Name: preclinical assessment of the bioactivity of the anticancer coumarin ot48 by spheroids, colony formation assays, and zebrafish xenografts
Uploaded: 2018-06-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
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Pesquisa no SNU é suportada por Fundação Nacional de pesquisa (NRF), pela MEST da Coreia para concessão de Tumor microambiente Global Core Research Center (GCRC), [número de concessão 2011-0030001]; por o Seul National University Research Grant e pelo cérebro Coreia (BK21) e mais o programa.

1. colônia formação ensaios
<ol><li>Células de cultura A549 em uma concentração de 20.000 células/cm2 em 15 mL de RPMI1640 celular cultura suplementado com 10% FBS (soro Fetal bovino) e 1% antibióticos num balão de2 75 cm numa incubadora de CO2 a 37 ° C e 5% de CO2.</li>
	<li>No dia do experimento, determine a concentração de células usando um hemocytometer. Coletar 50.000 células por centrifugação a 400 x g durante 7 min em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL e ressuspender as células em 100 µ l de 1 x PBS estéril (fosfato Buffered Saline) em tubos de 1,5 mL.</li>
	<li>Dispense a 1,1 mL de meio de baseada em metilcelulose semi-sólidos (MCBM) em tubos de 15 mL com um multipipette. Prepare um tubo para cada condição.</li>
	<li>Adicione 110 µ l de FBS a 1,1 mL de MCBM utilizando uma micropipeta P200.</li>
	<li>Células de sementes a 1.000 células/mL. Coletar 2.4 µ l de suspensão de células a partir da solução estoque (50.000 células em 100 µ l de PBS 1x) com uma micropipeta de P2 e adicionar a 1,1 mL de MCBM suplementado com 10% FBS.</li>
	<li>Depois de adicionar as células, vórtice os tubos por 1 min, segurando-os verticalmente na velocidade máxima a mistura MCBM e células bem.</li>
	<li>Adicione compostos de teste (OT48 sozinho ou em combinação com A1210477). Prepare um tubo separado como um controle para o solvente utilizado (aqui dimetilsulfóxido (DMSO)). Dependendo da concentração de compostos e o volume adicionado para cada condição, o solvente controle incluirá a maior concentração de solvente utilizado para as diluições de composto, o teste para avaliar os efeitos adversos causados pelo solvente.</li>
	<li>Tubos de vórtice para 1 minuto.</li>
	<li>Para cada ensaio, adicione 1 mL da mistura com uma micropipeta P1000 ao centro de uma placa de cultura de células de 12-bem.</li>
	<li>Preencha o vazios poços com 1 mL de água estéril ou 1X PBS para estabilizar a umidade.</li>
	<li>Incube as placas de cultura por 10 dias em uma incubadora a 37 ° C e 5% de CO2.</li>
	<li>Após 10 dias de incubação, adicione 200 µ l de uma solução-mãe MTT (brometo de methylthiazolyldiphenyl-tetrazólio) (5 mg/mL) a cada poço para atingir uma concentração final de 1 mg/mL.</li>
	<li>Incube 10 min em uma incubadora a 37 ° C e 5% de CO2. Vão virar colônias viáveis violeta.</li>
	<li>Capture a imagem usando uma câmera digital, usando a placa de fundo branco (bandeja de LAS diâmetro branco). Use as seguintes configurações: método, digitalizar; Tipo de exposição, precisão; Tempo de exposição, manual, 1 segundo; Sensibilidade/resolução, alta resolução. Salve a imagem no formato tiff.</li>
	<li>Quantificar as colónias viáveis usando software ImageJ. Seleccionar o menu "imagem | Tipo | 8 bits". Seleccionar o menu "ajuste | Limite". Definir o limiar para controlar e manter constante para todas as condições; Seleccionar o menu "Analyze | Analise as partículas". Salvar os dados e analisar com um software de estatísticas para a representação gráfica.</li>
</ol>2. spheroid formação ensaio
<ol><li>Células de cultura A549 em uma concentração de 20.000 células/cm2 frascos de 75 cm2 com 15 mL de RPMI 1640 suplementado com antibióticos FBS e 1% de 10%.</li>
	<li>No dia do experimento, preparar um 96 bem U-parte inferior da placa.</li>
	<li>Placa de 10.000 células em um poço que já contém o composto de interesse (aqui 50 µM de OT48) e/ou 20 µ m de A1210477. Ajuste o volume final de 100 µ l de meio de cultura celular. O número de células que formam os esferoides uniformes com um limite exterior intacto é considerado adequado para esferoides de formulário.</li>
