Name: preclinical assessment of the bioactivity of the anticancer coumarin ot48 by spheroids, colony formation assays, and zebrafish xenografts
Uploaded: 2018-06-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts at JoVE.com

SNU Araştırma Kore MEST tümör Microenvironment küresel çekirdek Araştırma Merkezi (GCRC) Bursu, [grant numarası 2011-0030001]; tarafından Ulusal Araştırma Vakfı (NMG) tarafından desteklenmektedir Seul Ulusal Üniversitesi Araştırma Bursu ve beyin Kore (BK21) tarafından program artı.

1. koloni oluşumu deneyleri
<ol><li>Kültür A549 hücreleri 20.000 hücre/cm2 RPMI1640 15 ml bir konsantrasyon, hücre kültürü 10 ile desteklenmiş orta % FBS (Fetal sığır Serum) ve CO2 kuluçka CO237 ° C ve % 5, 75 cm2 şişeye %1 antibiyotik.</li>
	<li>Deneme günü, bir hemasitometre kullanarak hücre konsantrasyonu belirlemek. Santrifüjü 400 x g 1.5 mL microcentrifuge tüp içinde 7 min için de tarafından 50.000 hücreleri toplamak ve 1 x steril PBS (fosfat tamponlu tuz) 1,5 mL tüpler 100 µL hücrelerde yeniden askıya alma.</li>
	<li>15 mL tüpler bir multipipette ile yarı katı methylcellulose tabanlı Orta (MCBM) 1.1 mL dağıtmak. Bir tüp her koşul için hazırlayın.</li>
	<li>FBS 110 µL P200 micropipette kullanarak MCBM için 1.1 mL ekleyin.</li>
	<li>1000 hücre/mL, Tohum hücreleri. Hisse senedi çözüm (1 x PBS 100 µL 50.000 hücreleri) hücre süspansiyon, 2.4 µL toplamak bir P2 micropipette kullanarak ve MCBM % 10 ile desteklenmiş 1.1 mL için eklemek FBS.</li>
	<li>Hücreleri, ekledikten sonra girdap tüpler için 1dk onları tutan dikey olarak en yüksek hızda MCBM ve hücreler iyice karıştırın.</li>
	<li>Test bileşikler (OT48 tek başına veya birlikte A1210477 ile) ekleyin. Bir denetim olarak ayrı bir tüp hazırlamak için kullanılan çözücü (burada dimetil sülfoksit (DMSO)). Bileşikleri ve her koşul için eklenen hacim konsantrasyonu bağlı olarak, solvent denetim solvent testi bileşik, dilutions için çözücü tarafından kaynaklanan olumsuz etkileri için değerlendirmek için kullanılan en yüksek konsantrasyonu içerir.</li>
	<li>Girdap tüpler 1 dakika.</li>
	<li>Her tahlil için karışımı P1000 micropipette ile 1 mL merkezine de 12-şey hücre kültür plaka ekleyin.</li>
	<li>Boş wells ile 1 mL steril su veya nem stabilize etmek için 1 x PBS doldurun.</li>
	<li>Kültür plakaları bir kuluçka 37 ° C ve % 5 CO210 gün kuluçkaya.</li>
	<li>Kuluçka, 10 gün sonra 200 µL MTT (methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromür) hisse senedi çözümünün (5 mg/mL) 1 mg/mL nihai bir konsantrasyon ulaşmak için her şey için ekleyin.</li>
	<li>Kuluçka 37 ° C ve % 5 CO210 min kuluçkaya. Kalıcı koloniler dönecek violet.</li>
	<li>Beyaz arka plan plaka (LAS beyaz dia tepsi) kullanarak bir dijital kamera ile çekim. Kullanma ertesi gün koyma: Yöntem, dijital ortama; Pozlama türü, hassas; Çekim hızı, el kitabı, 1 saniye; Hassasiyet/çözünürlük, yüksek çözünürlüklü. Resmi TIFF formatında kaydedin.</li>
	<li>Kalıcı koloniler ImageJ yazılım kullanarak ölçmek. Seç menüsünü "görüntü | Türü | 8 bit". Seç menüsünü "ayarlama | Eşik". Eşik denetimine ayarlayın ve tüm koşulları için sabit tutmak; Seç menüsünü "Analyze | «««Analiz"parçacıkları. Verileri kaydetmek ve grafik olarak gösterilmesi için bir istatistik yazılım ile analiz.</li>
</ol>2. küresel oluşumu tahlil
<ol><li>Kültür A549 hücreleri 20.000 hücre/cm2 ' 75 cm2 şişeler bir konsantrasyon ile 15 mL RPMI 1640 orta % 10 FBS ve % 1 antibiyotik ile desteklenmiştir.</li>
	<li>Deneme günü, 96 hazırlamak de U-alt plaka.</li>
	<li>Bileşik faiz (OT48, burada 50 µM) ve/veya A1210477 20 µM içeren bir kuyuya plaka 10.000 hücre. Hücre kültür ortamının 100 µL için son ses düzeyini ayarlayın. Sağlam bir dış kenarlığı ile Tekdüzen pulcuklarının oluşturan hücreleri formu pulcuklarının için yeterli kabul edilir.</li>
	<li>Bir kuluçka 37 ° C'de ve % 5 CO23 gün kuluçkaya.</li>
	<li>Kuluçka 3 gün sonra 4 x büyütme ile hafif bir mikroskop kullanarak pulcuklarının görüntülerini yakalamak.</li>
</ol>3. zebra balığı Xenograft tahlil
Not: Bu teknik yaklaşım bir şematik (Şekil 1) görüntülenir.
<ol><li>
Hisse senedi reaktifler hazırlanması
	<ol>
<li>30 Danieau'nın çözüm x 1 L hazırlamak: 1740 mM NaCl, 21 mM KCl, 12 mM MgSO4∙7H2O, 18 mM Ca (NO3)2ve 150 mM HEPES. PH metre kullanarak 7,6 arabelleğe pH için ayarlayın.</li>
		<li>%1 (50 x) tricaine çözüm hazırlamak: 20 mg 2 mL distile su içinde etil 3-aminobenzoate methanesulfonate (tricaine) geçiyoruz.</li>
		<li>%1 fenol Red-PBS çözeltisi hazırlamak: fenol Red sodyum tuz solüsyonu 1,5 µL tüp içinde sterilize PBS çözümün 198 µL için Ekle 2 µL.</li>
		<li>%3 methylcellulose hazırlamak: 1 Danieau'nın çözüm x 100 ml methylcellulose 3 g ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Zebra balığı yumurta üretimi ve kuluçka
	<ol>
<li>Ayrı bir kadın ve bir erkek zebra balığı bir bölüm tank karanlıkta 28.5 ° C'de UV sterilize ve filtre uygulanmış musluk suyu ile dolu. Ayrılık 24 saat sonra balık çiftleşme başlatmak için her iki cinsiyette karıştırın. Döllenmiş yumurta çiftleşme tankından 5 mL taze Danieau'nın çözeltisi içeren bir Petri kabına aktarın.</li>
		<li>Yumurta 3 kez 5 mL Danieau'nın çözeltisi ile yıkayın. Yıkama için dikkatle yumurta bir pipet ve 5 mL taze çözüm de aktarmak ile Aspire edin. 28.5 ° C'de 8 h için kuluçkaya<ol>
