Name: preclinical assessment of the bioactivity of the anticancer coumarin ot48 by spheroids, colony formation assays, and zebrafish xenografts
Uploaded: 2018-06-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts at JoVE.com

Ricerca presso SNU è sostenuta da Fondazione nazionale per la ricerca (NRF) MEST di Corea per concessione di tumore microambiente Global Core Research Center (GCRC), [numero di grant 2011-0030001]; da la Seoul National University Research Grant e dal cervello Corea (BK21) oltre a programma.

1. colony formazione Assays
<ol><li>Cellulari cellule A549 cultura ad una concentrazione di 20.000 cellule/cm2 a 15 mL di RPMI1640 cultura supplementato con 10% FBS (siero fetale bovino) e 1% antibiotici in un pallone da2 cm 75 in incubatore a CO2 a 37 ° C e 5% CO2.</li>
	<li>Il giorno dell'esperimento, determinare la concentrazione di cellule utilizzando un emocitometro. Raccogliere 50.000 cellule mediante centrifugazione a 400 x g per 7 min in una microcentrifuga da 1,5 mL e risospendere le cellule in 100 µ l di 1 x sterile PBS (Phosphate Buffered Saline) in provette da 1,5 mL.</li>
	<li>Dispensare 1,1 mL di mezzo di metilcellulosa-base semi-solido (MCBM) in provette da 15 mL con un multipipette. Preparare una provetta per ogni condizione.</li>
	<li>Aggiungere 110 µ l di FBS a 1,1 mL di MCBM utilizzando una micropipetta P200.</li>
	<li>Cellule di semi a 1.000 cellule/mL. Raccogliere 2,4 µ l di sospensione cellulare dalla soluzione stock (50.000 cellule in 100 µ l di PBS 1X) utilizzando una micropipetta P2 e aggiungere a 1,1 mL di MCBM supplementato con 10% FBS.</li>
	<li>Dopo aver aggiunto le cellule, vortex le provette per 1 min, tenendoli verticalmente alla massima velocità per mescolare bene MCBM e cellule.</li>
	<li>Aggiungere sostanze da testare (OT48 da solo o in combinazione con A1210477). Preparare un tubo separato come un controllo per il solvente usato (qui il solfossido dimetilico (DMSO)). A seconda della concentrazione dei composti e il volume aggiunto per ogni condizione, il controllo solvente includerà la più alta concentrazione di solvente utilizzato per le diluizioni del composto, test per valutare gli effetti negativi causati da parte del solvente.</li>
	<li>Tubi di vortice per 1 minuto.</li>
	<li>Per ogni dosaggio, aggiungere 1 mL della miscela con una micropipetta P1000 al centro anche di una piastra di coltura delle cellule 12-pozzetti.</li>
	<li>Riempire i pozzetti vuoti con 1 mL di acqua sterile o 1X PBS per stabilizzare l'umidità.</li>
	<li>Incubare le piastre di coltura per 10 giorni in un incubatore a 37 ° C e 5% CO2.</li>
	<li>Dopo 10 giorni di incubazione, aggiungere 200 µ l di una soluzione di riserva (methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromuro) MTT (5 mg/mL) ad ogni pozzetto per raggiungere una concentrazione finale di 1 mg/mL.</li>
	<li>Incubare per 10 minuti in un incubatore a 37 ° C e 5% CO2. Colonie vitali diventerà viola.</li>
	<li>Acquisire l'immagine utilizzando una fotocamera digitale mediante la piastra di fondo bianco (vassoio di bianco dia LAS). Utilizzare le seguenti impostazioni: metodo, digitalizzare; Tipo di esposizione, precisione; Tempo di esposizione, manuale, 1 secondo; Sensibilità/risoluzione, alta risoluzione. Salvare l'immagine in formato tiff.</li>
	<li>Quantificare le colonie vitali utilizzando software ImageJ. Selezionare il menu "immagine | Tipo | 8 bit". Selezionare il menu "regolare | Soglia". Imposta la soglia per controllare e mantenere costante per tutte le condizioni; Selezionare il menu "Analyze | Analizzare le particelle". Salvare i dati e analizzare con un software di statistiche per la rappresentazione grafica.</li>
</ol>2. analisi di formazione sferoide
<ol><li>Cellule A549 di coltura ad una concentrazione di 20.000 cellule/cm2 in boccette2 75cm con 15 mL di RPMI 1640 supplementato con 10% FBS e 1% antibiotici.</li>
	<li>Il giorno dell'esperimento, preparare un 96 ben piastra di fondo U.</li>
	<li>Piastra di 10.000 cellule in un pozzo che contiene già il composto di interesse (qui 50 µM di OT48) e/o 20 µM di A1210477. Regolare il volume finale di 100 µ l di terreno di coltura cellulare. Il numero di cellule che formano sferoidi uniforme con un contorno esterno intatto è ritenuto sufficiente per sferoidi di forma.</li>