	<li>Incube durante 3 dias na incubadora a 37 ° C e em 5% CO2.</li>
	<li>Após 3 dias de incubação, capture imagens dos esferoides usando um microscópio com ampliação de 4x.</li>
</ol>3. Zebrafish xenoenxertos ensaio
Nota: Esta abordagem técnica é visualizada como um esquema (Figura 1).
<ol><li>
Preparação de reagentes de estoque
	<ol>
<li>Preparar 1 L de solução do Danieau de 30x: 1740 mM NaCl, 21 mM KCl, 12 mM de MgSO4∙7H2O, 18 mM Ca (NO3)2e 150 mM HEPES. Ajuste o pH do buffer usando um medidor de pH de 7,6.</li>
		<li>Preparar a solução a 1% (50 x) tricaina: dissolver 20 mg de Metanossulfonato de 3-aminobenzoato de etilo (tricaina) em 2 mL de água destilada.</li>
		<li>Prepare-se 1% solução de vermelho de fenol-PBS: adicionar 2 µ l da solução de sal de sódio fenol vermelho a 198 µ l de solução de PBS esterilizada em um tubo de 1,5 µ l.</li>
		<li>Prepare-se 3% metilcelulose: Adicionar 3 g de metilcelulose a 100 mL de solução do Danieau de 1x.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Incubação e produção de ovos de Zebrafish
	<ol>
<li>Separe um feminino e um masculino zebrafish em um tanque de partição preenchido com água da torneira filtrada e UV-esterilizados a 28,5 ° C, no escuro. Após 24h de separação, misture peixes de ambos os sexos para iniciar o acasalamento. Transferi ovos fertilizados do tanque de acasalamento para uma placa de Petri contendo 5 mL de solução de Danieau fresco.</li>
		<li>Lave os ovos três vezes com 5 mL de solução de Danieau. Para a lavagem, Aspire cuidadosamente com os ovos com uma pipeta e transferência para 5 mL de solução fresca. Incubar durante 8 h a 28,5 ° C.<ol>
<li>Após 8 h de incubação em solução do Danieau, altere a solução do Danieau contendo 0,03% 1-fenil-2-tioureia (PTU) para inibir a pigmentação. Classificar ovos opaco (não fertilizados ou contendo embriões subdesenvolvidos) para evitar a contaminação.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dechorionation embrião
	<ol>
<li>24h pós fertilização (hpf), dechorionate zebrafish embriões utilizando Pinças afiadas. Incubar os embriões para incubação em solução do Danieau com 0,03% PTU a 28,5 ° C até 48 hpf.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação da pilha de composto-tratados
	<ol>
<li>Células de A549 semente a 20.000 células/cm2 em frascos de cultura 25 cm2 . Após 24h de semeadura, adicionar compostos (aqui OT48 em 50 µM e e/ou A1210477 a 20 µM) por 24 h na incubadora a 37 ° C e 5% de CO2. Configurar o tempo de tratamento para cada composto para manter a viabilidade das células mas para cometê-los para a morte celular. Desta vez ponto precisa ser configurado individualmente com base na viabilidade celular, morfologia e marcadores moleculares.</li>
		<li>2 h antes do final do tratamento, mancha de células com 4 µM de rastreador celular fluorescente tingem CM-Dil em 37 ° C e 5% de CO2. Após 2 h de incubação, trypsinize células com 0,05% do trypsin-EDTA e diluir 106 células em 50 µ l de solução de vermelho de fenol-PBS antes da injeção.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Microinjeção de células cancerosas para formação de enxerto heterólogo
	<ol>
<li>Anestesia o zebrafish em uma solução de metanosulfonato de 0,02% por 5 min até eles se acalmarem em uma placa de ágar.</li>
		<li>Puxe um 1.0 mm (fora o capilar de vidro de diâmetro (OD)) por um puxador de micropipeta (configurações do programa: p: 300, calor: 260, puxar: 60, VEL: 50 e o tempo: 200). Corte a conta com uma seringa para produzir uma borda afiada. Carregar microcapilares com 20 µ l de célula/vermelho de fenol-solução de PBS. Definir pressão de injeção e tempo para dispensar 2 nL por injecção.</li>
		<li>Injetar o saco vitelino por injetar 6 a 10 células de 100 – 200 nL através de injeções de 3 a 5. Após a injeção, permitir que peixes recuperar-se de 10 a 30 min em 5 mL de solução de Danieau fresco contendo solução PTU. Expedição peixe em placas de 24 poços com 1 mL de solução de Danieau contendo solução PTU é e incube por 72 h a 28,5 ° C.</li>
		<li>Após 72 h de incubação, anestesiar o peixe em uma solução de metanosulfonato de 0,02% e imobilizar em um slide de vidro com uma queda de 3% de metilcelulose. Tirar 5 fotos de x por microscopia de fluorescência no comprimento de onda de 620 a 750 nm.</li>
