Name: preclinical assessment of the bioactivity of the anticancer coumarin ot48 by spheroids, colony formation assays, and zebrafish xenografts
Uploaded: 2018-06-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts at JoVE.com

서울대에서 연구는 종양 Microenvironment 글로벌 핵심 연구 센터 (GCRC) 그랜트, [허가 번호 2011-0030001];에 대 한 한국 개 국립 연구 재단 (NRF)에 의해 지원 됩니다. 서울 국가 대학 연구 보조금 및 두뇌 한국 (BK21) 프로그램 플러스.

1. 식민지 대형 분석 실험
<ol><li>20000 셀/cm2 RPMI1640의 15 ml에서의 농도에서 문화 A549 세포 세포 배양 10 보충 %FBS (태아 둔감 한 혈 청)과 37 ° C, 5% CO2CO2 배양 기에서 75 c m2 플라스 크에 1% 항생제.</li>
	<li>실험의 날에는 hemocytometer를 사용 하 여 셀 농도 결정 합니다. 1.5 mL microcentrifuge 튜브에서 7 분 400 x g 에서 원심 분리 하 여 50, 000 셀을 수집 하 고 다시 1 x 살 균 PBS (인산 염 버퍼) 1.5 mL 튜브에의 100 µ L에서 세포를 일시 중단.</li>
	<li>multipipette와 함께 15 mL 튜브에서 반 고체 스 기반 매체 (MCBM)의 1.1 mL을 분배. 각 조건에 대 한 튜브를 준비 합니다.</li>
	<li>P200 micropipette를 사용 하 여 MCBM의 1.1 ml FBS의 110 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>1, 000 셀/mL에서 씨앗 셀입니다. 재고 솔루션 (50000 셀 1 x PBS의 100 µ L)에서 2.4 µ L 세포 현 탁 액의 수집 P2 micropipette 사용 하 고 10% 보충 하는 MCBM의 1.1 mL에 추가 FBS.</li>
	<li>셀, 추가한 후 소용돌이 MCBM와 셀을 잘 혼합 하 최고 속도로 그들을 수직으로 잡고 1 분에 대 한 관.</li>
	<li>테스트 화합물 (OT48 혼자 또는 조합에서 A1210477으로)을 추가 합니다. 제어로 별도 튜브 준비 용 매 사용에 대 한 (여기 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)). 각 조건에 대 한 추가 볼륨과 화합물의 농도 따라 용 컨트롤 용 매 화합물, 테스트의 희석에 대 한 사용 하는 용 매로 인 한 부작용에 대 한 평가의 가장 높은 농도 포함 됩니다.</li>
	<li>1 분 동안 소용돌이 튜브.</li>
	<li>각 분석 결과 대 한 12 음 셀 문화 접시의 센터 P1000 micropipette와 혼합물의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>살 균 물의 1 mL와 함께 빈 우물 또는 습도 안정 시키기 위해 1 x PBS를 채우십시오.</li>
	<li>37 ° C, 5% CO2배양 기에서 10 일 동안 배양 배지를 품 어.</li>
	<li>10 일 후 부 화, 각 잘 1 mg/mL의 최종 농도 도달 하는 MTT (methylthiazolyldiphenyl tetrazolium 브 로마 이드) 재고 솔루션 (5 mg/mL)의 200 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>37 ° C, 5% CO2배양 기에서 10 분을 품 어. 실행 가능한 식민지 바뀝니다 바이올렛.</li>
	<li>흰색 배경 플레이트 (라스 화이트 디 아 트레이)를 사용 하 여 디지털 카메라를 사용 하 여 이미지를 캡처하십시오. 다음 설정을 사용 합니다: 방법, 디지털화; 노출 유형, 정밀; 노출 시간, 수동, 1 초; 감도/해상도, 높은 해상도입니다. Tiff 형식에 이미지를 저장 합니다.</li>
	<li>ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 가능한 식민지를 계량. 선택 메뉴 "이미지 | 유형 | 8 비트 "입니다. 선택 메뉴 "조정 | 임계값 "입니다. 제어 임계값을 설정 하 고 모든 조건;에 대 한 일정 하 게 유지 선택 메뉴 "분석 | 입자 분석 ". 데이터를 저장 하 고 그래픽 표현에 대 한 통계 소프트웨어와 분석.</li>
</ol>2. 회전 타원 체 형성 분석 결과
<ol><li>10 %FBS 1% 항생제로 보충 RPMI 1640 매체의 15 mL와 75 c m2 플라스 크에 20000 셀/c m2 의 농도에 문화 A549 세포.</li>
	<li>실험 당일 준비는 96 U-바닥판 잘.</li>
	<li>이미 관심 (여기 50 µ M OT48) 및 A1210477의 20 µ M의 화합물을 포함 하는 우물으로 접시 10, 000 셀입니다. 세포 배양의 100 µ L 최종 볼륨을 조정 합니다. 그대로 외부 경계와 균일 한 spheroids를 형성 하는 세포의 수는 양식 spheroids에 적절 한 간주 됩니다.</li>
	<li>37 ° C, 5% CO2에 인큐베이터에서 3 일 동안 품 어.</li>
	<li>3 일 후 부 화, 4 x 확대와 함께 가벼운 현미경을 사용 하 여 spheroids의 이미지를 캡처하십시오.</li>
</ol>3. 제 브라가 종이 식 분석 결과
참고:이 기술 접근 회로도 (그림 1)으로 시각 이다.
<ol><li>
재고 시 약의 준비
	<ol>
<li>Danieau의 솔루션 x 30의 1 리터를 준비: 1740 mM NaCl, 21 m KCl m, 12 mM MgSO4∙7H2O, 18 m m Ca (3)2및 150 mM HEPES. 7.6 pH 미터를 사용 하 여 버퍼의 pH를 조정 합니다.</li>
		<li>1% (50 x) tricaine 솔루션 준비: 20mg 에틸 3-aminobenzoate methanesulfonate (tricaine) 2 mL의 증류수에 녹.</li>
