Name: preclinical assessment of the bioactivity of the anticancer coumarin ot48 by spheroids, colony formation assays, and zebrafish xenografts
Uploaded: 2018-06-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts at JoVE.com

מחקר-סנו נתמך על ידי נבחרת מחקר קרן (ב- NRF) על ידי MEST של קוריאה למענק הגידול Microenvironment גלובל הליבה מחקר במרכז (GCRC), [גרנט מספר 2011-0030001]; המענק מחקר סיאול האוניברסיטה הלאומית ועל ידי המוח קוריאה (BK21), בנוסף לתוכנית.

1. המושבה היווצרות מבחני
<ol><li>התרבות התאים A549-ריכוז של תאים/ס מ 20,0002 ב-15 מיליליטר RPMI1640 תא בינוני תרבות בתוספת 10% FBS (סרום שור עוברית) ואנטיביוטיקה % 1 בבקבוקון2 75 ס מ ב חממה2 CO-CO 37 ° C ו-5%2.</li>
	<li>ביום של הניסוי, לקבוע את הריכוז תא על-ידי שימוש של hemocytometer. לאסוף 50,000 תאים על ידי צנטריפוגה ב x 400 גרם במשך 7 דקות צינור microcentrifuge 1.5 mL והשהה מחדש תאים µL 100 ל- 1 x סטרילי PBS (פוספט Buffered מלוחים) 1.5 mL צינורות.</li>
	<li>לוותר על 1.1 מיליליטר מוצק למחצה מבוססי methylcellulose בינוני (MCBM) 15 מ"ל צינורות עם multipipette. מכינים שפופרת אחת עבור כל תנאי.</li>
	<li>להוסיף µL 110 של FBS 1.1 מ של MCBM באמצעות micropipette P200.</li>
	<li>זרעים תאים-תאים למ"ל 1,000. לאסוף µL 2.4 תא השעיה מן הפתרון מניות (50,000 תאים ב- 100 µL ל- 1 x PBS) באמצעות micropipette P2 ולהוסיף 1.1 מ של MCBM בתוספת 10% FBS.</li>
	<li>לאחר הוספת התאים, מערבולת הצינורות עבור 1 דקות, החזקתם אנכית במהירות הגבוהה ביותר לערבב היטב MCBM ותאים.</li>
	<li>הוסף מבחן תרכובות (OT48 לבד או בשילוב עם A1210477). הכן צינור בנפרד כפקד לחומר המשמש (כאן דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד)). בהתאם הריכוז של תרכובות ונפח נוסף עבור כל תנאי, הפקד הממס יכלול את הריכוז הגבוה ביותר של הממס המשמש את דילולים של הבדיקה במתחם, כדי להעריך על תופעות לוואי שנגרמו על ידי הממס.</li>
	<li>וורטקס צינורות במשך דקה אחת.</li>
	<li>עבור כל assay, להוסיף 1 מ"ל של התערובת עם micropipette P1000 מרכז טוב צלחת תרבות תא 12-. טוב.</li>
	<li>למלא בארות ריק עם 1 מ ל מים סטרילי או PBS x 1 לייצב את הלחות.</li>
	<li>תקופת דגירה תרבות צלחות של 10 ימים באינקובטור 37 ° C ו- 5% CO2.</li>
	<li>לאחר 10 ימי דגירה, להוסיף 200 µL של MTT (methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium ברומיד) מניות פתרון (5 מ"ג/מ"ל) כל טוב להגיע ריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל.</li>
	<li>דגירה 10 דקות בתוך אינקובטור-CO 37 ° C ו-5%2. מושבות בת קיימא יהפוך ויולט.</li>
	<li>ללכוד את התמונה באמצעות מצלמה דיגיטלית באמצעות לוח רקע לבן (LAS דיה לבנה מגש). השתמש בהגדרות הבאות: השיטה, דיגיטייז; סוג החשיפה, דיוק; זמן החשיפה, ידני, לשנייה אחת; רגישות/רזולוציה, ברזולוציה גבוהה. לשמור את התמונה בתבנית tiff.</li>
	<li>לכמת מושבות בת קיימא באמצעות תוכנת ImageJ. בחר בתפריט "תמונות | סוג | 8 סיביות". בתפריט בחר ' התאם | הסף". הגדר את הסף ולשמור קבועה עבור כל התנאים; בתפריט בחר "נתח | ניתוח חלקיקים". שמירת הנתונים ולנתח עם תוכנת סטטיסטיקה עבור ייצוג גרפי.</li>
</ol>2. ספרואיד היווצרות Assay
<ol><li>התרבות תאים A549-ריכוז של תאים/ס מ 20,0002 ב- 75 ס מ2 מבחנות עם 15 mL RPMI 1640 בינוני בתוספת 10% FBS ו 1% אנטיביוטיקה.</li>
	<li>ביום של הניסוי, להכין 96 ובכן צלחת U-התחתון.</li>
	<li>צלחת 10,000 תאים לבאר וכבר מכילה את המתחם עניין (כאן 50 מיקרומטר של OT48) ו/או 20 מיקרומטר של A1210477. לכוון את עוצמת הקול הסופי כדי 100 µL תא תרבות בינוני. מספר התאים היוצרים spheroids אחיד עם הגבול החיצוני ללא פגע נחשב מספיק כדי spheroids טופס.</li>
	<li>תקופת דגירה של 3 ימים באינקובטור 37 ° C וכן ב 5% CO2.</li>
	<li>לאחר 3 ימי דגירה, לכידת תמונות של spheroids באמצעות מיקרוסקופ אור עם 4 x הגדלה.</li>
</ol>3. דג זברה Xenograft Assay
הערה: גישה טכנית זו הוא מדמיין כמו שרטוט (איור 1).
<ol><li>
הכנה של ריאגנטים מניות
	<ol>