		<li>Quantificar o tamanho de tumores fluorescentes pelo software ImageJ. Seleccionar o menu "Analyze | Medida". Salvar os valores correspondentes ao sinal fluorescente e analisar com um software de estatísticas para a representação gráfica.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Giancotti, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deregulation+of+cell+signaling+in+cancer.">Deregulation of cell signaling in cancer.</a> FEBS Letters. 588 (16), 2558-2570 (2014).</li><li>Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioprinting+for+cancer+research.">Bioprinting for cancer research.</a> Trends in Biotechnology. 33 (9), 504-513 (2015).</li><li>Santo, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+in+3D+in+vitro+tumor+models:+overcoming+current+pitfalls+of+efficacy+read-outs.">Drug screening in 3D in vitro tumor models: overcoming current pitfalls of efficacy read-outs.</a> Biotechnology Journal. 12 (1), (2017).</li><li>Tanner, K., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+3D+culture+models+of+cancer.">Beyond 3D culture models of cancer.</a> Science Translational Medicine. 7 (283), 283ps289 (2015).</li><li>Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+cell+culture:+a+review+of+current+approaches+and+techniques.">3D cell culture: a review of current approaches and techniques.</a> Methods in Molecular Biology. 695, 1-15 (2011).</li><li>Talhi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bis(4-hydroxy-2H-chromen-2-one):+synthesis+and+effects+on+leukemic+cell+lines+proliferation+and+NF-kappaB+regulation.">Bis(4-hydroxy-2H-chromen-2-one): synthesis and effects on leukemic cell lines proliferation and NF-kappaB regulation.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 22 (11), 3008-3015 (2014).</li><li>Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonogenic+assay+of+cells+in+vitro.">Clonogenic assay of cells in vitro.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).</li><li>Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Tumor+Models:+Advantages,+Disadvantages,+Variables,+and+Selecting+the+Right+Platform.">In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).</li><li>Lee, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytostatic+hydroxycoumarin+OT52+induces+ER/Golgi+stress+and+STAT3+inhibition+triggering+non-canonical+cell+death+and+synergy+with+BH3+mimetics+in+lung+cancer.">Cytostatic hydroxycoumarin OT52 induces ER/Golgi stress and STAT3 inhibition triggering non-canonical cell death and synergy with BH3 mimetics in lung cancer.</a> Cancer Letters. 416, 94-108 (2018).</li><li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+to+the+soft-agar+assay+that+permits+high-throughput+drug+and+genetic+screens+for+cellular+transformation.">Alternative to the soft-agar assay that permits high-throughput drug and genetic screens for cellular transformation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5708-5713 (2015).</li><li>Spoerri, L., Beaumont, K. A., Anfosso, A., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Cell+Cycle+Imaging+in+a+3D+Cell+Culture+Model+of+Melanoma.">Real-Time Cell Cycle Imaging in a 3D Cell Culture Model of Melanoma.</a> Methods in Molecular Biology. 1612, 401-416 (2017).</li><li>Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, F., Weninger, W., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging-+and+Flow+Cytometry-based+Analysis+of+Cell+Position+and+the+Cell+Cycle+in+3D+Melanoma+Spheroids.">Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53486 (2015).</li><li>Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+cell+culture+techniques+for+cancer+drug+discovery.">Advanced cell culture techniques for cancer drug discovery.</a> Biology (Basel). 3 (2), 345-367 (2014).</li><li>Ji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dialkyl+resorcinol+stemphol+disrupts+calcium+homeostasis+to+trigger+programmed+immunogenic+necrosis+in+cancer.">The dialkyl resorcinol stemphol disrupts calcium homeostasis to trigger programmed immunogenic necrosis in cancer.</a> Cancer Letters. 416, 109-123 (2018).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