<li>Kuluçka Danieau'nın çözüm içinde 8 h sonra %0,03 1-fenil-2-Tioüre (pigmentasyon inhibe PTU) içeren Danieau'nın eriyik-e doğru değiştirmek. Kontaminasyonu önlemek için opak yumurta (döllenmemiş veya içeren gelişmemiş embriyo) sıralamak.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Embriyo dechorionation
	<ol>
<li>24 saat sonrası döllenme (hpf), keskin forseps kullanarak dechorionate zebra balığı embriyo. Damızlık embriyo % 0.03 ile Danieau'nın çözümde kuluçkaya PTU 48 kadar 28.5 ° C'de hpf.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bileşik tedavi hücre hazırlık
	<ol>
<li>Tohum A549 hücreleri 20.000 hücre/cm2 25 cm2 kültür şişeler'de. Tohum 24 saat sonra bileşikler ekleyin (50 µM, burada OT48 ve ve/veya A1210477, 20 µM) bir kuluçka 37 ° C ve % 5 CO224 h için. Tedavi süresi her bileşik için hücrelerin canlılık korumak için ama onları hücre ölüme doğru işlemek için ayarlayın. Bu sefer noktası ihtiyaçlarını tek tek ayarlamak için hücre canlılığı, Morfoloji ve moleküler işaretleyiciler dayalı.</li>
		<li>2 h tedavi sonundan önce leke hücreleri floresan hücre izci 4 µM ile 37 ° C ve % 5 CO2CM-Dil boya. 2 h, kuluçka sonra % 0.05 tripsin-EDTA içeren hücreleri trypsinize ve fenol Red-PBS çözüm enjeksiyon önce 50 µL 106 hücrelerde sulandırmak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mikro-enjeksiyon xenograft oluşumu için kanser hücrelerinin
	<ol>
<li>Onlar bir agar plaka üzerinde sakinleşene kadar zebra balığı 5 min için %0,02 tricaine çözümünde anestezi.</li>
		<li>1.0 mm (dış çapı (OD) cam kapiller) tarafından bir micropipette çektirmenin çekin (Program ayarları: P: 300, ısı: 260, çekin: 60, VEL: 50 ve Saat: 200). Microcapillary bir keskin kenar üretmek için bir şırınga ile kesti. Yük microcapillaries hücre/fenol Red 20 µL ile-PBS çözüm. Ayarla enjeksiyon basıncı ve 2 dağıtmak için zaman nL enjeksiyon başına.</li>
		<li>100-200 hücreleri sarısı kesesi içine enjekte ederek 6 ila 10 tarafından enjekte nL 3-5 enjeksiyon yoluyla. Enjeksiyon sonra balık 10-30 dk için 5 mL taze Danieau'nın çözüm PTU solüsyon içeren kurtarmak izin. 1 mL PTU solüsyon içeren Danieau'nın çözeltisi ile 24-şey plakalar Merkez balık vardır ve 28.5 ° C'de 72 h için kuluçkaya</li>
		<li>72 h, kuluçka sonra balık %0.02 tricaine çözümünde anestezi ve % 3 methylcellulose bir damla ile bir cam slayt üzerinde hareketsiz. Bir dalga boyu 620-750, floresans mikroskobu tarafından 5 x fotoğraf çekmek nm.</li>
		<li>ImageJ yazılım tarafından floresan tümör boyutunu ölçmek. Seç menüsünü "Analyze | Ölçü birimi". Floresan sinyal karşılık gelen değerleri kaydetmek ve grafik olarak gösterilmesi için bir istatistik yazılım ile analiz.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Giancotti, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deregulation+of+cell+signaling+in+cancer.">Deregulation of cell signaling in cancer.</a> FEBS Letters. 588 (16), 2558-2570 (2014).</li><li>Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioprinting+for+cancer+research.">Bioprinting for cancer research.</a> Trends in Biotechnology. 33 (9), 504-513 (2015).</li><li>Santo, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+in+3D+in+vitro+tumor+models:+overcoming+current+pitfalls+of+efficacy+read-outs.">Drug screening in 3D in vitro tumor models: overcoming current pitfalls of efficacy read-outs.</a> Biotechnology Journal. 12 (1), (2017).</li><li>Tanner, K., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+3D+culture+models+of+cancer.">Beyond 3D culture models of cancer.</a> Science Translational Medicine. 7 (283), 283ps289 (2015).</li><li>Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+cell+culture:+a+review+of+current+approaches+and+techniques.">3D cell culture: a review of current approaches and techniques.</a> Methods in Molecular Biology. 695, 1-15 (2011).</li><li>Talhi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bis(4-hydroxy-2H-chromen-2-one):+synthesis+and+effects+on+leukemic+cell+lines+proliferation+and+NF-kappaB+regulation.">Bis(4-hydroxy-2H-chromen-2-one): synthesis and effects on leukemic cell lines proliferation and NF-kappaB regulation.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 22 (11), 3008-3015 (2014).</li><li>Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonogenic+assay+of+cells+in+vitro.">Clonogenic assay of cells in vitro.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).</li><li>Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Tumor+Models:+Advantages,+Disadvantages,+Variables,+and+Selecting+the+Right+Platform.">In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).</li><li>Lee, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytostatic+hydroxycoumarin+OT52+induces+ER/Golgi+stress+and+STAT3+inhibition+triggering+non-canonical+cell+death+and+synergy+with+BH3+mimetics+in+lung+cancer.">Cytostatic hydroxycoumarin OT52 induces ER/Golgi stress and STAT3 inhibition triggering non-canonical cell death and synergy with BH3 mimetics in lung cancer.</a> Cancer Letters. 416, 94-108 (2018).</li><li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+to+the+soft-agar+assay+that+permits+high-throughput+drug+and+genetic+screens+for+cellular+transformation.">Alternative to the soft-agar assay that permits high-throughput drug and genetic screens for cellular transformation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5708-5713 (2015).</li><li>Spoerri, L., Beaumont, K. A., Anfosso, A., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Cell+Cycle+Imaging+in+a+3D+Cell+Culture+Model+of+Melanoma.">Real-Time Cell Cycle Imaging in a 3D Cell Culture Model of Melanoma.