<li>להכנת 1 ליטר של 30 x הפתרון של Danieau: 1740 מ"מ NaCl, 21 מ מ אשלגן כלורי, 12 מ מ MgSO4∙7H2O, 18 מ מ Ca (3)2ו- 150 מ מ HEPES. התאם את רמת ה-pH של המאגר כדי 7.6 באמצעות מד pH.</li>
		<li>להכין 1% (50 x) tricaine פתרון: לפזר 20 מ ג של אתיל 3-aminobenzoate methanesulfonate (tricaine) ב- 2 מ ל מים מזוקקים.</li>
		<li>להכין 1% פנול אדום-PBS פתרון: להוסיף 2 µL פנול אדום מלח נתרן לפתרון µL 198 בפתרון PBS סטיריליים צינור 1.5 µL.</li>
		<li>להכין 3% methylcellulose: להוסיף דור 3 של methylcellulose 100 מ של 1 x הפתרון של Danieau.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ייצור הביצים דג זברה, דגירה
	<ol>
<li>הפרד בין נקבה אחת ואחד דג זברה זכר במיכל מחיצה מלאה עם מים מהברז עיקור UV ומסוננות ב 28.5 ° C בחושך. לאחר 24 שעות של הפרדה, מערבבים דג של שני המינים כדי להזדווג. העברה הביצים ממיכל ההזדווגות צלחת פטרי המכיל 5 מ של הפתרון של Danieau טריים.</li>
		<li>לשטוף ביצים שלוש פעמים עם 5 מ של הפתרון של Danieau. לשטיפת מכוניות, תשאף היטב את הביצים עם פיפטה, העברה עד 5 מ"ל של פתרון טריים. תקופת דגירה של 8 שעות ב- 28.5 ° C.<ol>
<li>אחרי 8 שעות של דגירה בפתרון של Danieau, שנה, לאודנום של Danieau 0.03% 1-phenyl-2-thiourea (פרופילתיואוראציל) כדי לעכב פיגמנטציה. למיין את הביצים אטום (מופרית או המכיל לא מפותחים עוברי) כדי למנוע זיהום.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
העובר dechorionation
	<ol>
<li>h 24 שעות ביממה פוסט הפריה (hpf), העוברים דג זברה dechorionate באמצעות מלקחיים חדה. דגירה הבקיעה עוברי בפתרון של Danieau עם 0.03% פרופילתיואוראציל ב 28.5 ° C עד 48 hpf.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנת תרכובת שטופלו תא
	<ol>
<li>זרעי A549 תאים-תאים/ס מ 20,0002 ב 25 ס מ2 תרבות מבחנות. לאחר 24 שעות של זריעה, להוסיף תרכובות (OT48 כאן ב 50 מיקרומטר, ו/או A1210477 ב- 20 מיקרומטר) במשך 24 שעות ביממה באינקובטור 37 ° C ו- 5% CO2. להגדיר את זמן הטיפול בכל המתחם כדי לשמור על הכדאיות של התאים, אבל לבצע אותם לקראת מוות של תאים. הפעם צריך נקודת בנפרד להגדיר מבוסס על הכדאיות תא, המורפולוגיה. סמנים מולקולריים.</li>
		<li>שעתיים לפני סוף הטיפול, הכתם תאים עם 4 מיקרומטר של התא פלורסנט המעקב לצבוע ס מדיל-CO 37 ° C ו-5%2. לאחר שעתיים של דגירה, trypsinize תאים עם 0.05% טריפסין-EDTA, לדלל 106 תאים ב- 50 µL של פנול אדום-PBS פתרון לפני ההזרקה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
מיקרו-הזרקה של תאי הסרטן על היווצרות xenograft
	<ol>
<li>עזים ומתנגד דג זברה בפתרון tricaine 0.02% במשך 5 דקות עד שיספיקו להתמקם על צלחת אגר.</li>
		<li>משוך 1.0 מ מ (מחוץ קוטר (OD) זכוכית נימי) מאת פולר micropipette (תוכנית הגדרות: 300 p:, חום: 260, משוך: ול 60,: 50, זמן: 200). חותכים את microcapillary עם מזרק כדי ליצור קצה חד. לטעון microcapillaries עם 20 µL של התא/פנול אדום-PBS פתרון. הגדר הזרקה בלחץ והזמן כדי לוותר על 2 nL לכל זריקה.</li>
		<li>להזריק 100-200 תאים לתוך שק החלמון על ידי שהזרקת 6 עד 10 nL באמצעות זריקות 3 עד 5. לאחר ההזרקה, לאפשר דגים לשחזר למשך 10-30 דקות ב 5 מ של הפתרון של Danieau טריים המכילים פרופילתיואוראציל פתרון. מוקד בדגים. ובכן 24 צלחות עם 1 מ"ל של הפתרון של Danieau המכילה פתרון פרופילתיואוראציל, תקופת דגירה של 72 h ב- 28.5 ° C.</li>
		<li>לאחר 72 h של דגירה, עזים ומתנגד דגים בפתרון tricaine 0.02%, לשתק על משטח זכוכית עם ירידה של 3% methylcellulose. לצלם תמונות x 5 על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ באורך-גל של 620-750 ננומטר.</li>