As taxas de formação de colônia obtidos com MCBM depende do tipo de célula. Geralmente, para as células não-aderentes, o número de colônias é muito mais alto em comparação com células aderentes. Observamos que as células A549 formaram colônias de 30 a 40 após 10 dias. Anteriormente informamos para as células de leucemia diferente que o número de colônias é entre 200 a 2509. Nossos resultados mostraram que OT48 sozinho não produziu uma diminuição significativa do número de co...

Câncer é causada por mutações celulares e consequentemente sinalização de caminhos bioquímicos são rompidos, provocando a divisão celular descontrolada e resistência à morte celular. Tumores interferem com as funções fisiológicas do aparelho digestivo, nervoso, circulatório e posteriormente vizinhas tecidos1. Apesar dos esforços de pesquisa extensiva, cancro continua a ser a doença fatal mais prevalente no mundo2. Medicina de precisão tem sido reconhecida como o fundamento da terapêutica do câncer futuro. Novas entidades moleculares são testadas rotineiramente em combinação com drogas existentes para melhorar os resultados clínicos.
No entanto, uma das significativas limitações associadas com o desenvolvimento de novas terapias alvo eficientes é o fracasso dos ensaios comumente usados para simular o resultado biológico exato da droga exposição3. Descoberta de drogas câncer ainda principalmente se baseia em testar a eficácia de agentes terapêuticos em células cancerosas no culto em culturas 2D monocamada, que são difíceis de validar em ensaios clínicos4. Portanto, há um interesse crescente para desenvolver modelos de câncer melhor que melhor imitam as características nativas de tumores em vivo5. Nos últimos anos, um crescente interesse em modelos 3D cultura resultou no desenvolvimento de metodologias melhoradas para produzir tumor 3D modelos5.
Aqui, apresentamos uma abordagem com três técnicas de cultura celular 3D diferentes permitindo melhorar o entendimento da potência da Hidroxicumarina OT486 em combinação com BH3 mimetics anterior mais em profundidade no vivo ensaios. Nosso método consiste em combinar colônia e SFAs com um in vivo tumor formação teste baseado em um modelo de zebrafish de validar a eficácia da combinação de OT48 e BH3 mimetics em células de câncer de pulmão e monitorar a progressão do câncer na vida organismo.
Ensaios de formação de colônia são rotineiramente usados para avaliar a eficácia de agentes anticancerígenos para cânceres sólidos tanto hematopoiéticas. O ensaio determina a capacidade de uma célula para proliferar indefinidamente e formam colônias7. O efeito de um agente anticâncer sobre a capacidade das células formadoras é determinado pela diminuição do número e/ou tamanho das colônias.
Esferoides representam modelos de tumor em vitro e servem como uma plataforma de triagem de baixo custo para agentes anticancerígenos. Esferoides são agregados de células crescendo em suspensão ou incorporado em uma matriz 3D. Esta abordagem é amplamente utilizada para triagem de drogas e estudos de tumor crescimento, proliferação e imune interação8.
Para compreender as propriedades de um novo fármaco, é essencial para realizar experimentos na vivo em roedores. No entanto, esse método convencional é caro e demorado. Nos últimos anos, o peixe-zebra (Danio rerio) tornou-se um organismo de laboratório amplamente estudados que é mais barato e mais rápido para levantar. Tumores desenvolvem na abordagem de cultura de células no zebrafish representam um 3D, mas dentro do ambiente na vivo de um vertebrado9.
No total, aqui usamos três abordagens diferentes cultura 3D, incluindo APC, SFAs e zebrafish na vivo formação de tumor para demonstrar a capacidade anticancerígena de Hidroxicumarina OT48 em um modelo de célula do pulmão câncer A549 em combinação com mimetics BH3.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Materials required for colony formation assays&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>37 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>30096</td><td>4 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1520-500</td><td>-20 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Lonza</td><td>17-602E</td><td>-20 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>Cell culture flask T75</td><td>SPL</td><td>70075</td><td>RT</td></tr><tr><td>PBS solution</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.02</td><td>RT</td></tr><tr><td>1.5ml tube</td><td>Extragene</td><td>Tube-170-C</td><td>RT</td></tr><tr><td>15 ml tube</td><td>Hyundai Micro</td><td>H20015</td><td>RT</td></tr><tr><td>12 well plate</td><td>SPL</td><td>30012</td><td>RT</td></tr><tr><td>MethoCult</td><td>StemCell technologies</td><td>4230</td><td>-20 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT powder)</td><td>Sigma</td><td>M5622</td><td>4 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>LAS4000</td><td>GE Healthcare Technologies</td><td></td><td>RT</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials required for spheroid formation assay&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>37 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>30096</td><td>4 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1520-500</td><td>-20 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Lonza</td><td>17-602E</td><td>-20 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>Cell culture flask T75</td><td>SPL</td><td>70075</td><td>RT</td></tr><tr><td>PBS solution</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.02</td><td>RT</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25-300-054</td><td>4 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>Corning costar ultra low attachemnt 96 well plate</td><td>Corning</td><td>3474</td><td>RT</td></tr><tr><td>Microscopy</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100</td><td>RT</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials required for zebrafish xenografts&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>37 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>30096</td><td>4 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1520-500</td><td>-20 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Lonza</td><td>17-602E</td><td>-20 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>Cell culture flask T25</td><td>SPL</td><td>70025</td><td>RT</td></tr><tr><td>Cell culture flask T75</td><td>SPL</td><td>70075</td><td>RT</td></tr><tr><td>Cell culture flask T175</td><td>SPL</td><td>71175</td><td>RT</td></tr><tr><td>1.5ml tube</td><td>Extragene</td><td>Tube-170-C</td><td>RT</td></tr><tr><td>24 well plate</td><td>SPL</td><td>30024</td><td>RT</td></tr><tr><td>Petridish</td><td>SPL</td><td>10100</td><td>RT</td></tr><tr><td>PBS solution</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.02</td><td>RT</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25-300-054</td><td>4 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71382</td><td>RT</td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>RT</td></tr><tr><td>Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2773</td><td>RT</td></tr><tr><td>Calcium nitrate tetrahydrate (Ca(NO3)2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1396</td><td>RT</td></tr><tr><td>HEPES solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td>RT</td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>RT</td></tr><tr><td>Phenol Red solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td>RT</td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0512</td><td>RT</td></tr><tr><td>1-phenyl-2-thiourea (PTU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td>RT</td></tr><tr><td>CM-Dil dye</td><td>Invitrogen</td><td>C7001</td><td>-20 C&amp;deg;</td></tr><tr><td>Glass capillary</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW 100F-4</td><td>RT</td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Shutter instrument, USA</td><td>P-97</td><td>RT</td></tr><tr><td>Micro injector</td><td>World Precision Instruments</td><td>PV820</td><td>RT</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>KOVAX</td><td>1ml</td><td>RT</td></tr><tr><td>Micro loader</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>RT</td></tr><tr><td>Glass slide</td><td>Marienfeld</td><td>HSU-1000612</td><td>RT</td></tr><tr><td>Fluorescence microscopy</td><td>Leica</td><td>DE/DM 5000B</td><td>RT</td></tr></tbody></table>

