Name: stereotactic adoptive transfer of cytotoxic immune cells in murine models of orthotopic human glioblastoma multiforme xenografts
Uploaded: 2018-09-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stereotactic Adoptive Transfer of Cytotoxic Immune Cells in Murine Models of Orthotopic Human Glioblastoma Multiforme Xenografts at JoVE.com

Die Autoren danken die Mitarbeitern der der Universitätsklinik Tierhaus (UTE) von Nantes für Tierhaltung und Pflege, die zelluläre und tissular imaging-zentrale Einrichtung der Universität Nantes (MicroPICell) für die Bildgebung und Zytometrie Anlage (Cytocell) von Nantes für ihre kompetente technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von INSERM, CNRS Université de Nantes, Institut National du Cancer (Inka #PLBio2014-155), Ligue Nationale Contre le Cancer (AO interregionale 2017) und das Europäische Konsortium ERA-Net Transcan2 finanziert (Immunoglio). Das Team wird von der Fondation Pour la Recherche Medicale (DEQ20170839118) finanziert. Diese Arbeit wurde im Rahmen des LabEX IGO realisiert und die IHU-Cesti-Programme, unterstützt von der nationalen Forschung Agentur Investissements Avenir über die Programme ANR-11-LABX-0016-01 und ANR-10-IBHU-005, bzw.. IHU-Cesti-Projekt wird auch von Nantes Metropole und der Region Pays De La Loire unterstützt. Die Autoren danken für seine Hilfe bei der Korrektur des Manuskripts Chirine Rafia.

