Reajuste la posición de la aguja hasta que la posición de la punta sea visible, luego, ajuste la posición de la aguja a lo largo del eje z hasta que la punta esté enfocada. A continuación, vuelva a enfocarse en las células y enfoque el microscopio justo encima del plano celular.
A continuación, reajuste la posición de la aguja para que la punta esté enfocada en este plano focal. Repita este proceso utilizando el objetivo de aumento más alto y un ajuste de mayor sensibilidad. Reenfoque en las celdas y ajuste su posición, para que permanezcan en el centro del campo de visión.
Utilice el joystick para controlar el microneedle mientras empuja los cromosomas dentro de la célula. Asegúrese de que la punta de la aguja permanece en el plano por encima de las células. Para mover el cromosoma, concéntrese en un cromosoma cerca de la parte superior de la célula.
A continuación, ajuste el eje z en el joystick para enfocar la punta de la aguja y mueva la aguja con el joystick en x e y. Coloque la punta de la aguja directamente sobre el cromosoma de interés y empújela en la dirección deseada. Aplique suficiente tensión para separar el cromosoma del husillo.
Finalmente, coloque el cromosoma en cualquier lugar dentro de la célula. Usando este protocolo, es posible reposicionar, aplicar tensión y separar completamente un cromosoma de un husillo usando micromanipulación. En este ejemplo, se impidió que dos cromosomas manipulados se reconocieran al husillo al ser continuamente empujados con una aguja de micromanipulación.
Una vez masterizadas, las muestras se pueden preparar para la manipulación, y el micromanipulador se puede colocar en 15 a 20 minutos. Los experimentos de micromanipulación pueden tardar entre unos segundos y varias horas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar manipular cromosomas en el lado de la célula más alejados del resbalón de la cubierta.
Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología celular exploraran el punto de control del husillo en saltamontes y rezando mantis.