preclinical assessment of the bioactivity of the anticancer coumarin ot48 by spheroids, colony formation assays, and zebrafish xenografts

Rastreio pré-clínico in vitro e em vivo de novos agentes terapêuticos são uma ferramenta essencial na descoberta da droga de cancro. Apesar de linhas de células cancerosas humanas respondem aos compostos terapêuticos em culturas de células 2D monocamada (dimensional), sistemas de cultura 3D foram desenvolvidos para compreender a eficácia de drogas em modelos mais fisiologicamente relevantes. Nos últimos anos, observou-se uma mudança de paradigma na pesquisa pré-clínica para validar a potência de novas moléculas nos sistemas de cultura 3D, mais precisamente, imitando o microambiente do tumor. Estes sistemas caracterizam o estado de doença de uma forma mais fisiologicamente relevante e ajudam a obter melhor visão mecanicista e compreensão da potência farmacológica de uma determinada molécula. Além disso, com a tendência atual na melhoria na vivo modelos de câncer, o zebrafish tem emergido como um importante modelo de vertebrados para avaliar a formação de tumor na vivo e estudar o efeito de agentes terapêuticos. Aqui, nós investigamos o efeito terapêutico de Hidroxicumarina OT48 sozinho ou em combinação com BH3 mimetics em linhagem de células de câncer de pulmão A549 usando três sistemas diferentes de cultura 3D, incluindo ensaios de formação de Colônia (CFA), ensaio de formação de esferoide (SFA) e na vivo xenografts zebrafish.

Na Figura 2, câncer de pulmão de células linha A549 foi semeada em MCBM que formam colônias após o tratamento com OT48 sozinho ou em combinação com BH3 mimética A1210477 nas concentrações indicadas. Os resultados mostraram que a combinação significativamente reduzido número, tamanho e área de superfície total das colônias após 10 dias de incubação.
Na Figura 3...

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Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts

Avaliação pré-clínica da Bioatividade da OT48 de cumarina Anticancer esferoides, ensaios de formação de colônia e Xenografts Zebrafish

Aqui, apresentamos o rastreio pré-clínico de cumarinas anticâncer usando zebrafish e cultura 3D.

In vitro and in vivo pre-clinical screening of novel therapeutic agents are an essential tool in cancer drug discovery. Although human cancer cell lines ...

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

8.3K visualizações.  Seoul National University. Aqui, apresentamos o rastreio pré-clínico de cumarinas anticâncer usando zebrafish e cultura 3D.