		<li>לכמת את הגודל של גידולים פלורסנט באמצעות תוכנת ImageJ. בתפריט בחר "נתח | מדד". שמירת ערכים המתאימים לאות פלורסנט ולנתח עם תוכנת סטטיסטיקה עבור ייצוג גרפי.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Giancotti, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deregulation+of+cell+signaling+in+cancer.">Deregulation of cell signaling in cancer.</a> FEBS Letters. 588 (16), 2558-2570 (2014).</li><li>Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioprinting+for+cancer+research.">Bioprinting for cancer research.</a> Trends in Biotechnology. 33 (9), 504-513 (2015).</li><li>Santo, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+in+3D+in+vitro+tumor+models:+overcoming+current+pitfalls+of+efficacy+read-outs.">Drug screening in 3D in vitro tumor models: overcoming current pitfalls of efficacy read-outs.</a> Biotechnology Journal. 12 (1), (2017).</li><li>Tanner, K., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+3D+culture+models+of+cancer.">Beyond 3D culture models of cancer.</a> Science Translational Medicine. 7 (283), 283ps289 (2015).</li><li>Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+cell+culture:+a+review+of+current+approaches+and+techniques.">3D cell culture: a review of current approaches and techniques.</a> Methods in Molecular Biology. 695, 1-15 (2011).</li><li>Talhi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bis(4-hydroxy-2H-chromen-2-one):+synthesis+and+effects+on+leukemic+cell+lines+proliferation+and+NF-kappaB+regulation.">Bis(4-hydroxy-2H-chromen-2-one): synthesis and effects on leukemic cell lines proliferation and NF-kappaB regulation.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 22 (11), 3008-3015 (2014).</li><li>Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonogenic+assay+of+cells+in+vitro.">Clonogenic assay of cells in vitro.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).</li><li>Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Tumor+Models:+Advantages,+Disadvantages,+Variables,+and+Selecting+the+Right+Platform.">In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).</li><li>Lee, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytostatic+hydroxycoumarin+OT52+induces+ER/Golgi+stress+and+STAT3+inhibition+triggering+non-canonical+cell+death+and+synergy+with+BH3+mimetics+in+lung+cancer.">Cytostatic hydroxycoumarin OT52 induces ER/Golgi stress and STAT3 inhibition triggering non-canonical cell death and synergy with BH3 mimetics in lung cancer.</a> Cancer Letters. 416, 94-108 (2018).</li><li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+to+the+soft-agar+assay+that+permits+high-throughput+drug+and+genetic+screens+for+cellular+transformation.">Alternative to the soft-agar assay that permits high-throughput drug and genetic screens for cellular transformation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5708-5713 (2015).</li><li>Spoerri, L., Beaumont, K. A., Anfosso, A., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Cell+Cycle+Imaging+in+a+3D+Cell+Culture+Model+of+Melanoma.">Real-Time Cell Cycle Imaging in a 3D Cell Culture Model of Melanoma.</a> Methods in Molecular Biology. 1612, 401-416 (2017).</li><li>Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, F., Weninger, W., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging-+and+Flow+Cytometry-based+Analysis+of+Cell+Position+and+the+Cell+Cycle+in+3D+Melanoma+Spheroids.">Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53486 (2015).</li><li>Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+cell+culture+techniques+for+cancer+drug+discovery.">Advanced cell culture techniques for cancer drug discovery.</a> Biology (Basel). 3 (2), 345-367 (2014).</li><li>Ji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dialkyl+resorcinol+stemphol+disrupts+calcium+homeostasis+to+trigger+programmed+immunogenic+necrosis+in+cancer.">The dialkyl resorcinol stemphol disrupts calcium homeostasis to trigger programmed immunogenic necrosis in cancer.</a> Cancer Letters. 416, 109-123 (2018).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