		<li>1% 페 놀 레드-PBS 솔루션 준비: 198 µ L의 1.5 µ L 튜브의 소독된 PBS 솔루션 들을 페 놀 레드 나트륨 소금 솔루션의 추가 2 µ L.</li>
		<li>3% 스 준비: Danieau의 솔루션 x 1의 100 mL에 스의 3 세대를 추가.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Zebrafish 계란 생산 및 부 화
	<ol>
<li>별도 한 여성 및 파티션 탱크에 한 남성 zebrafish 어둠 속에서 28.5 ° C에서 UV 살 균 및 필터링 된 수돗물으로 가득합니다. 분리의 24 h 후 물고기 짝짓기를 시작 하는 두 남녀의 혼합. 짝짓기 탱크의 수정 된 난 자 신선한 Danieau 솔루션의 5 mL를 포함 하는 배양 접시에 전송.</li>
		<li>세 번 Danieau의 솔루션의 5 mL와 함께 계란을 세척. 세척, 피 펫 및 신선한 솔루션의 5 mL에 계란을 발음 신중 하 게. 8 h 28.5 ° c.에 대 한 품 어<ol>
<li>Danieau의 솔루션에 외피의 8 h 후 0.03 %1-페 닐-2-thiourea 착 색을 억제 (PTU)를 포함 하는 Danieau의 솔루션을 변경 합니다. 오염을 방지 하기 위해 불투명 계란 (unfertilized 또는 포함 미 개발된 태아) 밖으로 정렬.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
태아 dechorionation
	<ol>
<li>24 시간 수정 (hpf), dechorionate zebrafish 태아 날카로운 집게를 사용 하 여 게시할 수 있습니다. 0.03 %Danieau 솔루션에서 해칭 태아를 품 어 48까지 28.5 ° C에서 통해 hpf.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
복합 치료 세포 준비
	<ol>
<li>20000 셀/cm2 25 cm2 문화 플라스 크 씨 A549 세포. 뿌리기의 24 h 후 추가 화합물 (50 µ M에서 여기 OT48 및 또는 20 µ M에서 A1210477) 37 ° C, 5% CO2배양 기에서 24 h에 대 한. 하지만 세포 죽음으로 그들을 저지 하는 세포의 생존 능력을 유지 하기 위해 각 화합물에 대 한 치료 시간을 설정 합니다. 이 시간은 개별적으로 설정 해야 포인트 기준 세포 생존 능력, 형태학 및 분자 마커.</li>
		<li>치료의 끝 전에 2 h, 얼룩 세포 형광 셀 추적기의 4 µ M로 37 ° C, 5% CO2CM Dil 염료. 외피의 2 시간 후 0.05% 트립 신-EDTA, 셀 trypsinize 그리고 106 세포 주입 전에 페 놀 레드-PBS 솔루션의 50 µ L 희석.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
이 종이 식 형성에 대 한 암 세포의 마이크로 주입
	<ol>
<li>그들은 한 접시에 정착 될 때까지 5 분 0.02 %tricaine 솔루션에서 zebrafish를 anesthetize.</li>
		<li>(외부 직경 (OD) 유리 모 세관) 1.0 m m는 micropipette 끌어당기는 당겨 (설정 프로그램: p: 300, 열: 260, 당겨: 60, 벨: 50, 및 시간: 200). 주사기는 날카로운 가장자리를 생산 하는 microcapillary를 잘라. 로드 셀/페 놀 레드의 20 µ L 함께 microcapillaries-PBS 솔루션. 사출 압력을 설정 하 고 하는 걸 2 시간 주입 당 nL.</li>
		<li>주사 6 ~ 10 여 른 골목에 100-200 셀 주사 3 ~ 5 주사 통해 nL. 주입 후 물고기를 통해 솔루션을 포함 하는 신선한 Danieau 솔루션의 5 mL에 10 ~ 30 분에 대 한 복구할 수 있습니다. 디스패치 통해 솔루션을 포함 하는 Danieau의 솔루션의 1 mL 24-잘 접시에는 생선과 28.5 ° c.에서 72 h에 대 한 품 어</li>
		<li>외피의 72 h 후 물고기 0.02 %tricaine 솔루션에서 anesthetize 고 스 3%의 하락을 가진 유리 슬라이드에 고정. 620 750의 파장에서 형광 현미경 검사 법에 의해 5 x 사진을 찍어 nm.</li>
		<li>ImageJ 소프트웨어에 의해 형광 종양의 크기를 계량. 선택 메뉴 "분석 | 측정 "입니다. 형광 신호에 해당 하는 값을 저장 하 고 그래픽 표현에 대 한 통계 소프트웨어와 분석.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Giancotti, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deregulation+of+cell+signaling+in+cancer.">Deregulation of cell signaling in cancer.</a> FEBS Letters. 588 (16), 2558-2570 (2014).</li><li>Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioprinting+for+cancer+research.">Bioprinting for cancer research.</a> Trends in Biotechnology. 33 (9), 504-513 (2015).</li><li>Santo, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+in+3D+in+vitro+tumor+models:+overcoming+current+pitfalls+of+efficacy+read-outs.">Drug screening in 3D in vitro tumor models: overcoming current pitfalls of efficacy read-outs.</a> Biotechnology Journal. 12 (1), (2017).</li><li>Tanner, K., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+3D+culture+models+of+cancer.">Beyond 3D culture models of cancer.