Die folgenden Verfahren mit tierischen Themen erfolgte nach institutionellen Richtlinien (Vereinbarung #00186.02; regionalen Ethik-Kommission der Pays De La Loire [Frankreich]). Menschlichen PBMCs wurden isoliert aus dem Blut von informierten gesunden Spendern (Etablissement Français du Sang Nantes, Frankreich) gesammelt. Alle Schritte werden unter sterilen Bedingungen durchgeführt.
1. nicht-spezifische Erweiterung der zytotoxischen Effektor T-Lymphozyten
<ol><li>Bereiten und Feeder-Zellen bei 35 Gy zu bestrahlen. Die Stimulation von 2 x 105 - 4 x 105 Effektorzellen, Vorbereitung 10 x 106 PBMCs und 1 x 106 BLCLs von drei unterschiedliche, gesunden Spendern.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie Feeder-Zellen und Effektorzellen in 15 mL RPMI ergänzt mit 10 % Hitze-inaktivierten FCS, 2 mM L-Glutamin, (100 IE/mL), Penicillin und Streptomycin (0,1 µg/mL) und 300 IU/mL rekombinantes Il-2.</li>
	<li>PHA-L auf eine Endkonzentration von 1 µg/mL hinzufügen, vorsichtig mischen und 150 µL Zellsuspension pro Bohrloch in 96-Well U-Boden Platten zu verteilen.</li>
	<li>Inkubation bei 37 ° C und mit 5 % CO2 in eine feuchte Atmosphäre.</li>
	<li>Täglich prüfen die Platte bis großzellige Form in den Kultur-Brunnen Klumpen (~ 7 Tage).</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellen in einer Kultur Kolben 1 x 106 Zellen/ml in frischem Nährmedium.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Anzahl der gesamten Zelle durch zählen (2 x pro Woche) und pflegen sie auf 1 x 106 Zellen/mL in frischem Nährmedium. Hinweis: Effektor Immunzellen soll für die therapeutische Verwaltung in einen Ruhezustand (in der Regel 3 Wochen nach anfänglichen Verstärkung Reiz) vorliegen. Die Reinheit und die Reaktivität dieser Effektor-Zellen sollten vor dem in-Vivo -Injektionen (z. B. in-vitro- Tests) überprüft werden.</li>
</ol>2. präoperative Effektor Zellen Vorbereitung
<ol><li>Nach der Überprüfung der Effektor-Zellzahl, sammeln Sie die Effektorzellen in ein 50-mL-Tube durch Zentrifugieren (300 X g für 5 min). Hinweis: Um den Verlust auszugleichen, bereiten Sie ein Übermaß an Zellen (z.B. 50 x 10-6).</li>
	<li>Sorgfältig entfernen des Überstands und Aufschwemmen der Zellen in 15 mL sterile PBS und Zentrifuge für 5 min bei 300 X g Wash durchzuführen.</li>
	<li>Sorgfältig und vollständig entfernen des Überstands und dann die Zelle Pellet in 1 mL sterile PBS aufzuwirbeln.</li>
	<li>Die resuspendierte Zellen in einem 1,5 mL reaktionscup für Zentrifugation bei 300 X g für 5 min zu übertragen.</li>
	<li>Sorgfältig und vollständig entfernen des Überstands durch pipettieren langsam.</li>
	<li>Aufschwemmen der Zelle Pellet in 8 µL steriler PBS per Mausklick. Hinweis: Dies ist ein entscheidender Schritt.</li>
	<li>Messen Sie das Volumen der Zellsuspension mithilfe einer Mikropipette. Ggf. sterile PBS (20 x 106 Zellen in 15 µL PBS pro Dosis) hinzufügen und vorsichtig umrühren.</li>
	<li>Überprüfen Sie, mit einer Mikropipette, das ist das Endvolumen per Mausklick zwischen 15 und 20 μl (Imperativ < 20 µL).</li>
	<li>Bewahren Sie die Zellen auf Eis bis Stereotaktische Injektion. Hinweis: mehr als 3 h Zeitpunkte wurden nicht getestet.</li>
</ol>(3) Stereotaktische Injektion
<ol><li>
Geräte-Setup
	<ol>
<li>Montieren und einen kleinen Tieren stereotaktischen Rahmen entsprechend den Anweisungen des Herstellers für die Richtigkeit der intrakraniellen Injektionen (z.B., Spritze Größe, gewünschte Lautstärke und Geschwindigkeit der Injektion) zu kalibrieren. Hinweis: Eine langsame Infusionsrate wird (d.h.2-3 µL/min) empfohlen.</li>
		<li>Installieren Sie das Material unter einer mikrobiellen Sicherheitsschrank (MSC), um die Sterilität der Instrumente zu erhalten und die Mäusen zu schützen vor Infektionen. Hinweis: statt "Isothermen Blöcke" in einem Wasserbad bei 37 ° C. Dieses System schränkt die Unterkühlung von Mäusen während der Operation. Heizkissen, die für die Post-prozessualen Pflege notwendig sind, muss während die kontinuierliche Temperaturüberwachung verwendet werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Präoperative Vorbereitung der Tiere
	<ol>
<li>Eine Maus mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (10 mg/mL) und Xylazin (0,1 mg/mL) 10 µL/g Körpergewicht von der Maus zu betäuben.</li>
		<li>Führen Sie eine Zehe kneiftest um die komplette Anästhesie und Analgesie des Tieres sicherzustellen. Hinweis: Jede Bewegung ist ein Hinweis auf nicht-tief Analgesie und in diesem Fall ein paar Minuten sind erforderlich, bevor der Vorgang zu wiederholen.</li>
		<li>Sobald die Maus richtig betäubt ist, mit einer Schere um das Fell aus der Operationsstelle (zwischen den beiden Ohren, bis die Nase) zu entfernen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Präoperative Handy Vorbereitung
	<ol>
<li>Aufschwemmen Sie die Zellen mit einer Pipette sorgfältig (mehrmals) vor jeder Injektion einer beliebigen Zelle Verklumpen zu verhindern.</li>
		<li>Zeichnen Sie sorgfältig die erforderlichen Zellvolumen der Aufhängung (15-20 µL) in der 22-G-Microsyringe, die Aspiration von Luftblasen zu vermeiden. Hinweis: Dieser Zelle be-Schritt in der Microsyringe ist wichtig, Abweichungen in der injizierten Volumina zu minimieren. Laden Sie Zellen für jede einzelne Injektion zwischen Verfahren, jede Zelle Verklumpen zu verhindern und eine gerade Anzahl von Effektor Zellen Verwaltung in der Kohorte zu gewährleisten.</li>
		<li>Legen Sie die Spritze in die angepasste Spritzenpumpe.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Verfahrenstechnische Betreuung
	<ol>
<li>Desinfizieren der Operationsstelle mit Tupfer getränkt in 5 % Povidon-Jod-Lösung mindestens 3 X.</li>
		<li>Legen Sie eine Schmier ophthalmologische Salbe in der Maus Augen zu verhindern jede Austrocknen der Hornhaut.</li>
		<li>Position der narkotisierten Maus auf der Stereotaktische Rahmen auf einem warmen Isothermen Block bedeckt mit einer sterilen Plastikfolie zu halten die Maus Temperatur während der Operation und die Sterblichkeit zu begrenzen. Hinweis: Der Maus Nase und Zähne sollten angemessen über die Zahn-Bar, um angemessene Atemfluss während des Verfahrens zu gewährleisten positioniert werden.</li>
		<li>Sobald die Maus über den Zahn Bar befindet, ziehen Sie das Ohr Bars fest unter der Maus Ohren um den Kopf zu immobilisieren. Hinweis: Seien Sie vorsichtig, nicht das Trommelfell beschädigen oder die Atmung beeinträchtigen.</li>
		<li>Machen Sie einen 1-2 cm Mittellinie sagittaler Hautschnitt mit einer sterilen Schere entlang der obere Teil des Schädels von Anterior Posterior des Schädels aussetzen.</li>
		<li>Identifizieren Sie den Schnittpunkt der sagittale und koronale Nähte (Bregma) als Wahrzeichen für die Stereotaktische Lokalisierung vor der Injektion (siehe Abbildung 1) zu dienen.</li>
		<li>Legen Sie die Microsyringe über diesen Punkt.</li>
		<li>Verschieben Sie die Microsyringe 2 mm rechts seitlichen und vorderen von der Bregma 0,5 mm.</li>
		<li>Mit einem Microdrill, machen Sie ein kleines Loch in den Schädel mit einem sterilen Bohrer an den vorgegebenen Koordinaten. Achten Sie darauf, um traumatische Verletzungen des Gehirns zu vermeiden oberflächlich bleiben. Hinweis: In diesem Protokoll wurden Immunzellen innerhalb einer etablierten Tumor (eine Woche nach Tumor Zelle Injektion) injiziert. Die Haut soll wiedereröffnet (Narbe) und die Injektion erfolgt an den gleichen Koordinaten verwendet für die Tumor-Zellen-Implantation (das Loch ist in der Regel bis zu 2 Wochen nach der Injektion noch vorhanden). Koordinaten wurden ausgewählt, für die Injektion Tumor und Effektor Zellen in das Gehirn Parenchym13,14.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Injektion von immun Effektorzellen
	<ol>
<li>Sorgfältig legen Sie die Microsyringe in das gebohrte Loch und bewegte sich langsam, die Nadel 3 mm nach unten in die Dura und dann rückwärts 0,5 mm bis zu einer endgültigen Tiefe von 2,5 mm vor der Injektion der Effektorzellen zu übermitteln.</li>
		<li>Führen Sie die Effektor-Zelle-Injektion bei 2-3 µL/min und überwachen Sie die Mäuse entlang der Einspritzzeit.</li>
		<li>Nach die Injektion abgeschlossen ist, ziehen Sie die Nadel heraus für nur 1 mm und bewahren Sie die Microsyringe für eine weitere Minute, bevor langsam zurückziehen vollständig Microsyringe, um eine Leckage aus der Infusionsstelle zu verhindern. Hinweis: Nach dem Entfernen des Tieres aus dem stereotaktischen Gerät, sofort reinigen Sie die einspritzausrüstung für zukünftige Experimente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Nachbetreuung und Follow-up von Maus
	<ol>
<li>Entfernen Sie das Tier aus der Stereotaktische Rahmen und sofort übernehmen Sie Povidon-Jod 5 % Lösung auf die Schnitt-Website und schließen Sie die Haut mit einer geeigneten chirurgischen Naht.</li>
		<li>2 % Lidocain Gel direkt auf die Wunde auftragen und 0,15 µg/g von Buprenorphin durch eine subkutane Injektion für Post-prozedurale Analgesie zu verwalten.</li>
		<li>Platz zurück gesetzt die narkotisierten Maus zu seinem Käfig oben ein Heizkissen auf 37 ° C, eine geeignete Maus Körpertemperatur aufrechtzuerhalten und eine Unterkühlung zu vermeiden. Hinweis: Separates Gehäuse ist nicht erforderlich.</li>
		<li>Überwachen Sie die Maus, bis es vollständig aus der Narkose erholt ist und in einem Gehäuse Raum übertragen. Hinweis: Bisher ist dieses Protokoll gut unterstützt, wie einige unvorhersehbare Komplikationen (< 5 % der injizierten Mäusen) aufgetreten sind.</li>
		<li>Täglich überwachen Sie die Mäuse zu und einschläfern sie, wenn Anzeichen für abnehmende Gesundheit eingehalten werden (z.B., Buckliger Haltung, eingeschränkter Mobilität, Erschöpfung oder bedeutenden Gewichtsabnahme [≥ 15 %]).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Eine adoptive Übertragung von ausgewählten einheimischen oder veränderter immun Effektorzellen stellt einen vielversprechenden Ansatz zur Behandlung von Tumoren, wie z. B. infiltrative Gehirntumoren, kümmert sich der Begrenzung der Reaktivität gegen nicht-transformierten Zellen15effizient, 16,17,18. Das zentrale Nervensystem, das Gehirn umfasst, hat jedoch eine besondere Immunstatus, insb...