שיעור של היווצרות המושבה שהושג עם MCBM תלויה בסוג התא. בדרך כלל, עבור תאים שאינם מחסידי, מספר מושבות הוא הרבה יותר גבוה לעומת תאים חסיד. הבחנו כי תאים A549 הקימו מושבות 30 עד 40 לאחר 10 ימים. בעבר דיווחנו על תאי סרטן שונים כי מספר מושבות הוא בין 200 ל-2509. התוצאות שלנו הראה כי OT48 לבד לא לייצ?...

סרטן נגרמת על ידי מוטציות תאיות, כתוצאה מכך הביוכימי איתות המסלולים הם שיבשו מפעילה חלוקת תאים בלתי מבוקרת והתנגדות מוות של תאים. גידולים להפריע פונקציות פיזיולוגיים של העיכול, לחוצה, הדם מערכות, רקמות שכנות לאחר מכן1. למרות מאמצי מחקר מקיף, הסרטן נשאר המחלה שכיחה ביותר מסכני העולם2. רפואה דיוק הוכר יסוד ותרופות לסרטן בעתיד. גופים מולקולריים חדשים נבחנים באופן שגרתי בשילוב עם תרופות קיימות כדי לשפר את התוצאה הקלינית.
אולם, אחת המגבלות משמעותיים הקשורים לפיתוח טיפולים ממוקדים יעיל החדש הוא הכישלון של מבחני נפוץ לדמות התוצאה ביולוגי מדויק של חשיפה לסמים3. גילוי תרופות הסרטן עדיין בעיקר מסתמך על בדיקת יעילותם של סוכני טיפולית בתוך שורות תאים סרטן בתרבית בתרבויות טפט 2D, אשר קשה לאמת בניסויים קליניים4. לכן, אין עניין הולך וגובר לפתח מודלים סרטן יותר עדיף לחקות את התכונות מקורית של גידולים ויוו5. בשנים האחרונות, הביא עניין הולך וגדל בתרבות תלת-ממד מודלים לפיתוח מתודולוגיות שיפור לייצר מודלים 3D הגידול5.
כאן, אנו מציגים גישה עם שלוש טכניקות תרבות שונים תא 3D המאפשר לשפר את ההבנה של עוצמת hydroxycoumarin OT486 בשילוב עם BH3 מימטיקה לפני יותר בעומק ויוו מבחני. השיטה שלנו מורכב המשלב המושבה לבין SFAs עם ויוו הגידול היווצרות מבחן המבוסס על מודל של דג זברה נוסף לאמת את היעילות של השילוב של OT48 ו BH3 מימטיקה בתאי סרטן ריאות, לעקוב אחר התקדמות סרטן ב חי . אורגניזם.
מבחני היווצרות המושבה משמשים באופן שגרתי כדי להעריך את היעילות של תרופות נגד סרטן סוכנים עבור סרטן הן מוצק כמו גם hematopoietic. וזמינותו קובעת את היכולת של תא כדי להתרבות ללא הגבלת זמן ויוצרים מושבות7. ההשפעה של סוכן נגד סרטן על המושבה ויוצרים את היכולת של תאי נקבעת על ידי ירידה של מספר ו/או גודל של המושבות.
Spheroids מייצגים במבחנה הגידול מודלים ומגישים כפלטפורמה ההקרנה בעלות נמוכה עבור סוכני נגד סרטן. Spheroids אגרגטים של תאי גידול ההשעיה או מוטבע בתוך מטריצה תלת-ממד. גישה זו הוא בשימוש נרחב והתרופות הקרנה ומחקרים של הגידול, התפשטות וצמיחה של החיסון אינטראקציה עם8.
כדי להבין באופן מלא את המאפיינים של תרופה חדשה, זה חיוני כדי ניסויים ויוו מכרסמים. עם זאת, שיטה זו המקובלת היא זמן רב ויקר. בשנים האחרונות, דג זברה (רזבורה rerio) הפך אורגניזם מעבדה נרחב למד כי הוא זול יותר ומהיר יותר לגדל. גידולים שפותחה בגישה דג זברה מייצגים תלת-ממד תא תרבות אך בתוך הגדרת ויוו של חוליות9.
בסך הכל, נשתמש כאן שלוש גישות התרבות 3D שונים לרבות פרנקים, SFAs דג זברה ויוו היווצרות הגידול כדי להדגים את הקיבולת נגד סרטן של hydroxycoumarin OT48 במודל התא סרטן A549 ריאות בשילוב עם BH3 מימטיקה.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Materials required for colony formation assays&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>37 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>30096</td><td>4 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1520-500</td><td>-20 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Lonza</td><td>17-602E</td><td>-20 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>Cell culture flask T75</td><td>SPL</td><td>70075</td><td>RT</td></tr><tr><td>PBS solution</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.02</td><td>RT</td></tr><tr><td>1.5ml tube</td><td>Extragene</td><td>Tube-170-C</td><td>RT</td></tr><tr><td>15 ml tube</td><td>Hyundai Micro</td><td>H20015</td><td>RT</td></tr><tr><td>12 well plate</td><td>SPL</td><td>30012</td><td>RT</td></tr><tr><td>MethoCult</td><td>StemCell technologies</td><td>4230</td><td>-20 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT powder)</td><td>Sigma</td><td>M5622</td><td>4 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>LAS4000</td><td>GE Healthcare Technologies</td><td></td><td>RT</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials required for spheroid formation assay&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>37 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>30096</td><td>4 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1520-500</td><td>-20 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Lonza</td><td>17-602E</td><td>-20 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>Cell culture flask T75</td><td>SPL</td><td>70075</td><td>RT</td></tr><tr><td>PBS solution</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.02</td><td>RT</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25-300-054</td><td>4 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>Corning costar ultra low attachemnt 96 well plate</td><td>Corning</td><td>3474</td><td>RT</td></tr><tr><td>Microscopy</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100</td><td>RT</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials required for zebrafish xenografts&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>37 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>30096</td><td>4 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1520-500</td><td>-20 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Lonza</td><td>17-602E</td><td>-20 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>Cell culture flask T25</td><td>SPL</td><td>70025</td><td>RT</td></tr><tr><td>Cell culture flask T75</td><td>SPL</td><td>70075</td><td>RT</td></tr><tr><td>Cell culture flask T175</td><td>SPL</td><td>71175</td><td>RT</td></tr><tr><td>1.5ml tube</td><td>Extragene</td><td>Tube-170-C</td><td>RT</td></tr><tr><td>24 well plate</td><td>SPL</td><td>30024</td><td>RT</td></tr><tr><td>Petridish</td><td>SPL</td><td>10100</td><td>RT</td></tr><tr><td>PBS solution</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.02</td><td>RT</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25-300-054</td><td>4 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71382</td><td>RT</td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>RT</td></tr><tr><td>Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2773</td><td>RT</td></tr><tr><td>Calcium nitrate tetrahydrate (Ca(NO3)2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1396</td><td>RT</td></tr><tr><td>HEPES solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td>RT</td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>RT</td></tr><tr><td>Phenol Red solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td>RT</td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0512</td><td>RT</td></tr><tr><td>1-phenyl-2-thiourea (PTU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td>RT</td></tr><tr><td>CM-Dil dye</td><td>Invitrogen</td><td>C7001</td><td>-20 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>Glass capillary</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW 100F-4</td><td>RT</td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Shutter instrument, USA</td><td>P-97</td><td>RT</td></tr><tr><td>Micro injector</td><td>World Precision Instruments</td><td>PV820</td><td>RT</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>KOVAX</td><td>1ml</td><td>RT</td></tr><tr><td>Micro loader</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>RT</td></tr><tr><td>Glass slide</td><td>Marienfeld</td><td>HSU-1000612</td><td>RT</td></tr><tr><td>Fluorescence microscopy</td><td>Leica</td><td>DE/DM 5000B</td><td>RT</td></tr></tbody></table>