</a> Science Translational Medicine. 7 (283), 283ps289 (2015).</li><li>Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+cell+culture:+a+review+of+current+approaches+and+techniques.">3D cell culture: a review of current approaches and techniques.</a> Methods in Molecular Biology. 695, 1-15 (2011).</li><li>Talhi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bis(4-hydroxy-2H-chromen-2-one):+synthesis+and+effects+on+leukemic+cell+lines+proliferation+and+NF-kappaB+regulation.">Bis(4-hydroxy-2H-chromen-2-one): synthesis and effects on leukemic cell lines proliferation and NF-kappaB regulation.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 22 (11), 3008-3015 (2014).</li><li>Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonogenic+assay+of+cells+in+vitro.">Clonogenic assay of cells in vitro.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).</li><li>Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Tumor+Models:+Advantages,+Disadvantages,+Variables,+and+Selecting+the+Right+Platform.">In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).</li><li>Lee, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytostatic+hydroxycoumarin+OT52+induces+ER/Golgi+stress+and+STAT3+inhibition+triggering+non-canonical+cell+death+and+synergy+with+BH3+mimetics+in+lung+cancer.">Cytostatic hydroxycoumarin OT52 induces ER/Golgi stress and STAT3 inhibition triggering non-canonical cell death and synergy with BH3 mimetics in lung cancer.</a> Cancer Letters. 416, 94-108 (2018).</li><li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+to+the+soft-agar+assay+that+permits+high-throughput+drug+and+genetic+screens+for+cellular+transformation.">Alternative to the soft-agar assay that permits high-throughput drug and genetic screens for cellular transformation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5708-5713 (2015).</li><li>Spoerri, L., Beaumont, K. A., Anfosso, A., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Cell+Cycle+Imaging+in+a+3D+Cell+Culture+Model+of+Melanoma.">Real-Time Cell Cycle Imaging in a 3D Cell Culture Model of Melanoma.</a> Methods in Molecular Biology. 1612, 401-416 (2017).</li><li>Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, F., Weninger, W., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging-+and+Flow+Cytometry-based+Analysis+of+Cell+Position+and+the+Cell+Cycle+in+3D+Melanoma+Spheroids.">Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53486 (2015).</li><li>Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+cell+culture+techniques+for+cancer+drug+discovery.">Advanced cell culture techniques for cancer drug discovery.</a> Biology (Basel). 3 (2), 345-367 (2014).</li><li>Ji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dialkyl+resorcinol+stemphol+disrupts+calcium+homeostasis+to+trigger+programmed+immunogenic+necrosis+in+cancer.">The dialkyl resorcinol stemphol disrupts calcium homeostasis to trigger programmed immunogenic necrosis in cancer.</a> Cancer Letters. 416, 109-123 (2018).</li></ol>