Glioblastom (WHO Grad IV Astrozytom), ist die häufigste und aggressive primäre Hirntumoren bei Erwachsenen. Trotz der aggressiven Behandlungen, die Operation und Radio-Chemotherapie zu kombinieren, bleibt GBM eine extrem schlechte Prognose (mediane Überlebenszeit von 14,6 Monate und eine 2-Jahres-Mortalität > 73 %)1zugeordnet. Dies beweist, dass einige effiziente therapeutische Fortschritte in den letzten zehn Jahren2validiert worden sind. Unter den Kandidaten für die Gestaltung effektiver Therapiestrategien3,4,5werden Immuntherapien6 derzeit untersucht, um zu verfolgen und zu beseitigen sehr invasiv und Radio/Chemotherapie-resistenten tumor Zellen, für ihren wichtigen Beitrag zur schnellen und tödlichen Tumor Rezidiv7vermutet. Verschiedene mögliche immunologische Ziele wurden identifiziert und vorgeschlagenen für Immuntherapien, mit natürlichen oder modifizierten αβ oder ϒδ T-Lymphozyten wie GBM-spezifischen Tumorantigenen oder Stress-induzierte Moleküle8,9, 10. Die Möglichkeit, ausgewählte GBM-reaktive Immunzelle Effektoren verwalten stellt eine einzigartige Gelegenheit, erhöhte Mengen von Effektor Lymphozyten direkt in die Website der verbleibenden Bösartigkeit zu liefern. Um diese Strategie zu unterstützen, haben wir vor kurzem gezeigt, dass Modelle basierend auf immungeschwächte Mäuse orthotopen primären menschlichen GBM Xenotransplantate treu tragen die Entwicklung von Hirntumoren in GBM Patienten9,11rekapitulieren. Darüber hinaus wurden diese Modelle verwendet, um die starke Antitumor-Effizienz der adoptively übertragenen allogene menschlichen Vϒ9Vδ2T Lymphozyten zeigen.
Dieses Protokoll beschreibt die kritische experimentellen Schritte zur Erreichung Stereotaktische Immuntherapien von Hirntumoren, wie GBM, basierend auf die Adoptiveltern Übertragung der allogenen T-Lymphozyten. Der Artikel zeigt: (i) die Verstärkung der therapeutischen allogene immun Effektor T-Lymphozyten, wie menschliche Vϒ9Vδ2T Lymphozyten; (Ii) die Vorbereitung dieser Effektor T-Lymphozyten zur Injektion; (Iii) das Verfahren für die Stereotaktische Verwaltung innerhalb des Gehirns, in der Nähe des Tumors. Dieser Artikel enthält auch einen Einblick in das Verhalten von diese zellulären Effektoren nach Stereotaktische Injektion.
Der hier vorgestellte Therapieansatz basiert auf die Injektion von 20 x 106 Effektor Zellen pro Dosis für jedes Gehirn Tumor-tragenden immungeschwächte Maus. Ein erste in-vitro- Erweiterung Schritt ist erforderlich, große Mengen von Immunzellen produzieren. Daher unspezifische Zelle Erweiterungen werden mit Phytohemagglutinin (PHA-L) durchgeführt und allogene Feeder-Zellen bestrahlt: Blut-peripheren mononukleären Zellen (PBMCs) von gesunden Spendern und Epstein-Barr-Virus EBV-transformierten B-Lymphoblastoid Zelle Linien (BLCLs), abgeleitet von PBMCs durch in-vitro- Infektion mit EBV-haltigen Kultur überstand von der Marmoset B95-8-Zell-Linie, im Beisein von 1 µg/mL Cyclosporin-A.
GBM-reaktive Effektor Immunzellen verglichen und von in-vitro- Assays9ausgewählt. Diese Effektorzellen werden aktiviert und verstärkt mit standard-Protokolle, nach ihrer Natur (z.B., menschliche Vγ9Vδ2 T-Lymphozyten-9 oder menschliche Anti-Herpes-Virus αβ T-Lymphozyten12) mit einer Mindestreinheit von > 80 %, wie routinemäßig von durchflusszytometrischen Analyse überprüft. Die Zelle Erweiterung Verfahren unten gilt für verschiedene menschliche Lymphozyten-Teilmengen.