Vídeo: Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts

Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish (Danio Rerio)

Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression. Traditional in vitro models of cancer cell invasion of endothelia typically lack the fluid dynamics that invading cells are otherwise exposed to in vivo. However, in vivo systems such as mouse models, though more physiologically relevant, require longer experimental timescales and present unique challenges associated with monitoring and data analysis. Here we describe a zebrafish assay that seeks to bridge this technical gap by allowing for the rapid assessment of cancer cell vascular invasion and extravasation. The approach involves injecting fluorescent cancer cells into the precardiac sinus of transparent 2-day old zebrafish embryos whose vasculature is marked by a contrasting fluorescent reporter. Following injection, the cancer cells must survive in circulation and subsequently extravasate from vessels into tissues in the caudal region of the embryo. Extravasated cancer cells are efficiently identified and scored in live embryos via fluorescence imaging at a fixed timepoint. This technique can be modified to study intravasation and/or competition amongst a heterogeneous mixture of cancer cells by changing the injection site to the yolk sac. Together, these methods can evaluate a hallmark behavior of cancer cells and help uncover mechanisms indicative of malignant progression to the metastatic phenotype.

Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish Danio Rerio

This method utilizes zebrafish embryos to efficiently test the vascular invasive ability of cancer cells. Fluorescent cancer cells are injected into the precardiac sinus or yolk sac of developing embryos. Cancer cell vascular invasion and extravasation is assessed via fluorescence microscopy of the tail region 24 to 96 hr later.

Teste da capacidade Vascular invasiva das células cancerosas no peixe-zebra (<em&gt; Danio rerio</em&gt;)

Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression.  Traditional in vitro models of cancer cell invasion of ...

Pesquisa do câncer

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Genomic studies of human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered in tumors1,2,3. A challenge arising from these studies is that many genes are altered, and it can be difficult to distinguish genetic alterations that drove tumorigenesis from that those arose incidentally during transformation. To draw this distinction it is beneficial to have an assay that can quantitatively measure the effect of an altered gene on tumor initiation and other processes that enable tumors to persist and disseminate. Here we present a rapid means to screen large numbers of candidate melanoma modifiers in zebrafish using an autochthonous tumor model4 that encompasses steps required for melanoma initiation and maintenance. A key reagent in this assay is the miniCoopR vector, which couples a wild-type copy of the mitfa melanocyte specification factor to a Gateway recombination cassette into which candidate melanoma genes can be recombined5. The miniCoopR vector has a mitfa rescuing minigene which contains the promoter, open reading frame and 3'-untranslated region of the wild-type mitfa gene. It allows us to make constructs using full-length open reading frames of candidate melanoma modifiers. These individual clones can then be injected into single cell Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf)zebrafish embryos. The miniCoopR vector gets integrated by Tol2-mediated transgenesis6 and rescues melanocytes. Because they are physically coupled to the mitfa rescuing minigene, candidate genes are expressed in rescued melanocytes, some of which will transform and develop into tumors. The effect of a candidate gene on melanoma initiation and melanoma cell properties can be measured using melanoma-free survival curves, invasion assays, antibody staining and transplantation assays.

A rapid way to screen for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model is presented. It takes advantage of the miniCoopR vector which allows for expression of candidate melanoma genes in melanocytes. A method to obtain melanoma-free survival curves, an invasion assay, a protocol for antibody staining of scale melanocytes and a melanoma transplantation assay are described.

Triagem para Modificadores Melanoma usando um modelo de tumor Zebrafish autóctone

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Medicina

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the standard in the field, but zebrafish have emerged as an alternative model with several advantages, including the ability for high-throughput and low-cost drug screening. Zebrafish also allow for in vivo drug screening with large replicate numbers that were previously only obtainable with in vitro systems. The ability to rapidly perform large scale drug screens may open up the possibility for personalized medicine with rapid translation of results back to clinic. Zebrafish xenograft models could also be used to rapidly screen for actionable mutations based on tumor response to targeted therapies or to identify new anti-cancer compounds from large libraries. The current major limitation in the field has been quantifying and automating the process so that drug screens can be done on a larger scale and be less labor-intensive. We have developed a workflow for xenografting primary patient samples into zebrafish larvae and performing large scale drug screens using a fluorescence microscope equipped imaging unit and automated sampler unit. This method allows for standardization and quantification of engrafted tumor area and response to drug treatment across large numbers of zebrafish larvae. Overall, this method is advantageous over traditional cell culture drug screening as it allows for growth of tumor cells in an in vivo environment throughout drug treatment, and is more practical and cost-effective than mice for large scale in vivo drug screens.

Zebrafish xenograft models allow for high-throughput drug screening and fluorescent imaging of human cancer cells in an in vivo microenvironment. We developed a workflow for large scale, automated drug screening on patient-derived leukemia samples in zebrafish using an automated fluorescence microscope equipped imaging unit.

Triagem de drogas de xenoenxertos tumorais derivados do paciente primário em zebrafish

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly visualizing the response to anti-cancer therapies (chemo, radiotherapy, and biologicals), angiogenesis and metastasis with single cell resolution, places the zebrafish xenograft model as a top choice to develop preclinical studies.