저자는 공개 없다.

MCBM으로 얻은 식민지 형성의 속도 셀 형식에 따라 달라 집니다. 일반적으로, 비 부착 한 세포에 대 한 식민지의 수는 부착 세포에 비해 훨씬 높은. 우리가 관찰 A549 세포 10 일 후 30 ~ 40 식민지를 형성 했다. 이전 우리 보고 다른 백혈병 세포에 대 한 식민지의 수 200 ~ 2509사이입니다. 우리의 결과 OT48 혼자 혼자 식민지의 수의 상당한 감소를 생성 하지 않았다 보여주었다. 그러나, BH3 ?...

암은 세포 돌연변이 의해 발생 하 고 결과적으로 생 화 확 적인 신호 경로 통제 세포 분열 및 세포 죽음에 저항을 트리거링 혼란 된다. 종양 소화, 신경, 순환 시스템 및 이후에 이웃 조직1의 생리 기능을 방해합니다. 광범위 한 연구 노력에도 불구 하 고 암2세계 가장 널리 퍼진 생명이 질병에 남아 있다. 정밀 의학 미래 암 치료의 기초로 인식 하고있다. 임상 결과 개선 하기 위해 기존 약물과 함께에서 새로운 분자 엔티티를 정기적으로 테스트 합니다.
그러나, 새로운 효율적인 표적으로 한 치료의 개발과 관련 된 중요 한 제한 중 약물 노출3의 정확한 생물 학적 결과 시뮬레이션 하기 위해 일반적으로 사용 되는 분석의 실패 이다. 암 약물 발견 여전히 대부분 암 세포 선에서4임상 시험 확인 하기 어려운 차원 단층 문화에서 교양 치료제의 효능을 테스트에 의존 합니다. 따라서, 더 나은 종양 vivo에서5의 기본 기능을 모방 하는 더 나은 암 모델을 개발 하는 관심이 있다. 최근 몇 년 동안, 3D 문화 모델에 증가 관심 3D 종양 모델5생산 향상된 방법론의 개발에 결과.
여기, 우리는 깊이 비보에 분석 실험에 함께 더 전에 BH3 mimetics hydroxycoumarin OT486 의 힘의 이해를 향상 시킬 수 있도록 세 개의 다른 3D 셀 문화 기술로 접근을 제시. 우리의 방법은 식민지 및 SFAs는 vivo에서 종양 형성에 따라 검사 추가 폐 암 세포에서 OT48 및 BH3 mimetics의 조합의 효능을 확인 하 고 생활에서 암 진행 모니터링 zebrafish 모델에 결합의 구성 유기 체입니다.
식민지 대형 분석 실험 정기적으로 모두 고체 뿐만 아니라 조 혈 암에 대 한 항 암 제의 효능을 평가 하는 데 사용 됩니다. 분석 결과 무한정 증식 하 고 식민지7을 형성 하는 세포의 능력을 결정 합니다. 셀의 능력을 형성 하는 식민지에는 항 암 제의 효과 수의 감소 및 식민지의 크기에 의해 결정 됩니다.
Spheroids 종양 모델 생체 외에서 나타내고 제 에이전트는 저가 심사 플랫폼 역할. Spheroids는에 성장 하는 셀의 집계 또는 3D 매트릭스에 포함 된. 이 접근은 마약 검사 및 종양 성장, 확산 및 면역 상호 작용8의 연구에 널리 사용 됩니다.
완전히 새로운 약물의 속성 이해, vivo에서 실험 설치류에 필수적 이다. 그러나,이 전통적인 메서드는 비용과 시간이 소요 됩니다. 최근 몇 년 동안, zebrafish (Danio rerio) 널리 공부 실험실 유기 체를 저렴 하 고 빠르게 인상 되었다. 종양은 zebrafish 대표 3D 셀 문화 접근에서 하지만 척추9의 vivo에서 설정 내에서 개발.
전부, 사용 여기 CFAs, SFAs zebrafish vivo에서 종양 형성 등 3 가지 3D 문화 접근 BH3 mimetics 함께에서 폐 암 A549 세포 모델에서 hydroxycoumarin OT48의 항 암 제 용량을 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Materials required for colony formation assays&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>37 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>30096</td><td>4 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1520-500</td><td>-20 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Lonza</td><td>17-602E</td><td>-20 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>Cell culture flask T75</td><td>SPL</td><td>70075</td><td>RT</td></tr><tr><td>PBS solution</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.02</td><td>RT</td></tr><tr><td>1.5ml tube</td><td>Extragene</td><td>Tube-170-C</td><td>RT</td></tr><tr><td>15 ml tube</td><td>Hyundai Micro</td><td>H20015</td><td>RT</td></tr><tr><td>12 well plate</td><td>SPL</td><td>30012</td><td>RT</td></tr><tr><td>MethoCult</td><td>StemCell technologies</td><td>4230</td><td>-20 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT powder)</td><td>Sigma</td><td>M5622</td><td>4 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>LAS4000</td><td>GE Healthcare Technologies</td><td></td><td>RT</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials required for spheroid formation assay&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>37 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>30096</td><td>4 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1520-500</td><td>-20 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Lonza</td><td>17-602E</td><td>-20 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>Cell culture flask T75</td><td>SPL</td><td>70075</td><td>RT</td></tr><tr><td>PBS solution</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.02</td><td>RT</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25-300-054</td><td>4 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>Corning costar ultra low attachemnt 96 well plate</td><td>Corning</td><td>3474</td><td>RT</td></tr><tr><td>Microscopy</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100</td><td>RT</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials required for zebrafish xenografts&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>37 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>30096</td><td>4 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1520-500</td><td>-20 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Lonza</td><td>17-602E</td><td>-20 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>Cell culture flask T25</td><td>SPL</td><td>70025</td><td>RT</td></tr><tr><td>Cell culture flask T75</td><td>SPL</td><td>70075</td><td>RT</td></tr><tr><td>Cell culture flask T175</td><td>SPL</td><td>71175</td><td>RT</td></tr><tr><td>1.5ml tube</td><td>Extragene</td><td>Tube-170-C</td><td>RT</td></tr><tr><td>24 well plate</td><td>SPL</td><td>30024</td><td>RT</td></tr><tr><td>Petridish</td><td>SPL</td><td>10100</td><td>RT</td></tr><tr><td>PBS solution</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.02</td><td>RT</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25-300-054</td><td>4 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71382</td><td>RT</td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>RT</td></tr><tr><td>Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2773</td><td>RT</td></tr><tr><td>Calcium nitrate tetrahydrate (Ca(NO3)2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1396</td><td>RT</td></tr><tr><td>HEPES solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td>RT</td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>RT</td></tr><tr><td>Phenol Red solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td>RT</td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0512</td><td>RT</td></tr><tr><td>1-phenyl-2-thiourea (PTU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td>RT</td></tr><tr><td>CM-Dil dye</td><td>Invitrogen</td><td>C7001</td><td>-20 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>Glass capillary</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW 100F-4</td><td>RT</td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Shutter instrument, USA</td><td>P-97</td><td>RT</td></tr><tr><td>Micro injector</td><td>World Precision Instruments</td><td>PV820</td><td>RT</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>KOVAX</td><td>1ml</td><td>RT</td></tr><tr><td>Micro loader</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>RT</td></tr><tr><td>Glass slide</td><td>Marienfeld</td><td>HSU-1000612</td><td>RT</td></tr><tr><td>Fluorescence microscopy</td><td>Leica</td><td>DE/DM 5000B</td><td>RT</td></tr></tbody></table>