</a> Methods in Molecular Biology. 1612, 401-416 (2017).</li><li>Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, F., Weninger, W., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging-+and+Flow+Cytometry-based+Analysis+of+Cell+Position+and+the+Cell+Cycle+in+3D+Melanoma+Spheroids.">Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53486 (2015).</li><li>Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+cell+culture+techniques+for+cancer+drug+discovery.">Advanced cell culture techniques for cancer drug discovery.</a> Biology (Basel). 3 (2), 345-367 (2014).</li><li>Ji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dialkyl+resorcinol+stemphol+disrupts+calcium+homeostasis+to+trigger+programmed+immunogenic+necrosis+in+cancer.">The dialkyl resorcinol stemphol disrupts calcium homeostasis to trigger programmed immunogenic necrosis in cancer.</a> Cancer Letters. 416, 109-123 (2018).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Koloni oluşumu MCBM ile elde edilen oranda hücre türüne bağlıdır. Genellikle, yapışık olmayan hücreler için koloni sayısı çok daha yüksek yapisan hücrelere karşılaştırılır. A549 hücreleri 10 gün sonra 30-40 kolonileri oluşturduğu görülmektedir. Daha önce farklı lösemi hücreleri için kolonileri sayısının 200-2509arasında olduğunu bildirdin. Sonuçlarımız OT48 yalnız kolonileri yalnız sayısı önemli bir azalma getirmedi gösterdi. Ancak, BH3 ile birlikte mimetic A1210477 koloni şekillendirme yeteneği A549 hücre sinerjik düşürüldü. Daha önce o başka bir Hidroksikumarin türev A549 hücreleri koloni şekillendirme yeteneğine etkisizleştirmek için BH3 mimetics ile de synergized OT52 bildirdi. Önerilen tohum toplama 1.5 x 10 için 1 x 103 farklı olabilir3. CFA MethoCult kullanarak rutin olarak tumorigenesis çeşitli kanser hücre hatlarında ölçmek için kullanılan bir değerli tekniktir, ancak bazı sınırlamalar vardır. Kez deneme rahatsız edici ve hücreleri de bir kez büyümek değil sonra kalıcı koloniler kurtarma MCBM izole ve RPMI1640 ortamda tohumlari. Yine de, daha iyi bir 3D ortamda kanser progresyon mekanizmasını anlamak iyi kabul edilen bir önceden klinik tekniktir. 3D büyüme koşullar doğru tümör oluşumu bir in vivo ortamda doğal ortamının temsil. Ancak, bu yöntem yavaştır, emek yoğun ve yüksek işlem hacmi10eleme için uygun değildir.
SFAs yapışık hücreleri ile gerçekleştirilen ve onlar bir vivo içinde durum daha fazla temsilcisi olan fiziksel özellikler artan hücre hayatta kalma, tümör Morfoloji ve hipoksik bir çekirdek gibi sergilemek gibi kanser ilaç keşif geniş popülerlik kazandı 11,12. Toplam boyut, doku ve U-alt plaka tekniği ile elde edilen pulcuklarının bütünlüğünü hücre hatları arasında farklılık gösterebilir. Ayrıca, form pulcuklarının için kullanılan hücre başlangıç konsantrasyonu da genel gelişimini etkileyebilir. Bizim sonuçları OT48 BH3 mimeticA1210477 ile birlikte küresel bütünlük inhibe ve yetenek A549 hücre şekillendirme küresel azaltılmış gösterdi. Daha önce başka bir Hidroksikumarin türev BH3 mimetics9ile birlikte tarafından A549 pulcuklarının inhibisyonu bildirdi. Bu tekniğin büyük avantaj tekrarlanabilirlik ve maliyet etkinliği vardır. Sıvı kaplama tekniği gibi diğer teknikleri de düzenli olarak kanser hücrelerinin 3D pulcuklarının geliştirmek için kullanılır. Bu teknikte bir yapışık olmayan hücre kültür çanak hücreleri büyümek. Hücre kümeleri sonra toplanan ve süspansiyon kültür formu pulcuklarının için yerleştirilir. Ancak, bu teknik ile ilişkili önemli sınırlamaları hücre kümeleri için de çeşitli hücre hatları ile müsamaha edilmez süspansiyon kültür transferi biridir. Bileşik böyle bir 3D kültür sistem eleme, iş çıkarma yeteneğini artırmak için bazı şirketler belirli yüzeylerde, düşük ek tahlil plakalar ve 3D yapılar13oluşumu iyileştirilmesi iskele geliştiriyoruz. Daha fazla teknik gelişmeler ile bir daha temsilcisi 3D tümör modeli geliştirilmesi bir kanser türü için roman bileşiklerin Farmakoloji daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır.
Zebra balığı xenografts antikanser ilaç geliştirme9,14için rutin olarak kullanılan en uygun maliyetli hayvan deneyleri olarak kabul edilir. Çeşitli katı ve hematolojik kanser türleri yanı sıra hasta elde edilen hücreleri ile zebra balığı vivo içinde sistem optimize edilmiştir. Zebra balığı uyuşturucu tarama için kullanmanın yararları vardır. Prensip olarak, uyuşturucu doğrudan suya eklenebilir ve enjekte edilebilir gerekmez. Ayrıca, bu yaklaşım aynı zamanda uyuşturucu aday ADME (emme, dağıtım, metabolizması ve atılımı) özellikleri hakkında bilgi sağlar. Ancak, bir büyük sınırlamalar bu tekniğin bazı biridir molekülleri suda çözünür değildir ve bu nedenle hemen bu yöntem tarafından araştırılması için uygun değildir. Bu sınırlamayı aşmak için kanser hücrelerinin zebra balığı nerede hücreleri kararlıyız bir aşamada enjekte edilir, yine de canlılığı korumak için bileşikler ex vivo ile tedavi edildi. Sonuçlarımız A549 hücreleri OT-48 ile tedavi veya BH3 mimetic A1210477 yalnız yetenek A549 hücre OT48 ve A1210477 bir arada karşılaştırıldığında oluşturan tümör güçlü azaltmak değil gösterdi. Bu gözlem daha fazla bizim vitro burada kasanın bireysel tedavilere göre önemli bir anti-kanser etkisi gösterdi CFA geçerliliği. Özet olarak, bu teknik preklinik bir ortamda ilaçların hızlı tarama için katkıda bulunabilir.