The zebrafish larval xenograft assay presents several experimental advantages compared to other models, but probably the most striking is the reduction of size scale and consequently time. This reduction of scale allows single cell imaging, the use of a relatively low number of human cells (compatible with biopsies), medium-high-throughput drug screenings, but most importantly enables a significant reduction of the time of the assay. All these advantages make the zebrafish xenograft assay extremely attractive for future personalized medicine applications.

Many zebrafish xenograft protocols have been developed with a wide diversity of human tumors; however, a general and standardized protocol to efficiently generate zebrafish larval xenografts is still lacking. Here we provide a step-by-step protocol, with tips to generate xenografts and guidelines for tumor behavior analysis, whole-mount immunofluorescence, and confocal imaging quantification.

Here, we provide a step-by-step protocol, with tips to generate xenografts and guidelines for tumor behavior analysis, whole-mount immunofluorescence, and confocal imaging quantification.

Geração de Xenoenxertos Larval de Zebrafish e Análise do Comportamento do Tumor

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a lack of clinical efficacy. This high failure rate illuminates the inability of the current preclinical models to predict clinical efficacy, mainly due to their inadequacy in reflecting tumor heterogeneity and the tumor microenvironment. These limitations can be addressed with 3-dimensional (3D) culture models (spheroids) established from human tumor samples derived from individual patients. These 3D cultures represent real-world biology better than established cell lines that do not reflect tumor heterogeneity. Furthermore, 3D cultures are better than 2-dimensional (2D) culture models (monolayer structures) since they replicate elements of the tumor environment, such as hypoxia, necrosis, and cell adhesion, and preserve the natural cell shape and growth. In the present study, a method was developed for preparing primary cultures of cancer cells from individual patients that are 3D and grow in multicellular spheroids. The cells can be derived directly from patient tumors or patient-derived xenografts. The method is widely applicable to solid tumors (e.g., colon, breast, and lung) and is also cost-effective, as it can be performed in its entirety in a typical cancer research/cell biology lab without relying on specialized equipment. Herein, a protocol is presented for generating 3D tumor culture models (multicellular spheroids) from primary cancer cells and evaluating their sensitivity to drugs using two complementary approaches: a cell-viability assay (MTT) and microscopic examinations. These multicellular spheroids can be used to assess potential drug candidates, identify potential biomarkers or therapeutic targets, and investigate the mechanisms of response and resistance.

The present protocol describes generating 3D tumor culture models from primary cancer cells and evaluating their sensitivity to drugs using cell-viability assays and microscopic examinations.

Estabelecendo esferoides tridimensionais de amostras tumorais derivadas de pacientes e avaliando sua sensibilidade a drogas

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Establishment of Zebrafish Patient-Derived Xenografts from Pancreatic Cancer for Chemosensitivity Testing

Cancer is one of the main causes of death worldwide, and the incidence of many types of cancer continues to increase. Much progress has been made in terms of screening, prevention, and treatment; however, preclinical models that predict the chemosensitivity profile of cancer patients are still lacking. To fill this gap, an in vivo patient-derived xenograft model was developed and validated. The model was based on zebrafish (Danio rerio) embryos at 2 days post fertilization, which were used as recipients of xenograft fragments of tumor tissue taken from a patient's surgical specimen. 
It is also worth noting that bioptic samples were not digested or disaggregated, in order to maintain the tumor microenvironment, which is crucial in terms of analyzing tumor behavior and the response to therapy. The protocol details a method for establishing zebrafish-based patient-derived xenografts (zPDXs) from primary solid tumor surgical resection. After screening by an anatomopathologist, the specimen is dissected using a scalpel blade. Necrotic tissue, vessels, or fatty tissue are removed and then chopped into 0.3 mm x 0.3 mm x 0.3 mm pieces. 
The pieces are then fluorescently labeled and xenotransplanted into the perivitelline space of zebrafish embryos. A large number of embryos can be processed at a low cost, enabling high-throughput in vivo analyses of the chemosensitivity of zPDXs to multiple anticancer drugs. Confocal images are routinely acquired to detect and quantify the apoptotic levels induced by chemotherapy treatment compared to the control group. The xenograft procedure has a significant time advantage, since it can be completed in a single day, providing a reasonable time window to carry out a therapeutic screening for co-clinical trials.

Preclinical models aim to advance the knowledge of cancer biology and predict treatment efficacy. This paper describes the generation of zebrafish-based patient-derived xenografts (zPDXs) with tumor tissue fragments. The zPDXs were treated with chemotherapy, the therapeutic effect of which was assessed in terms of cell apoptosis of the transplanted tissue.