preclinical assessment of the bioactivity of the anticancer coumarin ot48 by spheroids, colony formation assays, and zebrafish xenografts

생체 외에서 그리고 vivo에서 새로운 치료제의 전 임상 심사 암 약물 발견에 필수적인 도구입니다. 비록 인간의 암 세포 선 2 차원 (차원) 단층 세포 배양에서 치료 화합물에 대응, 더 순수 관련 모델에서 약물의 효능을 이해 하 3 차원 배양 시스템 개발 되었다. 최근 몇 년 동안, 패러다임의 변화는 3D 문화 시스템, 더 정확 하 게 종양 microenvironment를 흉내 낸 새로운 분자의 힘을 확인 하기 위해 전 임상 연구에서 관찰 되었다. 이러한 시스템 보다 생리 적으로 관련 된 방식으로 질병 상태를 특성화 하 고 더 나은 기계적 통찰력 및 주어진된 분자의 약리 효능을 이해 하는 데 도움이. 또한, 암 모델 vivo에서 개선 추세와 함께 zebrafish vivo에서 종양의 형성을 평가 하 고 치료제의 효과 연구 하는 중요 한 척추 모델로 떠오르고 있다. 여기, 우리 조사 hydroxycoumarin OT48의 치료 효능 하거나 폐 암 세포 라인 A549 BH3 mimetics와 함께 식민지 대형 분석 실험 (CFA), 회전 타원 체 형성 분석 결과 (SFA) 등 세 가지 다른 3D 문화 시스템을 사용 하 여 및 zebrafish xenografts vivo에서 .

그림 2, 폐암 A549 했다 시드 MCBM에서 식민지를 형성 하 OT48와 치료 후 또는 표시 농도에서 BH3 모방 A1210477와 선 세포. 결과 조합 크게 감소 번호, 크기 및 식민지의 총 면적 외피의 10 일 후에 나타났다.
그림 3에서는 A549 세포 BH3 모방 A1210477와 혼자 또는 조합에서 OT48로 치료 했다 고 양?...

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Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts

Spheroids, 식민지 대형 분석 실험, 그리고 Zebrafish Xenografts 제 Coumarin OT48의 Bioactivity의 전 임상 평가

여기, 선물이 3D 문화와 제 브라를 사용 하 여 항 암 제 coumarins의 전 임상 심사.