Kanser tarafından hücresel mutasyonlar neden olur ve sonuç olarak biyokimyasal sinyal yolları kontrolsüz hücre bölünmesi ve hücre ölümü direnç tetikleyen bozdu. Tümörleri sindirim, sinir, dolaşım sistemi ve daha sonra komşu dokulara1fizyolojik fonksiyonları müdahale. Kapsamlı bir araştırma, kanser dünya2' deki en yaygın hayatı tehdit eden hastalık imlere rağmen. Hassas tıp gelecekteki kanser tedavi temel olarak kabul edilmiştir. Yeni moleküler varlıklar klinik sonuç geliştirmek için mevcut uyuşturucu ile birlikte düzenli olarak test edilir.
Ancak, yeni verimli hedefli tedaviler gelişimi ile ilişkili önemli kısıtlamalar uyuşturucu pozlama3tam biyolojik sonucu benzetimini yapmak için yaygın olarak kullanılan deneyleri başarısızlığın biridir. Kanser ilaç keşif hala çoğunlukla terapötik ajanlar etkinliğinin klinik4' te doğrulamak zor olan 2D monolayer kültürde kültürlü kanser hücre hatlarında test dayanır. Bu nedenle, daha iyi taklit tümörler vivo içinde5yerel özelliklerini daha iyi kanser modelleri geliştirmek için büyüyen bir ilgi vardır. Son yıllarda, 3D kültür modelleri artan bir ilgi 3D tümör modelleri5üretmek için geliştirilmiş yöntemleri geliştirmede sonuçlandı.
Burada, bir yaklaşım içinde derinlik vivo deneyleri daha önce BH3 mimetics ile birlikte OT486 Hidroksikumarin potens anlayış geliştirmek için izin üç farklı 3D hücre kültürü teknikleri ile mevcut. Daha fazla akciğer kanser hücrelerini OT48 ve BH3 mimetics arada etkinliğini doğrulamak ve kanser bir yaşam ilerlemesinde izlemek için bir zebra balığı modelini temel bir vivo içinde tümör oluşumu testi ile koloni ve SFAs birleştirerek bizim Yöntem oluşur organizma.
Koloni oluşumu deneyleri düzenli olarak hem katı hem de hematopoetik kanserler için antikanser ajanların etkinliğini değerlendirmek için kullanılır. Tahlil süresiz olarak çoğalırlar ve koloniler7oluşturmak için hücre yeteneğini belirler. Antikanser Ajan etkisi yetenek hücre oluşturan colony sayısı azalması ve/veya koloniler boyutunu tarafından belirlenir.
Pulcuklarının vitro tümör modelleri temsil ve antikanser maddeleri için bir düşük maliyetli tarama platform olarak hizmet. Pulcuklarının süspansiyon büyüyen hücresi ya da 3D dizey içinde gömülü. Bu yaklaşım yaygın uyuşturucu tarama ve tümör büyüme, yayılmasını önleme ve bağışıklık etkileşim8çalışmalar için kullanılır.
Tamamen yeni bir ilaç özelliklerini anlamak için in vivo deneyler kemirgenler üzerinde esastır. Ancak, geleneksel bu yöntem pahalı ve zaman alıcı. Son yıllarda, zebra balığı (Danio rerio) daha ucuz ve daha hızlı yükseltmek için yaygın olarak okudu laboratuvar organizma oldu. Tümör zebra balığı temsil bir 3D hücre kültür yaklaşımda ama içinde vivo ayarındaki omurgalı9geliştirdi.
Tamamen, biz burada Hidroksikumarin OT48 BH3 mimetics ile birlikte bir akciğer kanseri A549 hücre modelindeki antikanser kapasitesini göstermek için CFAs, SFAs ve zebra balığı vivo içinde tümör oluşumu da dahil olmak üzere üç farklı 3D kültür yaklaşımları kullanın.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Materials required for colony formation assays&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>37 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>30096</td><td>4 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1520-500</td><td>-20 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Lonza</td><td>17-602E</td><td>-20 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>Cell culture flask T75</td><td>SPL</td><td>70075</td><td>RT</td></tr><tr><td>PBS solution</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.02</td><td>RT</td></tr><tr><td>1.5ml tube</td><td>Extragene</td><td>Tube-170-C</td><td>RT</td></tr><tr><td>15 ml tube</td><td>Hyundai Micro</td><td>H20015</td><td>RT</td></tr><tr><td>12 well plate</td><td>SPL</td><td>30012</td><td>RT</td></tr><tr><td>MethoCult</td><td>StemCell technologies</td><td>4230</td><td>-20 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT powder)</td><td>Sigma</td><td>M5622</td><td>4 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>LAS4000</td><td>GE Healthcare Technologies</td><td></td><td>RT</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials required for spheroid formation assay&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>37 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>30096</td><td>4 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1520-500</td><td>-20 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Lonza</td><td>17-602E</td><td>-20 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>Cell culture flask T75</td><td>SPL</td><td>70075</td><td>RT</td></tr><tr><td>PBS solution</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.02</td><td>RT</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25-300-054</td><td>4 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>Corning costar ultra low attachemnt 96 well plate</td><td>Corning</td><td>3474</td><td>RT</td></tr><tr><td>Microscopy</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100</td><td>RT</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials required for zebrafish xenografts&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>37 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>30096</td><td>4 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1520-500</td><td>-20 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Lonza</td><td>17-602E</td><td>-20 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>Cell culture flask T25</td><td>SPL</td><td>70025</td><td>RT</td></tr><tr><td>Cell culture flask T75</td><td>SPL</td><td>70075</td><td>RT</td></tr><tr><td>Cell culture flask T175</td><td>SPL</td><td>71175</td><td>RT</td></tr><tr><td>1.5ml tube</td><td>Extragene</td><td>Tube-170-C</td><td>RT</td></tr><tr><td>24 well plate</td><td>SPL</td><td>30024</td><td>RT</td></tr><tr><td>Petridish</td><td>SPL</td><td>10100</td><td>RT</td></tr><tr><td>PBS solution</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.02</td><td>RT</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25-300-054</td><td>4 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71382</td><td>RT</td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>RT</td></tr><tr><td>Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2773</td><td>RT</td></tr><tr><td>Calcium nitrate tetrahydrate (Ca(NO3)2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1396</td><td>RT</td></tr><tr><td>HEPES solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td>RT</td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>RT</td></tr><tr><td>Phenol Red solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td>RT</td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0512</td><td>RT</td></tr><tr><td>1-phenyl-2-thiourea (PTU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td>RT</td></tr><tr><td>CM-Dil dye</td><td>Invitrogen</td><td>C7001</td><td>-20 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>Glass capillary</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW 100F-4</td><td>RT</td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Shutter instrument, USA</td><td>P-97</td><td>RT</td></tr><tr><td>Micro injector</td><td>World Precision Instruments</td><td>PV820</td><td>RT</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>KOVAX</td><td>1ml</td><td>RT</td></tr><tr><td>Micro loader</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>RT</td></tr><tr><td>Glass slide</td><td>Marienfeld</td><td>HSU-1000612</td><td>RT</td></tr><tr><td>Fluorescence microscopy</td><td>Leica</td><td>DE/DM 5000B</td><td>RT</td></tr></tbody></table>