<table><tbody><tr><td>PBMCs</td><td></td><td></td><td>from 3 different healthy donors</td></tr><tr><td>BLCLs</td><td></td><td></td><td>from 3 different donors</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI)</td><td>Gibco</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Dutscher</td><td>S1810-500</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>penicillin/streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>IL-2</td><td>Novartis</td><td>proleukin</td><td></td></tr><tr><td>PHA-L</td><td>Sigma</td><td>L4144</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaxic frame</td><td>Stoelting Co.</td><td>51600</td><td></td></tr><tr><td>Mouse adaptator for stereotaxic frame&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Stoelting Co.</td><td>51624</td><td></td></tr><tr><td>microsyringe pump injector&amp;nbsp;</td><td>WPI</td><td>UMP3-4</td><td></td></tr><tr><td>NanoFil Syringe</td><td>WPI</td><td>NF34BV-2</td><td></td></tr><tr><td>NSG mice</td><td>Charles River</td><td>NSGSSFE07S</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Merial</td><td>Imalg&amp;egrave;ne 1000</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Bayer</td><td>Rompur 2%</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>WPI</td><td>201758</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>WPI</td><td>501215</td><td></td></tr><tr><td>OmniDrill 115/230V</td><td>WPI</td><td>503598</td><td></td></tr><tr><td>Vicryl 4-0</td><td>Ethicon</td><td>VCP397H</td><td></td></tr><tr><td>Xylocaine</td><td>Astrazeneca</td><td>3634461</td><td></td></tr></tbody></table>