	<li>Incubare per 3 giorni in un incubatore a 37 ° C e 5% CO2.</li>
	<li>Dopo 3 giorni di incubazione, acquisire immagini di sferoidi utilizzando un microscopio con ingrandimento 4x.</li>
</ol>3. Zebrafish Xenograft Assay
Nota: Questo approccio tecnico è visualizzato come uno schema (Figura 1).
<ol><li>
Preparazione dei reagenti stock
	<ol>
<li>Preparare 1 L di soluzione di Danieau: 30x: 1740 mM NaCl, 21 mM KCl, 12mm MgSO4∙7H2O, 18 mM Ca (NO3)2e 150 mM HEPES. Regolare il pH del buffer a 7.6 utilizzando un pH-metro.</li>
		<li>Preparare la soluzione di tricaina 1% (50x): sciogliere 20 mg di etile 3-aminobenzoate methanesulfonate (tricaina) in 2 mL di acqua distillata.</li>
		<li>Preparare la soluzione di 1% di rosso fenolo-PBS: aggiungere 2 µ l di soluzione di sale di sodio fenolo rosso a 198 µ l di soluzione di PBS sterilizzati in un tubo di 1,5 µ l.</li>
		<li>Preparare 3% metilcellulosa: aggiungere 3 g di metilcellulosa a 100 mL di soluzione di Danieau 1x.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Incubazione e la produzione di uova di pesce zebra
	<ol>
<li>Separare uno femminile e uno maschile zebrafish in un serbatoio di partizione riempito con acqua di rubinetto filtrata e sterilizzata UV a 28,5 ° C al buio. Dopo 24 h di separazione, mescolare pesce di entrambi i sessi per iniziare l'accoppiamento. Trasferire uova fecondate dal serbatoio dell'accoppiamento di una piastra Petri contenente 5 mL di soluzione di Danieau fresco.</li>
		<li>Lavare le uova tre volte con 5 mL di soluzione di Danieau. Per il lavaggio, aspirare accuratamente le uova con una pipetta e trasferimento a 5 mL di soluzione fresca. Incubare per 8 h a 28,5 ° C.<ol>
<li>Dopo 8 h di incubazione in soluzione di Danieau, cambiare per la soluzione di Danieau contenente 0.03% 1-fenil-2-tiourea (PTU) per inibire la pigmentazione. Ordinare uova opache (non fecondate o contenenti embrioni non sviluppati) per prevenire la contaminazione.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Embrione dechorionation
	<ol>
<li>24h post fertilizzazione (hpf), embrioni di zebrafish dechorionate usando pinze taglienti. Incubare gli embrioni di schiusa in soluzione di Danieau con 0,03% PTU a 28,5 ° C fino a 48 hpf.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione delle cellule trattate composto
	<ol>
<li>Cellule A549 seme a 20.000 cellule/cm2 in matracci di cultura di 25 cm2 . Dopo 24 h di semina, aggiungere composti (qui OT48 a 50 µM ed e/o A1210477 a 20 µM) per 24 h in un incubatore a 37 ° C e 5% CO2. Impostare il tempo di trattamento per ogni composto per mantenere la vitalità delle cellule ma di commetterle verso la morte delle cellule. Stavolta punto deve essere impostato individualmente sulla base attuabilità delle cellule, morfologia e marcatori molecolari.</li>
		<li>2 h prima della fine del trattamento, cellule di macchia con 4 µM di tracker cellulare fluorescente tingono CM-Dil a 37 ° C e 5% CO2. Dopo 2 h di incubazione, tripsinizzano cellule con tripsina-EDTA 0,05% e diluire 106 cellule in 50 µ l di soluzione di rosso fenolo-PBS prima dell'iniezione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Micro-iniezione delle cellule tumorali per la formazione dello xenotrapianto
	<ol>
<li>Anestetizzare zebrafish in una soluzione di tricaina 0,02% per 5 minuti fino a quando essi stabilirsi su una piastra di agar.</li>
		<li>Tirare un 1.0 mm (all'esterno di vetro di diametro (OD) capillare) di un estrattore micropipetta (le impostazioni del programma: p: 300, calore: 260, tirare: 60, VEL: 50 e tempo: 200). Tagliare il microcapillary con una siringa per produrre un bordo tagliente. Caricare microcapillari con 20 µ l di cella/fenolo rosso-soluzione PBS. Impostare la pressione di iniezione e ora per erogare 2 nL per iniezione.</li>
		<li>Iniettare 100 – 200 cellule il sacco vitellino di iniezione da 6 a 10 nL tramite iniezioni di 3 a 5. Dopo l'iniezione, consentire pesce recuperare per 10 a 30 min in 5 mL di soluzione di Danieau fresco contenente soluzione di PTU. Spedizione pesce in piastre da 24 pozzetti con 1 mL di soluzione di Danieau contenente soluzione di PTU sono e incubare per 72 h a 28,5 ° C.</li>