preclinical assessment of the bioactivity of the anticancer coumarin ot48 by spheroids, colony formation assays, and zebrafish xenografts

Roman terapötik ajanlar içinde in vitro ve in vivo önceden klinik tarama çoğu kanser ilaç keşif önemli bir araçtır. Her ne kadar insan kanser hücre hatları 2D (boyutlu) monolayer hücre kültürlerinde terapötik bileşiklerin yanıt, 3D kültür sistemleri daha fizyolojik ilgili modelleri ilaçların etkinliğini anlamak için geliştirilmiştir. Son yıllarda, daha doğrusu tümör microenvironment taklit eden 3D kültür sistemlerinde yeni moleküller potens doğrulamak için önceden klinik araştırma bir paradigma kayması gözlendi. Bu sistemler daha fizyolojik ilgili bir şekilde hastalık durumu karakterize ve daha iyi mekanik kavrama ve belirli bir molekül farmakolojik potens anlayış kazanmak için yardım. Ayrıca, in vivo kanser modelleri iyileştirilmesinde mevcut trendi ile zebra balığı vivo içinde tümör oluşumu değerlendirmek ve terapötik ajanlar etkisini incelemek için önemli bir omurgalı model olarak ortaya çıkmıştır. Burada, biz Hidroksikumarin OT48 tedavi edici etkinliği tek başına veya akciğer kanseri hücre kültürünü A549 BH3 mimetics ile birlikte koloni oluşumu deneyleri (CFA), küresel oluşumu tahlil (SFA) dahil olmak üzere üç farklı 3D kültür sistemleri kullanarak araştırdık ve vivo zebra balığı xenografts.