stereotactic adoptive transfer of cytotoxic immune cells in murine models of orthotopic human glioblastoma multiforme xenografts

Glioblastoma Multiforme (GBM), der häufigsten und aggressive primäre Hirntumoren bei Erwachsenen, ist in der Regel verbunden mit einer schlechten Prognose und knappen effiziente Therapien wurden in den letzten zehn Jahren vorgeschlagen. Unter den vielversprechenden Kandidaten für neue therapeutische Strategien zu entwerfen zelluläre Immuntherapien haben sehr invasive Beseitigung gezielt und Chemo-radioresistenten Tumorzellen, wahrscheinlich in eine schnelle und tödliche Rückfall dieses Krebses beteiligt. So Zwecke der allogenen GBM-reaktive Immunzelle Effektoren, wie menschliche Vϒ9Vδ2 T-Lymphozyten, in der Nähe des Tumors würde stellt eine einzigartige Gelegenheit, effizient zu liefern und hochkonzentrierten therapeutischer Wirkstoffe direkt in die Website des Gehirns Malignome. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Vorbereitung und der stereotaktischen Verwaltung der allogenen menschlichen Lymphozyten in immungeschwächte Mäuse tragen orthotopen menschlichen primären Hirntumoren. Diese Studie liefert eine präklinischen Proof-of-Concept für die Machbarkeit und die Antitumor-Wirksamkeit von diesen zellulären Immuntherapien, die Stereotaktische Injektion von allogenen menschlichen Lymphozyten innerhalb Intrabrain Tumor Betten abhängen.