		<li>Dopo 72 h di incubazione, anestetizzare il pesce in una soluzione di tricaina 0.02% e immobilizzare su un vetrino con un calo del 3% metilcellulosa. 5 x fotografare da microscopia di fluorescenza alla lunghezza d'onda di 620 a 750 nm.</li>
		<li>Quantificare la dimensione dei tumori fluorescente da software ImageJ. Selezionare il menu "Analyze | Misura". Salvare i valori corrispondenti per il segnale fluorescente e analizzare con un software di statistiche per la rappresentazione grafica.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Giancotti, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deregulation+of+cell+signaling+in+cancer.">Deregulation of cell signaling in cancer.</a> FEBS Letters. 588 (16), 2558-2570 (2014).</li><li>Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioprinting+for+cancer+research.">Bioprinting for cancer research.</a> Trends in Biotechnology. 33 (9), 504-513 (2015).</li><li>Santo, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+in+3D+in+vitro+tumor+models:+overcoming+current+pitfalls+of+efficacy+read-outs.">Drug screening in 3D in vitro tumor models: overcoming current pitfalls of efficacy read-outs.</a> Biotechnology Journal. 12 (1), (2017).</li><li>Tanner, K., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+3D+culture+models+of+cancer.">Beyond 3D culture models of cancer.</a> Science Translational Medicine. 7 (283), 283ps289 (2015).</li><li>Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+cell+culture:+a+review+of+current+approaches+and+techniques.">3D cell culture: a review of current approaches and techniques.</a> Methods in Molecular Biology. 695, 1-15 (2011).</li><li>Talhi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bis(4-hydroxy-2H-chromen-2-one):+synthesis+and+effects+on+leukemic+cell+lines+proliferation+and+NF-kappaB+regulation.">Bis(4-hydroxy-2H-chromen-2-one): synthesis and effects on leukemic cell lines proliferation and NF-kappaB regulation.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 22 (11), 3008-3015 (2014).</li><li>Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonogenic+assay+of+cells+in+vitro.">Clonogenic assay of cells in vitro.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).</li><li>Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Tumor+Models:+Advantages,+Disadvantages,+Variables,+and+Selecting+the+Right+Platform.">In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).</li><li>Lee, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytostatic+hydroxycoumarin+OT52+induces+ER/Golgi+stress+and+STAT3+inhibition+triggering+non-canonical+cell+death+and+synergy+with+BH3+mimetics+in+lung+cancer.">Cytostatic hydroxycoumarin OT52 induces ER/Golgi stress and STAT3 inhibition triggering non-canonical cell death and synergy with BH3 mimetics in lung cancer.</a> Cancer Letters. 416, 94-108 (2018).</li><li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+to+the+soft-agar+assay+that+permits+high-throughput+drug+and+genetic+screens+for+cellular+transformation.">Alternative to the soft-agar assay that permits high-throughput drug and genetic screens for cellular transformation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5708-5713 (2015).</li><li>Spoerri, L., Beaumont, K. A., Anfosso, A., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Cell+Cycle+Imaging+in+a+3D+Cell+Culture+Model+of+Melanoma.">Real-Time Cell Cycle Imaging in a 3D Cell Culture Model of Melanoma.</a> Methods in Molecular Biology. 1612, 401-416 (2017).</li><li>Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, F., Weninger, W., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging-+and+Flow+Cytometry-based+Analysis+of+Cell+Position+and+the+Cell+Cycle+in+3D+Melanoma+Spheroids.">Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53486 (2015).</li><li>Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+cell+culture+techniques+for+cancer+drug+discovery.">Advanced cell culture techniques for cancer drug discovery.</a> Biology (Basel). 3 (2), 345-367 (2014).</li><li>Ji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dialkyl+resorcinol+stemphol+disrupts+calcium+homeostasis+to+trigger+programmed+immunogenic+necrosis+in+cancer.">The dialkyl resorcinol stemphol disrupts calcium homeostasis to trigger programmed immunogenic necrosis in cancer.</a> Cancer Letters. 416, 109-123 (2018).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