preclinical assessment of the bioactivity of the anticancer coumarin ot48 by spheroids, colony formation assays, and zebrafish xenografts

הקרנת קליניים בתוך חוץ גופית ו ויוו של סוכני טיפולית הרומן הן כלי חיוני בגילוי סרטן סמים. למרות שורות תאים סרטניים אנושיים מגיבים תרכובות טיפולית תרביות תאים חד שכבתי (מימד) 2D, 3D תרבות מערכות פותחו כדי להבין את היעילות של תרופות יותר מבחינה פיזיולוגית הרלוונטיים במודלים. בשנים האחרונות, שינוי פרדיגמה נצפתה במחקרים קליניים כדי לאמת את העוצמה של מולקולות חדשות במערכות תרבות תלת-ממד, ליתר דיוק מחקה את microenvironment הגידול. מערכות אלה מאפיינים את המחלה באופן רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית ולעזור כדי לקבל יותר מכניסטית תובנה והבנה של הכדורים מינון תרופתי של מולקולה נתונה. יתר על כן, עם המגמה הנוכחית בשיפור ויוו סרטן מודלים, דג זברה התפתחה כמודל חוליות חשוב להעריך ויוו היווצרות הגידול וללמוד את ההשפעה של סוכני טיפולית. . חקרנו את היעילות הטיפולית של hydroxycoumarin OT48 לבד או בשילוב עם BH3 מימטיקה ב סרטן ריאות תאים בטור A549 באמצעות שלוש מערכות התרבות 3D שונים כולל מבחני היווצרות המושבה (CFA), ספרואיד היווצרות assay (SFA) ו אין ויוו xenografts דג זברה.

איור 2, סרטן ריאות תא קו A549 היה נזרע ב MCBM למושבות הטופס לאחר הטיפול עם OT48 לבד או בשילוב עם A1210477 מימטי BH3 בריכוזים המצוין. התוצאות הראו כי השילוב הקטינה באופן משמעותי מספר וגודל השטח הכולל של המושבות לאחר 10 ימים של דגירה.
<strong c...

Watch this Scientific Journal Video about Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts at JoVE.com

Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts

הערכת פרה Bioactivity של OT48 נגד סרטן קומרין Spheroids, מבחני היווצרות המושבה ועל דג זברה Xenografts

כאן, אנו מציגים את הקרנת הסרט פרה coumarins נגד סרטן באמצעות תרבות תלת-ממד, דג זברה.