Şekil 2' de, akciğer kanseri hücre satırı A549 MCBM içinde form kolonilere OT48 ile tedavi sonra tek başına veya birlikte belirtilen konsantrasyonlarda BH3 mimetic A1210477 ile seribaşı. Sonuçlar kasanın numarası, boyut ve kolonilerin toplam yüzey alanı kuluçka 10 gün sonra azaltılacağını olduğunu gösterdi.
Şekil 3' te A549 hücreleri ile OT48 tek başına veya birlikte BH3 mimetic A1210477 ile tedavi edildi ve form pulcuklarının U-alt plaka tekniği ile izin verildi. Kuluçka 3 gün sonra pulcuklarının görüntüleri alındı. Pulcuklarının miktar yapıldı görüntü J ve 3D kullanarak görüntüleri oluşturulur.
Şekil 4' te, A459 hücre OT48 ile tek başına veya birlikte 24 h için BH3 mimetic A1210477 ile tedavi ve zebra balığı sarısı sac enjekte. 72 saat sonra miktar floresan tümörlerin bileşik inhibitör potansiyeline karşılıklı olarak ilişkilendirir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57490/57490fig1.jpg"> Şekil 1: zebra balığı xenograft tahlil işlemindeki Şematik diyagramı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57490/57490fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57490/57490fig2.jpg"> Resim 2: A549 sinerjik inhibisyon koloni oluşumu ile Hidroksikumarin OT48 ve BH-3 mimetic A1210477. OT48, 50 µM ve/veya A1210477 20 µM ile tedavi bir A549 koloni oluşumu testin(a)görüntüler. (B-D) Miktar sayı, ortalama boyutu ve toplam yüzölçümü koloniler. Deneyler nüsha fark. Post hoc analizleri yapıldı. İstatistiksel anlamlar aşağıda 0,05 p değerlerinde değerlendirilir ve aşağıdaki göstergeyi tarafından temsil: * p ≤0.05, ** p ≤0.01, *** p ≤0.001, *** p ≤0.0001; özel mesaj Dunnett inceliyor; Sidak). Tüm çubuk grafikler en az üç bağımsız deneyler ortalama ± SD temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57490/57490fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57490/57490fig3.jpg"> Şekil 3: OT48 ve/veya A1210477 A549 kapasitesinin üzerindeki etkisini hücreleri formu pulcuklarının. A549 tümör pulcuklarının 3 gün sonra görüntüleri.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57490/57490fig4.jpg"> Şekil 4: A549 tümör kitle oluşumu bir bileşik tarafından inhibisyonu. (A)resimleri CM Dil lekeli A549 hücreleri kapasitesini oluşturan tümör üzerinde inhibitör etkisi OT48 ve/veya A1210477 gösteren. (B) miktar tümör oluşumu. Post hoc analizleri yapıldı. İstatistiksel anlamlar aşağıda 0,05 p değerlerinde değerlendirilir ve aşağıdaki göstergeyi tarafından temsil: * p ≤0.05, ** p ≤0.01, *** p ≤0.001, *** p ≤0.0001; özel mesaj Dunnett inceliyor; Sidak). Tüm çubuk grafikler en az on bağımsız deneyler ortalama ± SD temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57490/57490fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts at JoVE.com

Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts

Preklinik antikanser Coumarin OT48 pulcuklarının, koloni oluşumu deneyleri ve zebra balığı Xenografts Bioactivity değerlendirilmesi

Burada, antikanser coumarins 3D kültür ve zebra balığı kullanarak preklinik tarama mevcut.

In vitro and in vivo pre-clinical screening of novel therapeutic agents are an essential tool in cancer drug discovery. Although human cancer cell lines ...

preclinical-assessment-bioactivity-anticancer-coumarin-ot48-spheroids

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

8.3K Görüntüleme.  Seoul National University. Burada, antikanser coumarins 3D kültür ve zebra balığı kullanarak preklinik tarama mevcut.

Video: Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts

Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish (Danio Rerio)

Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression. Traditional in vitro models of cancer cell invasion of endothelia typically lack the fluid dynamics that invading cells are otherwise exposed to in vivo. However, in vivo systems such as mouse models, though more physiologically relevant, require longer experimental timescales and present unique challenges associated with monitoring and data analysis. Here we describe a zebrafish assay that seeks to bridge this technical gap by allowing for the rapid assessment of cancer cell vascular invasion and extravasation. The approach involves injecting fluorescent cancer cells into the precardiac sinus of transparent 2-day old zebrafish embryos whose vasculature is marked by a contrasting fluorescent reporter. Following injection, the cancer cells must survive in circulation and subsequently extravasate from vessels into tissues in the caudal region of the embryo. Extravasated cancer cells are efficiently identified and scored in live embryos via fluorescence imaging at a fixed timepoint. This technique can be modified to study intravasation and/or competition amongst a heterogeneous mixture of cancer cells by changing the injection site to the yolk sac. Together, these methods can evaluate a hallmark behavior of cancer cells and help uncover mechanisms indicative of malignant progression to the metastatic phenotype.

Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish Danio Rerio

This method utilizes zebrafish embryos to efficiently test the vascular invasive ability of cancer cells. Fluorescent cancer cells are injected into the precardiac sinus or yolk sac of developing embryos. Cancer cell vascular invasion and extravasation is assessed via fluorescence microscopy of the tail region 24 to 96 hr later.

Zebra balığı Kanser Hücrelerinin Vasküler İnvaziv Yetenek (Test<em&gt; Danio rerio</em&gt;)

Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression.  Traditional in vitro models of cancer cell invasion of ...

Kanser Araştırmaları

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Genomic studies of human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered in tumors1,2,3. A challenge arising from these studies is that many genes are altered, and it can be difficult to distinguish genetic alterations that drove tumorigenesis from that those arose incidentally during transformation. To draw this distinction it is beneficial to have an assay that can quantitatively measure the effect of an altered gene on tumor initiation and other processes that enable tumors to persist and disseminate. Here we present a rapid means to screen large numbers of candidate melanoma modifiers in zebrafish using an autochthonous tumor model4 that encompasses steps required for melanoma initiation and maintenance. A key reagent in this assay is the miniCoopR vector, which couples a wild-type copy of the mitfa melanocyte specification factor to a Gateway recombination cassette into which candidate melanoma genes can be recombined5. The miniCoopR vector has a mitfa rescuing minigene which contains the promoter, open reading frame and 3'-untranslated region of the wild-type mitfa gene. It allows us to make constructs using full-length open reading frames of candidate melanoma modifiers. These individual clones can then be injected into single cell Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf)zebrafish embryos. The miniCoopR vector gets integrated by Tol2-mediated transgenesis6 and rescues melanocytes. Because they are physically coupled to the mitfa rescuing minigene, candidate genes are expressed in rescued melanocytes, some of which will transform and develop into tumors. The effect of a candidate gene on melanoma initiation and melanoma cell properties can be measured using melanoma-free survival curves, invasion assays, antibody staining and transplantation assays.