I tassi di formazione della Colonia ottenuti con MCBM dipende dal tipo delle cellule. Di solito, per cellule non aderenti, il numero di colonie è molto superiore rispetto a cellule aderenti. Abbiamo osservato che le cellule A549 formano colonie di 30 a 40 dopo 10 giorni. Precedentemente abbiamo segnalato per le cellule di leucemia differenti che il numero di colonie è compreso tra 200-2509. I nostri risultati hanno mostrato che OT48 da solo non ha prodotto una diminuzione significativa del numer...

Il cancro è causato da mutazioni cellulari e di conseguenza pathway biochimici sono interrotti innescando la divisione cellulare incontrollata e resistenza alla morte cellulare. I tumori interferiscano con funzioni fisiologiche dell'apparato digerente, nervoso, circolatorio e successivamente vicini tessuti1. Nonostante gli sforzi di ricerche approfondite, il cancro rimane la malattia pericolosa più diffusa nel mondo2. Medicina di precisione è stato riconosciuto come il fondamento della terapeutica del cancro futuro. Nuove entità molecolari sono testate regolarmente in combinazione con farmaci già esistenti per migliorare il risultato clinico.
Tuttavia, uno dei limiti significativi connessi con lo sviluppo di nuove terapie mirate efficiente è il fallimento di analisi comunemente usati per simulare il risultato biologico esatto della droga dell'esposizione3. Scoperta della droga di cancro ancora in gran parte si basa su test l'efficacia degli agenti terapeutici in linee cellulari tumorali coltivate in colture monostrato 2D, che sono difficili da convalidare in studi clinici4. Di conseguenza, c'è un crescente interesse a sviluppare modelli migliori di cancro che meglio simulano le funzionalità native di tumori in vivo5. Negli ultimi anni, un crescente interesse nei modelli 3D cultura ha provocato lo sviluppo di metodologie di miglioramento per produrre tumore 3D modelli5.
Qui, presentiamo un approccio con tre tecniche di coltura differenti delle cellule 3D che permette di migliorare la comprensione della potenza di hydroxycoumarin OT486 in combinazione con BH3 mimetics prima più in profondità in vivo saggi. Il nostro metodo consiste di combinazione di Colonia e SFAs con un in vivo del tumore formazione test basato su un modello di zebrafish ulteriormente convalidare l'efficacia della combinazione di OT48 e BH3 mimetici in cellule di cancro del polmone e monitorare la progressione del cancro in una vita organismo.
Saggi di formazione di Colonia sono abitualmente utilizzati per valutare l'efficacia di farmaci antitumorali per i tumori sia solidi, nonché ematopoietici. Il test determina la capacità di una cellula a proliferare indefinitamente e formano colonie7. L'effetto di un agente anticancro sulla capacità delle cellule di formazione di colonie è determinata dalla diminuzione del numero e/o dimensioni delle colonie.
Sferoidi rappresentano modelli di tumore in vitro e servono come una piattaforma di screening a basso costo per agenti anticancro. Sferoidi sono aggregati di cellule che crescono in sospensione o incorporati in una matrice 3D. Questo approccio è ampiamente usato per lo screening di stupefacenti e gli studi di tumore crescita, proliferazione e immunitario interazione8.
Per comprendere appieno le proprietà di un nuovo farmaco, è essenziale per condurre esperimenti in vivo su roditori. Tuttavia, questo metodo convenzionale è costoso e richiede tempo. Negli ultimi anni, zebrafish (Danio rerio) è diventato un organismo laboratorio ampiamente studiati che è più economico e più veloce per aumentare. Tumori si sono sviluppati nell'approccio di coltura cellulare di zebrafish rappresentano un 3D, ma all'interno della regolazione in vivo di un vertebrato9.
Complessivamente, usiamo qui tre approcci diversi cultura 3D tra cui CFAs, SFAs e formazione di zebrafish in vivo del tumore per dimostrare la capacità anticancro di hydroxycoumarin OT48 in un modello cellulare di cancro delle cellule A549 polmone in combinazione con BH3 mimetici.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Materials required for colony formation assays&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>37 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>30096</td><td>4 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1520-500</td><td>-20 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Lonza</td><td>17-602E</td><td>-20 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>Cell culture flask T75</td><td>SPL</td><td>70075</td><td>RT</td></tr><tr><td>PBS solution</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.02</td><td>RT</td></tr><tr><td>1.5ml tube</td><td>Extragene</td><td>Tube-170-C</td><td>RT</td></tr><tr><td>15 ml tube</td><td>Hyundai Micro</td><td>H20015</td><td>RT</td></tr><tr><td>12 well plate</td><td>SPL</td><td>30012</td><td>RT</td></tr><tr><td>MethoCult</td><td>StemCell technologies</td><td>4230</td><td>-20 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT powder)</td><td>Sigma</td><td>M5622</td><td>4 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>LAS4000</td><td>GE Healthcare Technologies</td><td></td><td>RT</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials required for spheroid formation assay&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>37 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>30096</td><td>4 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1520-500</td><td>-20 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Lonza</td><td>17-602E</td><td>-20 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>Cell culture flask T75</td><td>SPL</td><td>70075</td><td>RT</td></tr><tr><td>PBS solution</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.02</td><td>RT</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25-300-054</td><td>4 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>Corning costar ultra low attachemnt 96 well plate</td><td>Corning</td><td>3474</td><td>RT</td></tr><tr><td>Microscopy</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100</td><td>RT</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials required for zebrafish xenografts&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>37 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>30096</td><td>4 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1520-500</td><td>-20 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Lonza</td><td>17-602E</td><td>-20 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>Cell culture flask T25</td><td>SPL</td><td>70025</td><td>RT</td></tr><tr><td>Cell culture flask T75</td><td>SPL</td><td>70075</td><td>RT</td></tr><tr><td>Cell culture flask T175</td><td>SPL</td><td>71175</td><td>RT</td></tr><tr><td>1.5ml tube</td><td>Extragene</td><td>Tube-170-C</td><td>RT</td></tr><tr><td>24 well plate</td><td>SPL</td><td>30024</td><td>RT</td></tr><tr><td>Petridish</td><td>SPL</td><td>10100</td><td>RT</td></tr><tr><td>PBS solution</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.02</td><td>RT</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25-300-054</td><td>4 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71382</td><td>RT</td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>RT</td></tr><tr><td>Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2773</td><td>RT</td></tr><tr><td>Calcium nitrate tetrahydrate (Ca(NO3)2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1396</td><td>RT</td></tr><tr><td>HEPES solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td>RT</td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>RT</td></tr><tr><td>Phenol Red solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td>RT</td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0512</td><td>RT</td></tr><tr><td>1-phenyl-2-thiourea (PTU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td>RT</td></tr><tr><td>CM-Dil dye</td><td>Invitrogen</td><td>C7001</td><td>-20 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>Glass capillary</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW 100F-4</td><td>RT</td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Shutter instrument, USA</td><td>P-97</td><td>RT</td></tr><tr><td>Micro injector</td><td>World Precision Instruments</td><td>PV820</td><td>RT</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>KOVAX</td><td>1ml</td><td>RT</td></tr><tr><td>Micro loader</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>RT</td></tr><tr><td>Glass slide</td><td>Marienfeld</td><td>HSU-1000612</td><td>RT</td></tr><tr><td>Fluorescence microscopy</td><td>Leica</td><td>DE/DM 5000B</td><td>RT</td></tr></tbody></table>