Estabelecimento de Xenoenxertos Derivados de Pacientes com Zebrafish de Câncer de Pâncreas para Teste de Quimiosensibilidade

Cancer is one of the main causes of death worldwide, and the incidence of many types of cancer continues to increase. Much progress has been made in terms ...

Utilizando larvas de peixe-zebra para estudos eficientes de tumores in vivo

A Simple, Rapid, and Effective Method for Tumor Xenotransplantation Analysis in Transparent Zebrafish Embryos

In vivo studies of tumor behavior are a staple of cancer research; however, the use of mice presents significant challenges in cost and time. Here, we present larval zebrafish as a transplant model that has numerous advantages over murine models, including ease of handling, low expense, and short experimental duration. Moreover, the absence of an adaptive immune system during larval stages obviates the need to generate and use immunodeficient strains. While established protocols for xenotransplantation in zebrafish embryos exist, we present here an improved method involving embryo staging for faster transfer, survival analysis, and the use of flow cytometry to assess disease burden. Embryos are staged to facilitate rapid cell injection into the yolk of the larvae and cell marking to monitor the consistency of the injected cell bolus. After injection, embryo survival analysis is assessed up to 7 days post injection (dpi). Finally, disease burden is also assessed by marking transferred cells with a fluorescent protein and analysis by flow cytometry. Flow cytometry is enabled by a standardized method of preparing cell suspensions from zebrafish embryos, which could also be used in establishing the primary culture of zebrafish cells. In summary, the procedure described here allows a more rapid assessment of the behavior of tumor cells in vivo with larger numbers of animals per study arm and in a more cost-effective manner.

Autor em destaque: Avançando na terapêutica do câncer usando xenotransplante tumoral em peixe-zebra

We describe a protocol for xenotransplantation into the yolk of transparent zebrafish embryos that is optimized by a simple, rapid staging method. Post-injection analyses include survival and assessing the disease burden of xenotransplanted cells by flow cytometry.

Um método simples, rápido e eficaz para análise de xenotransplante tumoral em embriões transparentes de peixe-zebra

In vivo studies of tumor behavior are a staple of cancer research; however, the use of mice presents significant challenges in cost and time. Here, we ...

Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has transparent embryos and rapid external development. Zebrafish embryos can, therefore, also be used for the rapid evaluation of toxicity of the drugs that are precious and available in small quantities. In the present article, a method for the efficient screening of the toxicity of chemical compounds using 1-5-day post fertilization embryos is described. The embryos are monitored by stereomicroscope to investigate the phenotypic defects caused by the exposure to different concentrations of compounds. Half-maximal lethal concentrations (LC50) of the compounds are also determined. The present study required 3-6 mg of an inhibitor compound, and the whole experiment takes about 8-10 h to be completed by an individual in a laboratory having basic facilities. The current protocol is suitable for testing any compound to identify intolerable toxic or off-target effects of the compound in the early phase of drug discovery and to detect subtle toxic effects that may be missed in the cell culture or other animal models. The method reduces procedural delays and costs of drug development.

Zebrafish embryos are used for evaluating the toxicity of chemical compounds. They develop externally and are sensitive to chemicals, allowing detection of subtle phenotypic changes. The experiment only requires a small amount of compound, which is directly added to the plate containing embryos, making the testing system efficient and cost-effective.

Avaliação rápida da toxicidade de compostos químicos usando embriões de zebrafish

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has ...

Avaliação pré-clínica da Bioatividade da OT48 de cumarina Anticancer esferoides, ensaios de formação de colônia e Xenografts Zebrafish

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Teste da capacidade Vascular invasiva das células cancerosas no peixe-zebra (

Triagem para Modificadores Melanoma usando um modelo de tumor Zebrafish autóctone

Triagem de drogas de xenoenxertos tumorais derivados do paciente primário em zebrafish

Geração de Xenoenxertos Larval de Zebrafish e Análise do Comportamento do Tumor

Estabelecendo esferoides tridimensionais de amostras tumorais derivadas de pacientes e avaliando sua sensibilidade a drogas

Estabelecimento de Xenoenxertos Derivados de Pacientes com Zebrafish de Câncer de Pâncreas para Teste de Quimiosensibilidade

Um método simples, rápido e eficaz para análise de xenotransplante tumoral em embriões transparentes de peixe-zebra

Um método simples, rápido e eficaz para análise de xenotransplante tumoral em embriões transparentes de peixe-zebra

Um método simples, rápido e eficaz para análise de xenotransplante tumoral em embriões transparentes de peixe-zebra

Avaliação rápida da toxicidade de compostos químicos usando embriões de zebrafish