A rapid way to screen for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model is presented. It takes advantage of the miniCoopR vector which allows for expression of candidate melanoma genes in melanocytes. A method to obtain melanoma-free survival curves, an invasion assay, a protocol for antibody staining of scale melanocytes and a melanoma transplantation assay are described.

Bir Zebra balığı Otokton Tümör Modeli kullanılarak Melanom Değiştiricileri için Tarama

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Tıp

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the standard in the field, but zebrafish have emerged as an alternative model with several advantages, including the ability for high-throughput and low-cost drug screening. Zebrafish also allow for in vivo drug screening with large replicate numbers that were previously only obtainable with in vitro systems. The ability to rapidly perform large scale drug screens may open up the possibility for personalized medicine with rapid translation of results back to clinic. Zebrafish xenograft models could also be used to rapidly screen for actionable mutations based on tumor response to targeted therapies or to identify new anti-cancer compounds from large libraries. The current major limitation in the field has been quantifying and automating the process so that drug screens can be done on a larger scale and be less labor-intensive. We have developed a workflow for xenografting primary patient samples into zebrafish larvae and performing large scale drug screens using a fluorescence microscope equipped imaging unit and automated sampler unit. This method allows for standardization and quantification of engrafted tumor area and response to drug treatment across large numbers of zebrafish larvae. Overall, this method is advantageous over traditional cell culture drug screening as it allows for growth of tumor cells in an in vivo environment throughout drug treatment, and is more practical and cost-effective than mice for large scale in vivo drug screens.

Zebrafish xenograft models allow for high-throughput drug screening and fluorescent imaging of human cancer cells in an in vivo microenvironment. We developed a workflow for large scale, automated drug screening on patient-derived leukemia samples in zebrafish using an automated fluorescence microscope equipped imaging unit.

Zebrabalığında Primer Hasta Kaynaklı Tümör Xenograftların İlaç Taraması

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly visualizing the response to anti-cancer therapies (chemo, radiotherapy, and biologicals), angiogenesis and metastasis with single cell resolution, places the zebrafish xenograft model as a top choice to develop preclinical studies.

The zebrafish larval xenograft assay presents several experimental advantages compared to other models, but probably the most striking is the reduction of size scale and consequently time. This reduction of scale allows single cell imaging, the use of a relatively low number of human cells (compatible with biopsies), medium-high-throughput drug screenings, but most importantly enables a significant reduction of the time of the assay. All these advantages make the zebrafish xenograft assay extremely attractive for future personalized medicine applications.

Many zebrafish xenograft protocols have been developed with a wide diversity of human tumors; however, a general and standardized protocol to efficiently generate zebrafish larval xenografts is still lacking. Here we provide a step-by-step protocol, with tips to generate xenografts and guidelines for tumor behavior analysis, whole-mount immunofluorescence, and confocal imaging quantification.

Here, we provide a step-by-step protocol, with tips to generate xenografts and guidelines for tumor behavior analysis, whole-mount immunofluorescence, and confocal imaging quantification.

Zebra Balığı Larva Xenografts ve Tümör Davranış AnaliziNin Üretimi

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a lack of clinical efficacy. This high failure rate illuminates the inability of the current preclinical models to predict clinical efficacy, mainly due to their inadequacy in reflecting tumor heterogeneity and the tumor microenvironment. These limitations can be addressed with 3-dimensional (3D) culture models (spheroids) established from human tumor samples derived from individual patients. These 3D cultures represent real-world biology better than established cell lines that do not reflect tumor heterogeneity. Furthermore, 3D cultures are better than 2-dimensional (2D) culture models (monolayer structures) since they replicate elements of the tumor environment, such as hypoxia, necrosis, and cell adhesion, and preserve the natural cell shape and growth. In the present study, a method was developed for preparing primary cultures of cancer cells from individual patients that are 3D and grow in multicellular spheroids. The cells can be derived directly from patient tumors or patient-derived xenografts. The method is widely applicable to solid tumors (e.g., colon, breast, and lung) and is also cost-effective, as it can be performed in its entirety in a typical cancer research/cell biology lab without relying on specialized equipment. Herein, a protocol is presented for generating 3D tumor culture models (multicellular spheroids) from primary cancer cells and evaluating their sensitivity to drugs using two complementary approaches: a cell-viability assay (MTT) and microscopic examinations. These multicellular spheroids can be used to assess potential drug candidates, identify potential biomarkers or therapeutic targets, and investigate the mechanisms of response and resistance.

The present protocol describes generating 3D tumor culture models from primary cancer cells and evaluating their sensitivity to drugs using cell-viability assays and microscopic examinations.