preclinical assessment of the bioactivity of the anticancer coumarin ot48 by spheroids, colony formation assays, and zebrafish xenografts

Lo screening pre-clinico in vitro e in vivo di nuovi agenti terapeutici sono uno strumento essenziale nella scoperta della droga di cancro. Anche se linee cellulari tumorali umane rispondono ai composti terapeutici nelle colture delle cellule dello strato monomolecolare (dimensionali) 2D, 3D cultura sistemi sono stati sviluppati per comprendere l'efficacia delle droghe nei modelli più fisiologicamente rilevanti. Negli ultimi anni, un cambiamento di paradigma è stata osservata in ricerca pre-clinica per convalidare la potenza di nuove molecole in sistemi di coltura 3D, più precisamente che imita il microambiente tumorale. Questi sistemi caratterizzano lo stato di malattia in un modo più fisiologicamente rilevante e aiutano ad per acquisire meglio meccanicistico conoscenza e la comprensione della potenza farmacologica di una data molecola. Inoltre, con l'attuale tendenza al miglioramento in vivo modelli del cancro, zebrafish è emerso come un importante modello di vertebrati di valutare in vivo la formazione del tumore e di studiare l'effetto degli agenti terapeutici. Qui, abbiamo studiato l'efficacia terapeutica di hydroxycoumarin OT48 da solo o in combinazione con BH3 mimetics nella linea cellulare di cancro del polmone delle cellule A549 utilizzando tre sistemi differenti della coltura 3D tra cui saggi di formazione di Colonia (CFA), analisi di formazione della sferoide (SFA) e in vivo gli xenotrapianti zebrafish.

Nella Figura 2, il cancro del polmone delle cellule linea A549 è stato seminato in MCBM di formare le colonie dopo il trattamento con OT48 da solo o in combinazione con BH3 mimetico A1210477 alle concentrazioni indicate. I risultati hanno mostrato che la combinazione significativamente ridotto numero, dimensione e superficie totale delle colonie dopo 10 giorni di incubazione.
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Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts

Valutazione preclinica della bioattività dell'OT48 di cumarina anticancro di sferoidi, Colony Assays formazione e xenotrapianti di Zebrafish

Qui, presentiamo lo screening preclinico di cumarine anticancro utilizzando zebrafish e cultura 3D.

In vitro and in vivo pre-clinical screening of novel therapeutic agents are an essential tool in cancer drug discovery. Although human cancer cell lines ...

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

8.3K Views.  Seoul National University. Qui, presentiamo lo screening preclinico di cumarine anticancro utilizzando zebrafish e cultura 3D.

