Das Sekretum des Mtb-Kulturfiltrats würde Aufschluss über die Virulenzfaktoren oder andere Proteine geben, die vom Erreger für therapeutische Eingriffe sezerniert werden. Hier versuchen wir, die bakteriellen sezernierten Proteine herauszufinden, die eine Vorstellung vom Sekretionssystem von Mtb, seinen unbekannten Virulenzfaktoren und ihrem Einfluss auf die Wirtsmodulation für das Überleben des Erregers im Wirt geben würden. Im Bereich der Mtb-Forschung können Medikamente wie Bedaquilin und Delamanid zur Behandlung von MDR und äußeren Stämmen eingesetzt werden.
Es wird immer noch an der Entwicklung von Medikamenten gegen MDR und XDR sowie an Impfstoffen gegen Mtb geforscht. Mtb erhält immer mehr Resistenzen, weil die Medikamentenschemata nicht eingehalten werden. Die Behandlung der MDR- und XDR-Stämme ist die anspruchsvollste Aufgabe im Bereich der Mtb-Forschung.
Unsere Gruppe hat mehrere wichtige Erkenntnisse auf diesem Gebiet gewonnen. Unser Labor zeigte den Einfluss der Phosphorylierung von CFP-10 auf die Mtb-Virulenz und etablierte das Phospho-Proteom, das Phospho-Sekretum und das Sekretum-Netzwerk von Mtb. Darüber hinaus hat eine Arbeit aus dem Labor gezeigt, dass der SecA2-Sekretor die DNA-Schäden im Wirt vermittelt.
Die Behandlung von Zellen mit kulturgefilterten Proteinen anstelle von Bakterien verändert den Zytokinspiegel und andere immunmodulatorische Faktoren. Mit Hilfe der Sekretuntersuchung kann man neue virulente Faktoren und ihre Rolle bei der Virulenz identifizieren. Zu Beginn entfernen Sie vier unabhängige Mtb-Glycerinstiele aus minus 80 Grad Celsius und tauen sie bei Raumtemperatur auf.
10 Milliliter des Mediums 7H9, das 10 % Albumin-Dextrose-Katalase enthält, werden in einen 100-Milliliter-Autoklav-Erlenmeyerkolben mit Schraubverschluss gegossen. Impfen Sie den gesamten aufgetauten Glycerinstiel in das Medium, um die Kultur, die als Primärkultur dient, wiederzubeleben. Inkubieren Sie den Kulturkolben bei 37 Grad Celsius in einem Inkubatorschüttler bei 100 Umdrehungen pro Minute für drei bis vier Tage.
Messen Sie am fünften Tag die Absorption bei 600 Nanometern. Wenn die Kultur eine optische Dichte zwischen 0,8 und eins erreicht, beimpfen Sie die Sekundärkultur mit 100 Millilitern 7H9-Medium mit 10 % ADC in einem 500-Milliliter-Kolben. Züchten Sie die Sekundärkultur bei 37 Grad Celsius in einem Inkubatorschüttler bei 100 Umdrehungen pro Minute für zwei bis drei Tage.
Wenn die optische Dichte bei 600 Nanometern etwa 0,8 erreicht, entnehmen Sie 10 Mikroliter der Kultur mit einer Pipette mit einer Filterspitze und platzieren Sie sie auf einer LB-Schneckenplatte ohne Antibiotika in der Bakterienhaube. Inkubieren Sie die Platte 12 bis 16 Stunden lang bei 37 Grad Celsius, um sie auf bakterielle Kontamination zu überprüfen. Nun inokulieren Sie die Bakterien aus der kontaminationsfreien Sekundärkultur in 100 Milliliter Sauton-Medium in einem 500-Milliliter-Kolben.
Lassen Sie die Kultur drei bis vier Tage lang bei 37 Grad Celsius wachsen, bis die optische Dichte etwa 0,8 erreicht. Verwenden Sie die Kultur, die auf eine optische Dichte von etwa 0,8 in Sautons Medium gezüchtet wurde, um neue 300-Milliliter-Kulturen für die Filtratvorbereitung zu impfen. Besorgen Sie sich zunächst 300 Milliliter Mtb-Kultur in der log-Phase, die in Sautons Medien gezüchtet wurde.
Pelletieren Sie die Zellen in einem 50-Milliliter-Röhrchen bei 2.100 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie mit einer serologischen 25-Milliliter-Pipette 45 Milliliter Überstand in ein neues Röhrchen und legen Sie das unberührte Pellet für die Herstellung des Ganzzelllysats beiseite. Wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt mit dem Überstand bei 2.100 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.
Übertragen Sie 40 Milliliter des Überstands in ein neues Röhrchen, wobei fünf Milliliter unberührt bleiben. Filtern Sie nun den Kulturüberstand mit einem 0,2-Mikron-Spritzenvorsatzfilter in neue Röhrchen. Impfen Sie ein Milliliter des Kulturfiltrats auf eine Schneckenplatte und inkubieren Sie es vier Wochen lang bei 37 Grad Celsius, um es auf Kontamination zu überprüfen.
Resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter 1X PBS G mit Phenylmethylsulfonylfluorid und 1X Proteasehemmer-Cocktail. Übertragen Sie das Lysat in ein zwei Milliliter Schraubverschluss B Perlenröhrchen, das zu einem Drittel mit 0,1 Millimeter Zirkonoxidkügelchen gefüllt ist. Führen Sie acht Zyklen mit einminütigem Perlenschlagen durch, gefolgt von zwei Minuten Inkubation auf Eis.
Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 18.000 g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Sammeln Sie den Überstand in einem frischen 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das auf Eis gestellt wird. Nach Wiederholung des Zentrifugationsschritts wird der Überstand durch einen 0,2-Mikrometer-Spritzenvorsatzfilter filtriert, um pathogene bakterielle Kontaminationen zu eliminieren.
Lagern Sie die Lysate bei minus 80 Grad Celsius. Geben Sie zunächst 15 Milliliter des Mtb-Kulturfiltrats in eine drei Kilodalton große Centricon-Filtereinheit. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 2.100 g für eine Stunde bei vier Grad Celsius.
Wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt 15 bis 16 Mal, bis das Kulturfiltrat auf etwa einen Milliliter reduziert ist. Aliquotieren Sie 100 Mikroliter der konzentrierten Kulturfiltratproteine in 10 Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Proteinbindung. Schätzen Sie die Proteinkonzentration mit dem Bicinchoninsäure-Protein-Assay-Kit.
Fügen Sie 175 Mikroliter des gemischten Reagenzes gemäß den Anweisungen des Herstellers hinzu. Nachdem Sie die Proben gemischt haben, inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Messen Sie die Absorptionswerte bei 562 Nanometern mit einem ELISA-Lesegerät.