Hasta Kaynaklı Tümör Örneklerinden 3 Boyutlu Sferoidlerin Oluşturulması ve İlaçlara Duyarlılıklarının Değerlendirilmesi

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Establishment of Zebrafish Patient-Derived Xenografts from Pancreatic Cancer for Chemosensitivity Testing

Cancer is one of the main causes of death worldwide, and the incidence of many types of cancer continues to increase. Much progress has been made in terms of screening, prevention, and treatment; however, preclinical models that predict the chemosensitivity profile of cancer patients are still lacking. To fill this gap, an in vivo patient-derived xenograft model was developed and validated. The model was based on zebrafish (Danio rerio) embryos at 2 days post fertilization, which were used as recipients of xenograft fragments of tumor tissue taken from a patient's surgical specimen. 
It is also worth noting that bioptic samples were not digested or disaggregated, in order to maintain the tumor microenvironment, which is crucial in terms of analyzing tumor behavior and the response to therapy. The protocol details a method for establishing zebrafish-based patient-derived xenografts (zPDXs) from primary solid tumor surgical resection. After screening by an anatomopathologist, the specimen is dissected using a scalpel blade. Necrotic tissue, vessels, or fatty tissue are removed and then chopped into 0.3 mm x 0.3 mm x 0.3 mm pieces. 
The pieces are then fluorescently labeled and xenotransplanted into the perivitelline space of zebrafish embryos. A large number of embryos can be processed at a low cost, enabling high-throughput in vivo analyses of the chemosensitivity of zPDXs to multiple anticancer drugs. Confocal images are routinely acquired to detect and quantify the apoptotic levels induced by chemotherapy treatment compared to the control group. The xenograft procedure has a significant time advantage, since it can be completed in a single day, providing a reasonable time window to carry out a therapeutic screening for co-clinical trials.

Preclinical models aim to advance the knowledge of cancer biology and predict treatment efficacy. This paper describes the generation of zebrafish-based patient-derived xenografts (zPDXs) with tumor tissue fragments. The zPDXs were treated with chemotherapy, the therapeutic effect of which was assessed in terms of cell apoptosis of the transplanted tissue.

Kemosensitivite Testi için Pankreas Kanserinden Zebra Balığı Hasta Kaynaklı Ksenogreftlerin Kurulması

Cancer is one of the main causes of death worldwide, and the incidence of many types of cancer continues to increase. Much progress has been made in terms ...

Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has transparent embryos and rapid external development. Zebrafish embryos can, therefore, also be used for the rapid evaluation of toxicity of the drugs that are precious and available in small quantities. In the present article, a method for the efficient screening of the toxicity of chemical compounds using 1-5-day post fertilization embryos is described. The embryos are monitored by stereomicroscope to investigate the phenotypic defects caused by the exposure to different concentrations of compounds. Half-maximal lethal concentrations (LC50) of the compounds are also determined. The present study required 3-6 mg of an inhibitor compound, and the whole experiment takes about 8-10 h to be completed by an individual in a laboratory having basic facilities. The current protocol is suitable for testing any compound to identify intolerable toxic or off-target effects of the compound in the early phase of drug discovery and to detect subtle toxic effects that may be missed in the cell culture or other animal models. The method reduces procedural delays and costs of drug development.

Zebrafish embryos are used for evaluating the toxicity of chemical compounds. They develop externally and are sensitive to chemicals, allowing detection of subtle phenotypic changes. The experiment only requires a small amount of compound, which is directly added to the plate containing embryos, making the testing system efficient and cost-effective.

Zebrabalığı Embriyoları Kullanılarak Kimyasal Bileşiklerin Toksisitesinin Hızlı Değerlendirilmesi

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has ...

Small Molecule Screening and Toxicity Testing in Early-stage Zebrafish Larvae

Zebrafish have become a prominent model organism for human translational research, toxicity testing of small molecules and environmental pollutants, therapeutic drug discovery, and other biomedical research applications. The presented protocol aims to provide a clear guide for drug screening and toxicity testing in early-stage zebrafish larvae (aged 3-7 days post fertilization, dpf). Several methodologies describing toxicity testing in zebrafish larvae have been published, albeit lacking a standardized protocol for exposure durations, rate of media changes, and morphology scoring, amongst others. We experimentally determined the ideal larvae ages for conducting the experiments, the plate sizes that work best for those ages, the rate of media changes that provide reliable results while limiting wastage&#160;of test compound, and a morphology scoring system that is easily quantifiable in a statistical manner. The manuscript describes in detail a protocol for toxicity testing in zebrafish larvae aged between&#160;3 to 7 dpf, aiming to target the gap in drug toxicity testing and taking the first step towards a standardized method similar to the Fish Embryo Acute Toxicity test.

This protocol describes a drug screening procedure in zebrafish larvae 3-7 days post fertilization followed by morphological assessment.

Erken Evre Zebra Balığı Larvalarında Küçük Molekül Taraması ve Toksisite Testi

Zebrafish have become a prominent model organism for human translational research, toxicity testing of small molecules and environmental pollutants, ...

Biyoloji

Zebrafish Xenograft Assay: A Method to Assess the Anti-cancer Efficacy of Therapeutics on Tumorigenicity in Zebrafish In Vivo

Source: Lee, J. Y et al.,<a href="https://www.jove.com/v/57490/preclinical-assessment-bioactivity-anticancer-coumarin-ot48-spheroids">Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2018)
This video describes the zebrafish xenograft assay to assess in vivo tumor formation and study the effect of therapeutic agents.

Zebra Balığı Ksenogreft Testi: Zebra Balığı İn Vivo Tedavisinde Terapötiklerin Tümörojenite Üzerine Anti-kanser Etkinliğini Değerlendirmek İçin Bir Yöntem

Source: Lee, J. Y et al.,Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Akciğer Kanseri

İn vivo çalışma

Zebrafish Patient-Derived Xenograft (zPDX): A Cancer Model

Source: Wang L. et. al., <a href="https://www.jove.com/v/59507/" target="_blank">Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment</a>. J. Vis. Exp. (2019).
This video describes the technique to create a zebrafish patient derived xenograft model. In the sample protocol, we assess the efficiency of the drugs Gemcitabine and Navitoclax on the pancreatic tumor xenograft model.

Preklinik antikanser Coumarin OT48 pulcuklarının, koloni oluşumu deneyleri ve zebra balığı Xenografts Bioactivity değerlendirilmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Zebra balığı Kanser Hücrelerinin Vasküler İnvaziv Yetenek (Test