Video: Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts

Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish (Danio Rerio)

Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression. Traditional in vitro models of cancer cell invasion of endothelia typically lack the fluid dynamics that invading cells are otherwise exposed to in vivo. However, in vivo systems such as mouse models, though more physiologically relevant, require longer experimental timescales and present unique challenges associated with monitoring and data analysis. Here we describe a zebrafish assay that seeks to bridge this technical gap by allowing for the rapid assessment of cancer cell vascular invasion and extravasation. The approach involves injecting fluorescent cancer cells into the precardiac sinus of transparent 2-day old zebrafish embryos whose vasculature is marked by a contrasting fluorescent reporter. Following injection, the cancer cells must survive in circulation and subsequently extravasate from vessels into tissues in the caudal region of the embryo. Extravasated cancer cells are efficiently identified and scored in live embryos via fluorescence imaging at a fixed timepoint. This technique can be modified to study intravasation and/or competition amongst a heterogeneous mixture of cancer cells by changing the injection site to the yolk sac. Together, these methods can evaluate a hallmark behavior of cancer cells and help uncover mechanisms indicative of malignant progression to the metastatic phenotype.

Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish Danio Rerio

This method utilizes zebrafish embryos to efficiently test the vascular invasive ability of cancer cells. Fluorescent cancer cells are injected into the precardiac sinus or yolk sac of developing embryos. Cancer cell vascular invasion and extravasation is assessed via fluorescence microscopy of the tail region 24 to 96 hr later.

Testare la capacità vascolare invasiva delle cellule tumorali in Zebrafish (<em&gt; Danio Rerio</em&gt;)

Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression.  Traditional in vitro models of cancer cell invasion of ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Genomic studies of human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered in tumors1,2,3. A challenge arising from these studies is that many genes are altered, and it can be difficult to distinguish genetic alterations that drove tumorigenesis from that those arose incidentally during transformation. To draw this distinction it is beneficial to have an assay that can quantitatively measure the effect of an altered gene on tumor initiation and other processes that enable tumors to persist and disseminate. Here we present a rapid means to screen large numbers of candidate melanoma modifiers in zebrafish using an autochthonous tumor model4 that encompasses steps required for melanoma initiation and maintenance. A key reagent in this assay is the miniCoopR vector, which couples a wild-type copy of the mitfa melanocyte specification factor to a Gateway recombination cassette into which candidate melanoma genes can be recombined5. The miniCoopR vector has a mitfa rescuing minigene which contains the promoter, open reading frame and 3'-untranslated region of the wild-type mitfa gene. It allows us to make constructs using full-length open reading frames of candidate melanoma modifiers. These individual clones can then be injected into single cell Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf)zebrafish embryos. The miniCoopR vector gets integrated by Tol2-mediated transgenesis6 and rescues melanocytes. Because they are physically coupled to the mitfa rescuing minigene, candidate genes are expressed in rescued melanocytes, some of which will transform and develop into tumors. The effect of a candidate gene on melanoma initiation and melanoma cell properties can be measured using melanoma-free survival curves, invasion assays, antibody staining and transplantation assays.

A rapid way to screen for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model is presented. It takes advantage of the miniCoopR vector which allows for expression of candidate melanoma genes in melanocytes. A method to obtain melanoma-free survival curves, an invasion assay, a protocol for antibody staining of scale melanocytes and a melanoma transplantation assay are described.

Screening per Modificatori melanoma utilizzando un modello Zebrafish Tumore autoctone

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Medicina

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the standard in the field, but zebrafish have emerged as an alternative model with several advantages, including the ability for high-throughput and low-cost drug screening. Zebrafish also allow for in vivo drug screening with large replicate numbers that were previously only obtainable with in vitro systems. The ability to rapidly perform large scale drug screens may open up the possibility for personalized medicine with rapid translation of results back to clinic. Zebrafish xenograft models could also be used to rapidly screen for actionable mutations based on tumor response to targeted therapies or to identify new anti-cancer compounds from large libraries. The current major limitation in the field has been quantifying and automating the process so that drug screens can be done on a larger scale and be less labor-intensive. We have developed a workflow for xenografting primary patient samples into zebrafish larvae and performing large scale drug screens using a fluorescence microscope equipped imaging unit and automated sampler unit. This method allows for standardization and quantification of engrafted tumor area and response to drug treatment across large numbers of zebrafish larvae. Overall, this method is advantageous over traditional cell culture drug screening as it allows for growth of tumor cells in an in vivo environment throughout drug treatment, and is more practical and cost-effective than mice for large scale in vivo drug screens.

Zebrafish xenograft models allow for high-throughput drug screening and fluorescent imaging of human cancer cells in an in vivo microenvironment. We developed a workflow for large scale, automated drug screening on patient-derived leukemia samples in zebrafish using an automated fluorescence microscope equipped imaging unit.