In vitro and in vivo pre-clinical screening of novel therapeutic agents are an essential tool in cancer drug discovery. Although human cancer cell lines ...

preclinical-assessment-bioactivity-anticancer-coumarin-ot48-spheroids

Research

JoVE Journal

Cancer Research

8.3K 조회수.  Seoul National University. 여기, 선물이 3D 문화와 제 브라를 사용 하 여 항 암 제 coumarins의 전 임상 심사.

비디오: Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts

Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish (Danio Rerio)

Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression. Traditional in vitro models of cancer cell invasion of endothelia typically lack the fluid dynamics that invading cells are otherwise exposed to in vivo. However, in vivo systems such as mouse models, though more physiologically relevant, require longer experimental timescales and present unique challenges associated with monitoring and data analysis. Here we describe a zebrafish assay that seeks to bridge this technical gap by allowing for the rapid assessment of cancer cell vascular invasion and extravasation. The approach involves injecting fluorescent cancer cells into the precardiac sinus of transparent 2-day old zebrafish embryos whose vasculature is marked by a contrasting fluorescent reporter. Following injection, the cancer cells must survive in circulation and subsequently extravasate from vessels into tissues in the caudal region of the embryo. Extravasated cancer cells are efficiently identified and scored in live embryos via fluorescence imaging at a fixed timepoint. This technique can be modified to study intravasation and/or competition amongst a heterogeneous mixture of cancer cells by changing the injection site to the yolk sac. Together, these methods can evaluate a hallmark behavior of cancer cells and help uncover mechanisms indicative of malignant progression to the metastatic phenotype.

Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish Danio Rerio

This method utilizes zebrafish embryos to efficiently test the vascular invasive ability of cancer cells. Fluorescent cancer cells are injected into the precardiac sinus or yolk sac of developing embryos. Cancer cell vascular invasion and extravasation is assessed via fluorescence microscopy of the tail region 24 to 96 hr later.

Zebrafish의에서 암 세포의 혈관 침습 능력을 (테스트<em&gt; 다니오 레 리오</em&gt;)

Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression.  Traditional in vitro models of cancer cell invasion of ...

연구

암 연구학

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Genomic studies of human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered in tumors1,2,3. A challenge arising from these studies is that many genes are altered, and it can be difficult to distinguish genetic alterations that drove tumorigenesis from that those arose incidentally during transformation. To draw this distinction it is beneficial to have an assay that can quantitatively measure the effect of an altered gene on tumor initiation and other processes that enable tumors to persist and disseminate. Here we present a rapid means to screen large numbers of candidate melanoma modifiers in zebrafish using an autochthonous tumor model4 that encompasses steps required for melanoma initiation and maintenance. A key reagent in this assay is the miniCoopR vector, which couples a wild-type copy of the mitfa melanocyte specification factor to a Gateway recombination cassette into which candidate melanoma genes can be recombined5. The miniCoopR vector has a mitfa rescuing minigene which contains the promoter, open reading frame and 3'-untranslated region of the wild-type mitfa gene. It allows us to make constructs using full-length open reading frames of candidate melanoma modifiers. These individual clones can then be injected into single cell Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf)zebrafish embryos. The miniCoopR vector gets integrated by Tol2-mediated transgenesis6 and rescues melanocytes. Because they are physically coupled to the mitfa rescuing minigene, candidate genes are expressed in rescued melanocytes, some of which will transform and develop into tumors. The effect of a candidate gene on melanoma initiation and melanoma cell properties can be measured using melanoma-free survival curves, invasion assays, antibody staining and transplantation assays.

A rapid way to screen for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model is presented. It takes advantage of the miniCoopR vector which allows for expression of candidate melanoma genes in melanocytes. A method to obtain melanoma-free survival curves, an invasion assay, a protocol for antibody staining of scale melanocytes and a melanoma transplantation assay are described.

Zebrafish Autochthonous 종양 모델을 사용하여 흑종 조절을위한 검사

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

의학

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the standard in the field, but zebrafish have emerged as an alternative model with several advantages, including the ability for high-throughput and low-cost drug screening. Zebrafish also allow for in vivo drug screening with large replicate numbers that were previously only obtainable with in vitro systems. The ability to rapidly perform large scale drug screens may open up the possibility for personalized medicine with rapid translation of results back to clinic. Zebrafish xenograft models could also be used to rapidly screen for actionable mutations based on tumor response to targeted therapies or to identify new anti-cancer compounds from large libraries. The current major limitation in the field has been quantifying and automating the process so that drug screens can be done on a larger scale and be less labor-intensive. We have developed a workflow for xenografting primary patient samples into zebrafish larvae and performing large scale drug screens using a fluorescence microscope equipped imaging unit and automated sampler unit. This method allows for standardization and quantification of engrafted tumor area and response to drug treatment across large numbers of zebrafish larvae. Overall, this method is advantageous over traditional cell culture drug screening as it allows for growth of tumor cells in an in vivo environment throughout drug treatment, and is more practical and cost-effective than mice for large scale in vivo drug screens.