Diese Studie beschreibt die Strategie der Adoptiveltern Übertragungen von zellulären immun Effektorzellen in das Gehirn von Tumor-tragenden Mäusen, basierend auf Stereotaktische Injektionen direkt in das tumorbett durchgeführt.
Um jedes Risiko von Hirn-Trauma, verbunden mit einem großen Injektionsvolumen zu minimieren, muss die Zellsuspension Effektor (20 x 106 Zellen in 15-20 µL PBS) konzentriert werden. Um zu ...

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Stereotactic Adoptive Transfer of Cytotoxic Immune Cells in Murine Models of Orthotopic Human Glioblastoma Multiforme Xenografts

Stereotaktische Adoptiv Übertragung von zytotoxischen Immunzellen in murinen Modellen der Orthotopen Human Glioblastoma Multiforme Xenotransplantate

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Vorbereitung und der stereotaktischen Verwaltung der allogenen menschlichen Lymphozyten in immungeschwächte Mäuse tragen orthotopen menschlichen primären Hirntumoren. Diese Studie liefert eine Machbarkeitsstudie für die Machbarkeit und die Antitumor-Wirksamkeit von zellulären Immuntherapien Intrabrain geliefert.

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce ...

stereotactic-adoptive-transfer-cytotoxic-immune-cells-murine-models

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.8K Aufrufe.  CRCINA. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Vorbereitung und der stereotaktischen Verwaltung der allogenen menschlichen Lymphozyten in immungeschwächte Mäuse tragen orthotopen menschlichen primären Hirntumoren. Diese Studie liefert eine Machbarkeitsstudie für die Machbarkeit und die Antitumor-Wirksamkeit von zellulären Immuntherapien Intrabrain geliefert.

Serie: Stereotactic Adoptive Transfer of Cytotoxic Immune Cells in Murine Models of Orthotopic Human Glioblastoma Multiforme Xenografts

A Simple Guide Screw Method for Intracranial Xenograft Studies in Mice

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma (glioma) and medulloblastoma. The widely used stereotactic approach only allows for the injection of a single animal at a time, is labor intensive and requires highly specialized equipment. The guide screw method, initially developed by Lal et al.,1 was developed to eliminate cumbersome stereotactic procedures. We now describe a modified guide screw approach that is rapid and exceptionally safe; both of which are critical ethical considerations. Notably, our procedure now incorporates an infusion pump that allows up to 10 animals to be simultaneously injected with tumor cells.
To demonstrate the utility of this procedure, we established human U87MG glioma cells as intracranial xenografts in mice, which were then treated with AMG102; a fully human antibody directed to HGF/scatter factor currently undergoing clinical evaluation2-5. Systemic injection of AMG102 significantly prolonged the survival of all mice with intracranial U87MG xenografts and resulted in a number of complete cures. 
This study demonstrates that the guide screw method is an inexpensive, highly reproducible approach for establishing intracranial xenografts. Furthermore, it provides a relevant physiological model for validating novel therapeutic strategies for the treatment of brain cancers.

In order to evaluate novel therapeutic paradigms for the treatment of glioma, physiological relevant models are essential. We utilize an implantable guide screw procedure for establishment of intracranial xenograft models that is more rapid and safer than stereotactic approaches.

Eine einfache Anleitung Screw Verfahren zur Intrakranielle Xenograft Studien an Mäusen

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma ...

Forschung

Medizin

Combination Radiotherapy in an Orthotopic Mouse Brain Tumor Model

Glioblastoma multiforme (GBM) are the most common and aggressive adult primary brain tumors1. In recent years there has been substantial progress in the understanding of the mechanics of tumor invasion, and direct intracerebral inoculation of tumor provides the opportunity of observing the invasive process in a physiologically appropriate environment2. As far as human brain tumors are concerned, the orthotopic models currently available are established either by stereotaxic injection of cell suspensions or implantation of a solid piece of tumor through a complicated craniotomy procedure3. In our technique we harvest cells from tissue culture to create a cell suspension used to implant directly into the brain. The duration of the surgery is approximately 30 minutes, and as the mouse needs to be in a constant surgical plane, an injectable anesthetic is used. The mouse is placed in a stereotaxic jig made by Stoetling (figure 1). After the surgical area is cleaned and prepared, an incision is made; and the bregma is located to determine the location of the craniotomy. The location of the craniotomy is 2 mm to the right and 1 mm rostral to the bregma. The depth is 3 mm from the surface of the skull, and cells are injected at a rate of 2 &mu;l every 2 minutes. The skin is sutured with 5-0 PDS, and the mouse is allowed to wake up on a heating pad. From our experience, depending on the cell line, treatment can take place from 7-10 days after surgery. Drug delivery is dependent on the drug composition. For radiation treatment the mice are anesthetized, and put into a custom made jig. Lead covers the mouse's body and exposes only the brain of the mouse. The study of tumorigenesis and the evaluation of new therapies for GBM require accurate and reproducible brain tumor animal models. Thus we use this orthotopic brain model to study the interaction of the microenvironment of the brain and the tumor, to test the effectiveness of different therapeutic agents with and without radiation.