Screening farmacologico del paziente primario - Tumore derivato Xenotrapianto nel pesce zebra

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly visualizing the response to anti-cancer therapies (chemo, radiotherapy, and biologicals), angiogenesis and metastasis with single cell resolution, places the zebrafish xenograft model as a top choice to develop preclinical studies.

The zebrafish larval xenograft assay presents several experimental advantages compared to other models, but probably the most striking is the reduction of size scale and consequently time. This reduction of scale allows single cell imaging, the use of a relatively low number of human cells (compatible with biopsies), medium-high-throughput drug screenings, but most importantly enables a significant reduction of the time of the assay. All these advantages make the zebrafish xenograft assay extremely attractive for future personalized medicine applications.

Many zebrafish xenograft protocols have been developed with a wide diversity of human tumors; however, a general and standardized protocol to efficiently generate zebrafish larval xenografts is still lacking. Here we provide a step-by-step protocol, with tips to generate xenografts and guidelines for tumor behavior analysis, whole-mount immunofluorescence, and confocal imaging quantification.

Here, we provide a step-by-step protocol, with tips to generate xenografts and guidelines for tumor behavior analysis, whole-mount immunofluorescence, and confocal imaging quantification.

Generazione di xenografti larvali zebrafish e analisi del comportamento tumorale

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a lack of clinical efficacy. This high failure rate illuminates the inability of the current preclinical models to predict clinical efficacy, mainly due to their inadequacy in reflecting tumor heterogeneity and the tumor microenvironment. These limitations can be addressed with 3-dimensional (3D) culture models (spheroids) established from human tumor samples derived from individual patients. These 3D cultures represent real-world biology better than established cell lines that do not reflect tumor heterogeneity. Furthermore, 3D cultures are better than 2-dimensional (2D) culture models (monolayer structures) since they replicate elements of the tumor environment, such as hypoxia, necrosis, and cell adhesion, and preserve the natural cell shape and growth. In the present study, a method was developed for preparing primary cultures of cancer cells from individual patients that are 3D and grow in multicellular spheroids. The cells can be derived directly from patient tumors or patient-derived xenografts. The method is widely applicable to solid tumors (e.g., colon, breast, and lung) and is also cost-effective, as it can be performed in its entirety in a typical cancer research/cell biology lab without relying on specialized equipment. Herein, a protocol is presented for generating 3D tumor culture models (multicellular spheroids) from primary cancer cells and evaluating their sensitivity to drugs using two complementary approaches: a cell-viability assay (MTT) and microscopic examinations. These multicellular spheroids can be used to assess potential drug candidates, identify potential biomarkers or therapeutic targets, and investigate the mechanisms of response and resistance.

The present protocol describes generating 3D tumor culture models from primary cancer cells and evaluating their sensitivity to drugs using cell-viability assays and microscopic examinations.

Stabilire sferoidi 3-dimensionali da campioni tumorali derivati dal paziente e valutare la loro sensibilità ai farmaci

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Establishment of Zebrafish Patient-Derived Xenografts from Pancreatic Cancer for Chemosensitivity Testing

Cancer is one of the main causes of death worldwide, and the incidence of many types of cancer continues to increase. Much progress has been made in terms of screening, prevention, and treatment; however, preclinical models that predict the chemosensitivity profile of cancer patients are still lacking. To fill this gap, an in vivo patient-derived xenograft model was developed and validated. The model was based on zebrafish (Danio rerio) embryos at 2 days post fertilization, which were used as recipients of xenograft fragments of tumor tissue taken from a patient's surgical specimen. 
It is also worth noting that bioptic samples were not digested or disaggregated, in order to maintain the tumor microenvironment, which is crucial in terms of analyzing tumor behavior and the response to therapy. The protocol details a method for establishing zebrafish-based patient-derived xenografts (zPDXs) from primary solid tumor surgical resection. After screening by an anatomopathologist, the specimen is dissected using a scalpel blade. Necrotic tissue, vessels, or fatty tissue are removed and then chopped into 0.3 mm x 0.3 mm x 0.3 mm pieces. 
The pieces are then fluorescently labeled and xenotransplanted into the perivitelline space of zebrafish embryos. A large number of embryos can be processed at a low cost, enabling high-throughput in vivo analyses of the chemosensitivity of zPDXs to multiple anticancer drugs. Confocal images are routinely acquired to detect and quantify the apoptotic levels induced by chemotherapy treatment compared to the control group. The xenograft procedure has a significant time advantage, since it can be completed in a single day, providing a reasonable time window to carry out a therapeutic screening for co-clinical trials.

Preclinical models aim to advance the knowledge of cancer biology and predict treatment efficacy. This paper describes the generation of zebrafish-based patient-derived xenografts (zPDXs) with tumor tissue fragments. The zPDXs were treated with chemotherapy, the therapeutic effect of which was assessed in terms of cell apoptosis of the transplanted tissue.