In vitro and in vivo pre-clinical screening of novel therapeutic agents are an essential tool in cancer drug discovery. Although human cancer cell lines ...

preclinical-assessment-bioactivity-anticancer-coumarin-ot48-spheroids

Research

JoVE Journal

Cancer Research

8.3K Views.  Seoul National University. כאן, אנו מציגים את הקרנת הסרט פרה coumarins נגד סרטן באמצעות תרבות תלת-ממד, דג זברה.

Video: Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts

Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish (Danio Rerio)

Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression. Traditional in vitro models of cancer cell invasion of endothelia typically lack the fluid dynamics that invading cells are otherwise exposed to in vivo. However, in vivo systems such as mouse models, though more physiologically relevant, require longer experimental timescales and present unique challenges associated with monitoring and data analysis. Here we describe a zebrafish assay that seeks to bridge this technical gap by allowing for the rapid assessment of cancer cell vascular invasion and extravasation. The approach involves injecting fluorescent cancer cells into the precardiac sinus of transparent 2-day old zebrafish embryos whose vasculature is marked by a contrasting fluorescent reporter. Following injection, the cancer cells must survive in circulation and subsequently extravasate from vessels into tissues in the caudal region of the embryo. Extravasated cancer cells are efficiently identified and scored in live embryos via fluorescence imaging at a fixed timepoint. This technique can be modified to study intravasation and/or competition amongst a heterogeneous mixture of cancer cells by changing the injection site to the yolk sac. Together, these methods can evaluate a hallmark behavior of cancer cells and help uncover mechanisms indicative of malignant progression to the metastatic phenotype.

Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish Danio Rerio

This method utilizes zebrafish embryos to efficiently test the vascular invasive ability of cancer cells. Fluorescent cancer cells are injected into the precardiac sinus or yolk sac of developing embryos. Cancer cell vascular invasion and extravasation is assessed via fluorescence microscopy of the tail region 24 to 96 hr later.

בדיקת היכולת פולשנית דם של תאים סרטניים דג הזברה (<em&gt; Danio rerio</em&gt;)

Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression.  Traditional in vitro models of cancer cell invasion of ...

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Genomic studies of human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered in tumors1,2,3. A challenge arising from these studies is that many genes are altered, and it can be difficult to distinguish genetic alterations that drove tumorigenesis from that those arose incidentally during transformation. To draw this distinction it is beneficial to have an assay that can quantitatively measure the effect of an altered gene on tumor initiation and other processes that enable tumors to persist and disseminate. Here we present a rapid means to screen large numbers of candidate melanoma modifiers in zebrafish using an autochthonous tumor model4 that encompasses steps required for melanoma initiation and maintenance. A key reagent in this assay is the miniCoopR vector, which couples a wild-type copy of the mitfa melanocyte specification factor to a Gateway recombination cassette into which candidate melanoma genes can be recombined5. The miniCoopR vector has a mitfa rescuing minigene which contains the promoter, open reading frame and 3'-untranslated region of the wild-type mitfa gene. It allows us to make constructs using full-length open reading frames of candidate melanoma modifiers. These individual clones can then be injected into single cell Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf)zebrafish embryos. The miniCoopR vector gets integrated by Tol2-mediated transgenesis6 and rescues melanocytes. Because they are physically coupled to the mitfa rescuing minigene, candidate genes are expressed in rescued melanocytes, some of which will transform and develop into tumors. The effect of a candidate gene on melanoma initiation and melanoma cell properties can be measured using melanoma-free survival curves, invasion assays, antibody staining and transplantation assays.

A rapid way to screen for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model is presented. It takes advantage of the miniCoopR vector which allows for expression of candidate melanoma genes in melanocytes. A method to obtain melanoma-free survival curves, an invasion assay, a protocol for antibody staining of scale melanocytes and a melanoma transplantation assay are described.

הקרנה למכפילים מלנומה תוך שימוש במודל גידול כבני מקום דג זברה

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Medicine

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the standard in the field, but zebrafish have emerged as an alternative model with several advantages, including the ability for high-throughput and low-cost drug screening. Zebrafish also allow for in vivo drug screening with large replicate numbers that were previously only obtainable with in vitro systems. The ability to rapidly perform large scale drug screens may open up the possibility for personalized medicine with rapid translation of results back to clinic. Zebrafish xenograft models could also be used to rapidly screen for actionable mutations based on tumor response to targeted therapies or to identify new anti-cancer compounds from large libraries. The current major limitation in the field has been quantifying and automating the process so that drug screens can be done on a larger scale and be less labor-intensive. We have developed a workflow for xenografting primary patient samples into zebrafish larvae and performing large scale drug screens using a fluorescence microscope equipped imaging unit and automated sampler unit. This method allows for standardization and quantification of engrafted tumor area and response to drug treatment across large numbers of zebrafish larvae. Overall, this method is advantageous over traditional cell culture drug screening as it allows for growth of tumor cells in an in vivo environment throughout drug treatment, and is more practical and cost-effective than mice for large scale in vivo drug screens.