Zebrafish xenograft models allow for high-throughput drug screening and fluorescent imaging of human cancer cells in an in vivo microenvironment. We developed a workflow for large scale, automated drug screening on patient-derived leukemia samples in zebrafish using an automated fluorescence microscope equipped imaging unit.

제브라피시의 1차 환자 유래 종양 이종이식의 약물 스크리닝

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly visualizing the response to anti-cancer therapies (chemo, radiotherapy, and biologicals), angiogenesis and metastasis with single cell resolution, places the zebrafish xenograft model as a top choice to develop preclinical studies.

The zebrafish larval xenograft assay presents several experimental advantages compared to other models, but probably the most striking is the reduction of size scale and consequently time. This reduction of scale allows single cell imaging, the use of a relatively low number of human cells (compatible with biopsies), medium-high-throughput drug screenings, but most importantly enables a significant reduction of the time of the assay. All these advantages make the zebrafish xenograft assay extremely attractive for future personalized medicine applications.

Many zebrafish xenograft protocols have been developed with a wide diversity of human tumors; however, a general and standardized protocol to efficiently generate zebrafish larval xenografts is still lacking. Here we provide a step-by-step protocol, with tips to generate xenografts and guidelines for tumor behavior analysis, whole-mount immunofluorescence, and confocal imaging quantification.

Here, we provide a step-by-step protocol, with tips to generate xenografts and guidelines for tumor behavior analysis, whole-mount immunofluorescence, and confocal imaging quantification.

제브라피시 애벌레 제노이식 및 종양 행동 분석의 생성

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a lack of clinical efficacy. This high failure rate illuminates the inability of the current preclinical models to predict clinical efficacy, mainly due to their inadequacy in reflecting tumor heterogeneity and the tumor microenvironment. These limitations can be addressed with 3-dimensional (3D) culture models (spheroids) established from human tumor samples derived from individual patients. These 3D cultures represent real-world biology better than established cell lines that do not reflect tumor heterogeneity. Furthermore, 3D cultures are better than 2-dimensional (2D) culture models (monolayer structures) since they replicate elements of the tumor environment, such as hypoxia, necrosis, and cell adhesion, and preserve the natural cell shape and growth. In the present study, a method was developed for preparing primary cultures of cancer cells from individual patients that are 3D and grow in multicellular spheroids. The cells can be derived directly from patient tumors or patient-derived xenografts. The method is widely applicable to solid tumors (e.g., colon, breast, and lung) and is also cost-effective, as it can be performed in its entirety in a typical cancer research/cell biology lab without relying on specialized equipment. Herein, a protocol is presented for generating 3D tumor culture models (multicellular spheroids) from primary cancer cells and evaluating their sensitivity to drugs using two complementary approaches: a cell-viability assay (MTT) and microscopic examinations. These multicellular spheroids can be used to assess potential drug candidates, identify potential biomarkers or therapeutic targets, and investigate the mechanisms of response and resistance.

The present protocol describes generating 3D tumor culture models from primary cancer cells and evaluating their sensitivity to drugs using cell-viability assays and microscopic examinations.

환자 유래 종양 샘플에서 3차원 스페로이드 설정 및 약물에 대한 민감도 평가

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Establishment of Zebrafish Patient-Derived Xenografts from Pancreatic Cancer for Chemosensitivity Testing

Cancer is one of the main causes of death worldwide, and the incidence of many types of cancer continues to increase. Much progress has been made in terms of screening, prevention, and treatment; however, preclinical models that predict the chemosensitivity profile of cancer patients are still lacking. To fill this gap, an in vivo patient-derived xenograft model was developed and validated. The model was based on zebrafish (Danio rerio) embryos at 2 days post fertilization, which were used as recipients of xenograft fragments of tumor tissue taken from a patient's surgical specimen. 
It is also worth noting that bioptic samples were not digested or disaggregated, in order to maintain the tumor microenvironment, which is crucial in terms of analyzing tumor behavior and the response to therapy. The protocol details a method for establishing zebrafish-based patient-derived xenografts (zPDXs) from primary solid tumor surgical resection. After screening by an anatomopathologist, the specimen is dissected using a scalpel blade. Necrotic tissue, vessels, or fatty tissue are removed and then chopped into 0.3 mm x 0.3 mm x 0.3 mm pieces. 
The pieces are then fluorescently labeled and xenotransplanted into the perivitelline space of zebrafish embryos. A large number of embryos can be processed at a low cost, enabling high-throughput in vivo analyses of the chemosensitivity of zPDXs to multiple anticancer drugs. Confocal images are routinely acquired to detect and quantify the apoptotic levels induced by chemotherapy treatment compared to the control group. The xenograft procedure has a significant time advantage, since it can be completed in a single day, providing a reasonable time window to carry out a therapeutic screening for co-clinical trials.