Istituzione di xenotrapianti derivati da pazienti zebrafish da cancro del pancreas per test di chemiosensibilità

Cancer is one of the main causes of death worldwide, and the incidence of many types of cancer continues to increase. Much progress has been made in terms ...

Utilizzo delle larve di pesce zebra per studi efficienti sui tumori in vivo

A Simple, Rapid, and Effective Method for Tumor Xenotransplantation Analysis in Transparent Zebrafish Embryos

In vivo studies of tumor behavior are a staple of cancer research; however, the use of mice presents significant challenges in cost and time. Here, we present larval zebrafish as a transplant model that has numerous advantages over murine models, including ease of handling, low expense, and short experimental duration. Moreover, the absence of an adaptive immune system during larval stages obviates the need to generate and use immunodeficient strains. While established protocols for xenotransplantation in zebrafish embryos exist, we present here an improved method involving embryo staging for faster transfer, survival analysis, and the use of flow cytometry to assess disease burden. Embryos are staged to facilitate rapid cell injection into the yolk of the larvae and cell marking to monitor the consistency of the injected cell bolus. After injection, embryo survival analysis is assessed up to 7 days post injection (dpi). Finally, disease burden is also assessed by marking transferred cells with a fluorescent protein and analysis by flow cytometry. Flow cytometry is enabled by a standardized method of preparing cell suspensions from zebrafish embryos, which could also be used in establishing the primary culture of zebrafish cells. In summary, the procedure described here allows a more rapid assessment of the behavior of tumor cells in vivo with larger numbers of animals per study arm and in a more cost-effective manner.

Autore in primo piano: Avanzamento delle terapie antitumorali utilizzando lo xenotrapianto tumorale nel pesce zebra

We describe a protocol for xenotransplantation into the yolk of transparent zebrafish embryos that is optimized by a simple, rapid staging method. Post-injection analyses include survival and assessing the disease burden of xenotransplanted cells by flow cytometry.

Un metodo semplice, rapido ed efficace per l'analisi dello xenotrapianto tumorale in embrioni trasparenti di zebrafish

In vivo studies of tumor behavior are a staple of cancer research; however, the use of mice presents significant challenges in cost and time. Here, we ...

Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has transparent embryos and rapid external development. Zebrafish embryos can, therefore, also be used for the rapid evaluation of toxicity of the drugs that are precious and available in small quantities. In the present article, a method for the efficient screening of the toxicity of chemical compounds using 1-5-day post fertilization embryos is described. The embryos are monitored by stereomicroscope to investigate the phenotypic defects caused by the exposure to different concentrations of compounds. Half-maximal lethal concentrations (LC50) of the compounds are also determined. The present study required 3-6 mg of an inhibitor compound, and the whole experiment takes about 8-10 h to be completed by an individual in a laboratory having basic facilities. The current protocol is suitable for testing any compound to identify intolerable toxic or off-target effects of the compound in the early phase of drug discovery and to detect subtle toxic effects that may be missed in the cell culture or other animal models. The method reduces procedural delays and costs of drug development.

Zebrafish embryos are used for evaluating the toxicity of chemical compounds. They develop externally and are sensitive to chemicals, allowing detection of subtle phenotypic changes. The experiment only requires a small amount of compound, which is directly added to the plate containing embryos, making the testing system efficient and cost-effective.

Rapida valutazione della tossicità dei composti chimici utilizzando gli embrioni di pesce zebra

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has ...

Valutazione preclinica della bioattività dell'OT48 di cumarina anticancro di sferoidi, Colony Assays formazione e xenotrapianti di Zebrafish

Riepilogo

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Testare la capacità vascolare invasiva delle cellule tumorali in Zebrafish (

Screening per Modificatori melanoma utilizzando un modello Zebrafish Tumore autoctone

Screening farmacologico del paziente primario - Tumore derivato Xenotrapianto nel pesce zebra

Generazione di xenografti larvali zebrafish e analisi del comportamento tumorale

Stabilire sferoidi 3-dimensionali da campioni tumorali derivati dal paziente e valutare la loro sensibilità ai farmaci

Istituzione di xenotrapianti derivati da pazienti zebrafish da cancro del pancreas per test di chemiosensibilità

Un metodo semplice, rapido ed efficace per l'analisi dello xenotrapianto tumorale in embrioni trasparenti di zebrafish

Un metodo semplice, rapido ed efficace per l'analisi dello xenotrapianto tumorale in embrioni trasparenti di zebrafish

Un metodo semplice, rapido ed efficace per l'analisi dello xenotrapianto tumorale in embrioni trasparenti di zebrafish

Rapida valutazione della tossicità dei composti chimici utilizzando gli embrioni di pesce zebra