Zebrafish xenograft models allow for high-throughput drug screening and fluorescent imaging of human cancer cells in an in vivo microenvironment. We developed a workflow for large scale, automated drug screening on patient-derived leukemia samples in zebrafish using an automated fluorescence microscope equipped imaging unit.

הקרנת התרופה של החולה העיקרי הנגזר גידול Xenografts ב Zebrafish

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly visualizing the response to anti-cancer therapies (chemo, radiotherapy, and biologicals), angiogenesis and metastasis with single cell resolution, places the zebrafish xenograft model as a top choice to develop preclinical studies.

The zebrafish larval xenograft assay presents several experimental advantages compared to other models, but probably the most striking is the reduction of size scale and consequently time. This reduction of scale allows single cell imaging, the use of a relatively low number of human cells (compatible with biopsies), medium-high-throughput drug screenings, but most importantly enables a significant reduction of the time of the assay. All these advantages make the zebrafish xenograft assay extremely attractive for future personalized medicine applications.

Many zebrafish xenograft protocols have been developed with a wide diversity of human tumors; however, a general and standardized protocol to efficiently generate zebrafish larval xenografts is still lacking. Here we provide a step-by-step protocol, with tips to generate xenografts and guidelines for tumor behavior analysis, whole-mount immunofluorescence, and confocal imaging quantification.

Here, we provide a step-by-step protocol, with tips to generate xenografts and guidelines for tumor behavior analysis, whole-mount immunofluorescence, and confocal imaging quantification.

דור של זברה דג זחל קסנוגרפטים וניתוח התנהגות הגידול

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a lack of clinical efficacy. This high failure rate illuminates the inability of the current preclinical models to predict clinical efficacy, mainly due to their inadequacy in reflecting tumor heterogeneity and the tumor microenvironment. These limitations can be addressed with 3-dimensional (3D) culture models (spheroids) established from human tumor samples derived from individual patients. These 3D cultures represent real-world biology better than established cell lines that do not reflect tumor heterogeneity. Furthermore, 3D cultures are better than 2-dimensional (2D) culture models (monolayer structures) since they replicate elements of the tumor environment, such as hypoxia, necrosis, and cell adhesion, and preserve the natural cell shape and growth. In the present study, a method was developed for preparing primary cultures of cancer cells from individual patients that are 3D and grow in multicellular spheroids. The cells can be derived directly from patient tumors or patient-derived xenografts. The method is widely applicable to solid tumors (e.g., colon, breast, and lung) and is also cost-effective, as it can be performed in its entirety in a typical cancer research/cell biology lab without relying on specialized equipment. Herein, a protocol is presented for generating 3D tumor culture models (multicellular spheroids) from primary cancer cells and evaluating their sensitivity to drugs using two complementary approaches: a cell-viability assay (MTT) and microscopic examinations. These multicellular spheroids can be used to assess potential drug candidates, identify potential biomarkers or therapeutic targets, and investigate the mechanisms of response and resistance.

The present protocol describes generating 3D tumor culture models from primary cancer cells and evaluating their sensitivity to drugs using cell-viability assays and microscopic examinations.

קביעת ספרואידים תלת מימדיים מדגימות גידול שמקורן בחולה והערכת רגישותם לתרופות

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Establishment of Zebrafish Patient-Derived Xenografts from Pancreatic Cancer for Chemosensitivity Testing

Cancer is one of the main causes of death worldwide, and the incidence of many types of cancer continues to increase. Much progress has been made in terms of screening, prevention, and treatment; however, preclinical models that predict the chemosensitivity profile of cancer patients are still lacking. To fill this gap, an in vivo patient-derived xenograft model was developed and validated. The model was based on zebrafish (Danio rerio) embryos at 2 days post fertilization, which were used as recipients of xenograft fragments of tumor tissue taken from a patient's surgical specimen. 
It is also worth noting that bioptic samples were not digested or disaggregated, in order to maintain the tumor microenvironment, which is crucial in terms of analyzing tumor behavior and the response to therapy. The protocol details a method for establishing zebrafish-based patient-derived xenografts (zPDXs) from primary solid tumor surgical resection. After screening by an anatomopathologist, the specimen is dissected using a scalpel blade. Necrotic tissue, vessels, or fatty tissue are removed and then chopped into 0.3 mm x 0.3 mm x 0.3 mm pieces. 
The pieces are then fluorescently labeled and xenotransplanted into the perivitelline space of zebrafish embryos. A large number of embryos can be processed at a low cost, enabling high-throughput in vivo analyses of the chemosensitivity of zPDXs to multiple anticancer drugs. Confocal images are routinely acquired to detect and quantify the apoptotic levels induced by chemotherapy treatment compared to the control group. The xenograft procedure has a significant time advantage, since it can be completed in a single day, providing a reasonable time window to carry out a therapeutic screening for co-clinical trials.