Preclinical models aim to advance the knowledge of cancer biology and predict treatment efficacy. This paper describes the generation of zebrafish-based patient-derived xenografts (zPDXs) with tumor tissue fragments. The zPDXs were treated with chemotherapy, the therapeutic effect of which was assessed in terms of cell apoptosis of the transplanted tissue.

화학감수성 검사를 위한 췌장암의 Zebrafish 환자 유래 이종이식편 구축

Cancer is one of the main causes of death worldwide, and the incidence of many types of cancer continues to increase. Much progress has been made in terms ...

효율적인 In Vivo 종양 연구를 위한 유충 제브라피시 활용

A Simple, Rapid, and Effective Method for Tumor Xenotransplantation Analysis in Transparent Zebrafish Embryos

In vivo studies of tumor behavior are a staple of cancer research; however, the use of mice presents significant challenges in cost and time. Here, we present larval zebrafish as a transplant model that has numerous advantages over murine models, including ease of handling, low expense, and short experimental duration. Moreover, the absence of an adaptive immune system during larval stages obviates the need to generate and use immunodeficient strains. While established protocols for xenotransplantation in zebrafish embryos exist, we present here an improved method involving embryo staging for faster transfer, survival analysis, and the use of flow cytometry to assess disease burden. Embryos are staged to facilitate rapid cell injection into the yolk of the larvae and cell marking to monitor the consistency of the injected cell bolus. After injection, embryo survival analysis is assessed up to 7 days post injection (dpi). Finally, disease burden is also assessed by marking transferred cells with a fluorescent protein and analysis by flow cytometry. Flow cytometry is enabled by a standardized method of preparing cell suspensions from zebrafish embryos, which could also be used in establishing the primary culture of zebrafish cells. In summary, the procedure described here allows a more rapid assessment of the behavior of tumor cells in vivo with larger numbers of animals per study arm and in a more cost-effective manner.

저자 스포트라이트: 제브라피시에서 종양 이종장기이식을 사용한 암 치료의 발전

We describe a protocol for xenotransplantation into the yolk of transparent zebrafish embryos that is optimized by a simple, rapid staging method. Post-injection analyses include survival and assessing the disease burden of xenotransplanted cells by flow cytometry.

투명 제브라피시 배아에서 종양 이종 이식 분석을 위한 간단하고 빠르며 효과적인 방법

In vivo studies of tumor behavior are a staple of cancer research; however, the use of mice presents significant challenges in cost and time. Here, we ...

Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has transparent embryos and rapid external development. Zebrafish embryos can, therefore, also be used for the rapid evaluation of toxicity of the drugs that are precious and available in small quantities. In the present article, a method for the efficient screening of the toxicity of chemical compounds using 1-5-day post fertilization embryos is described. The embryos are monitored by stereomicroscope to investigate the phenotypic defects caused by the exposure to different concentrations of compounds. Half-maximal lethal concentrations (LC50) of the compounds are also determined. The present study required 3-6 mg of an inhibitor compound, and the whole experiment takes about 8-10 h to be completed by an individual in a laboratory having basic facilities. The current protocol is suitable for testing any compound to identify intolerable toxic or off-target effects of the compound in the early phase of drug discovery and to detect subtle toxic effects that may be missed in the cell culture or other animal models. The method reduces procedural delays and costs of drug development.

Zebrafish embryos are used for evaluating the toxicity of chemical compounds. They develop externally and are sensitive to chemicals, allowing detection of subtle phenotypic changes. The experiment only requires a small amount of compound, which is directly added to the plate containing embryos, making the testing system efficient and cost-effective.

Zebrafish 배아를 이용한 화학 화합물의 독성에 대한 신속한 평가

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has ...

Spheroids, 식민지 대형 분석 실험, 그리고 Zebrafish Xenografts 제 Coumarin OT48의 Bioactivity의 전 임상 평가

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Zebrafish의에서 암 세포의 혈관 침습 능력을 (테스트

Zebrafish Autochthonous 종양 모델을 사용하여 흑종 조절을위한 검사

제브라피시의 1차 환자 유래 종양 이종이식의 약물 스크리닝

제브라피시 애벌레 제노이식 및 종양 행동 분석의 생성

환자 유래 종양 샘플에서 3차원 스페로이드 설정 및 약물에 대한 민감도 평가

화학감수성 검사를 위한 췌장암의 Zebrafish 환자 유래 이종이식편 구축

투명 제브라피시 배아에서 종양 이종 이식 분석을 위한 간단하고 빠르며 효과적인 방법

투명 제브라피시 배아에서 종양 이종 이식 분석을 위한 간단하고 빠르며 효과적인 방법

투명 제브라피시 배아에서 종양 이종 이식 분석을 위한 간단하고 빠르며 효과적인 방법

Zebrafish 배아를 이용한 화학 화합물의 독성에 대한 신속한 평가