Preclinical models aim to advance the knowledge of cancer biology and predict treatment efficacy. This paper describes the generation of zebrafish-based patient-derived xenografts (zPDXs) with tumor tissue fragments. The zPDXs were treated with chemotherapy, the therapeutic effect of which was assessed in terms of cell apoptosis of the transplanted tissue.

הקמת קסנוגרפטים מסרטן הלבלב שמקורם בדגי זברה לבדיקת רגישות לכימותרפיה

Cancer is one of the main causes of death worldwide, and the incidence of many types of cancer continues to increase. Much progress has been made in terms ...

שימוש בדגי זברה זחלים למחקרים יעילים בגידולי Vivo

A Simple, Rapid, and Effective Method for Tumor Xenotransplantation Analysis in Transparent Zebrafish Embryos

In vivo studies of tumor behavior are a staple of cancer research; however, the use of mice presents significant challenges in cost and time. Here, we present larval zebrafish as a transplant model that has numerous advantages over murine models, including ease of handling, low expense, and short experimental duration. Moreover, the absence of an adaptive immune system during larval stages obviates the need to generate and use immunodeficient strains. While established protocols for xenotransplantation in zebrafish embryos exist, we present here an improved method involving embryo staging for faster transfer, survival analysis, and the use of flow cytometry to assess disease burden. Embryos are staged to facilitate rapid cell injection into the yolk of the larvae and cell marking to monitor the consistency of the injected cell bolus. After injection, embryo survival analysis is assessed up to 7 days post injection (dpi). Finally, disease burden is also assessed by marking transferred cells with a fluorescent protein and analysis by flow cytometry. Flow cytometry is enabled by a standardized method of preparing cell suspensions from zebrafish embryos, which could also be used in establishing the primary culture of zebrafish cells. In summary, the procedure described here allows a more rapid assessment of the behavior of tumor cells in vivo with larger numbers of animals per study arm and in a more cost-effective manner.

מחבר זרקור: קידום טיפולים בסרטן באמצעות השתלת קסנו-גידול בדגי זברה

We describe a protocol for xenotransplantation into the yolk of transparent zebrafish embryos that is optimized by a simple, rapid staging method. Post-injection analyses include survival and assessing the disease burden of xenotransplanted cells by flow cytometry.

שיטה פשוטה, מהירה ויעילה לניתוח השתלת גידול בעוברים שקופים של דגי זברה

In vivo studies of tumor behavior are a staple of cancer research; however, the use of mice presents significant challenges in cost and time. Here, we ...

Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has transparent embryos and rapid external development. Zebrafish embryos can, therefore, also be used for the rapid evaluation of toxicity of the drugs that are precious and available in small quantities. In the present article, a method for the efficient screening of the toxicity of chemical compounds using 1-5-day post fertilization embryos is described. The embryos are monitored by stereomicroscope to investigate the phenotypic defects caused by the exposure to different concentrations of compounds. Half-maximal lethal concentrations (LC50) of the compounds are also determined. The present study required 3-6 mg of an inhibitor compound, and the whole experiment takes about 8-10 h to be completed by an individual in a laboratory having basic facilities. The current protocol is suitable for testing any compound to identify intolerable toxic or off-target effects of the compound in the early phase of drug discovery and to detect subtle toxic effects that may be missed in the cell culture or other animal models. The method reduces procedural delays and costs of drug development.

Zebrafish embryos are used for evaluating the toxicity of chemical compounds. They develop externally and are sensitive to chemicals, allowing detection of subtle phenotypic changes. The experiment only requires a small amount of compound, which is directly added to the plate containing embryos, making the testing system efficient and cost-effective.

הערכה מהירה של רעילות של תרכובות כימיות באמצעות עוברי הדגים Zebrafish

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has ...

הערכת פרה Bioactivity של OT48 נגד סרטן קומרין Spheroids, מבחני היווצרות המושבה ועל דג זברה Xenografts

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

בדיקת היכולת פולשנית דם של תאים סרטניים דג הזברה (

הקרנה למכפילים מלנומה תוך שימוש במודל גידול כבני מקום דג זברה

הקרנת התרופה של החולה העיקרי הנגזר גידול Xenografts ב Zebrafish

דור של זברה דג זחל קסנוגרפטים וניתוח התנהגות הגידול

קביעת ספרואידים תלת מימדיים מדגימות גידול שמקורן בחולה והערכת רגישותם לתרופות

הקמת קסנוגרפטים מסרטן הלבלב שמקורם בדגי זברה לבדיקת רגישות לכימותרפיה

שיטה פשוטה, מהירה ויעילה לניתוח השתלת גידול בעוברים שקופים של דגי זברה

שיטה פשוטה, מהירה ויעילה לניתוח השתלת גידול בעוברים שקופים של דגי זברה

שיטה פשוטה, מהירה ויעילה לניתוח השתלת גידול בעוברים שקופים של דגי זברה

הערכה מהירה של רעילות של תרכובות כימיות באמצעות עוברי הדגים Zebrafish