The purpose of this article is to describe the use of an orthotopic glioblastoma model for chemoradiation studies. This article will go though cell processing, implanting, and radiotherapy of the mouse using an intracranial model.

Kombination Strahlentherapie in einem orthotopen Maus Brain Tumor-Modell

Glioblastoma multiforme (GBM) are the most common and aggressive adult primary brain tumors1. In recent years there has been substantial progress in the ...

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality treatment consisting of surgical resection, post-operative radiation therapy and temozolomide chemotherapy 1. New therapeutic approaches are clearly needed to improve patient survival and quality of life. The development of more effective treatment strategies would be aided by animal models of GBM that recapitulate human disease yet allow serial imaging to monitor tumor growth and treatment response. In this paper, we describe our technique for the precise stereotactic implantation of bio-imageable GBM cancer cells into the brains of nude mice resulting in tumor xenografts that recapitulate key clinical features of GBM 2. This method yields tumors that are reproducible and are located in precise anatomic locations while allowing in vivo bioluminescent imaging to serially monitor intracranial xenograft growth and response to treatments 3-5. This method is also well-tolerated by the animals with low perioperative morbidity and mortality.

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

We describe an integrated method for the precise, stereotactic implantation of human glioblastoma multiforme cells into the brains of nude mice and subsequent serial in vivo imaging to monitor growth and response to treatment of the resultant xenografts.

Stereotaktische Intrakranielle Implantation und<em&gt; In vivo</em&gt; Bioluminescent Imaging der Tumorxenotransplantaten in einem Maus-Modell-System des Glioblastoma multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality ...

Primary Orthotopic Glioma Xenografts Recapitulate Infiltrative Growth and Isocitrate Dehydrogenase I Mutation

Malignant gliomas constitute a heterogeneous group of highly infiltrative glial neoplasms with distinct clinical and molecular features. Primary orthotopic xenografts recapitulate the histopathological and molecular features of malignant glioma subtypes in preclinical animal models. To model WHO grades III and IV malignant gliomas in transplantation assays, human tumor cells are xenografted into an orthotopic site, the brain, of immunocompromised mice. In contrast to secondary xenografts that utilize cultured tumor cells, human glioma cells are dissociated from resected specimens and transplanted without prior passage in tissue culture to generate primary xenografts. The procedure in this report details tumor sample preparation, intracranial transplantation into immunocompromised mice, monitoring for tumor engraftment and tumor harvesting for subsequent passage into recipient animals or analysis. Tumor cell preparation requires 2 hr and surgical procedure requires 20 min/animal.

Malignant gliomas constitute a heterogeneous group of highly infiltrative glial neoplasms with distinct clinical and molecular features. Primary orthotopic xenografts recapitulate the histopathological and molecular features of malignant glioma subtypes in preclinical animal models.

Primäre orthotopische Glioma Xenografts rekapitulieren infiltratives Wachstum und Isocitrate Dehydrogenase I Mutation

Malignant gliomas constitute a heterogeneous group of highly infiltrative glial neoplasms with distinct clinical and molecular features. Primary ...

Generation of CAR T Cells for Adoptive Therapy in the Context of Glioblastoma Standard of Care

Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo to express chimeric antigen receptors specific for glioma antigens (CAR T cells). The expansion and function of adoptively transferred CAR T cells can be potentiated by the lymphodepletive and tumoricidal effects of standard of care chemotherapy and radiotherapy. We describe a method for generating CAR T cells targeting EGFRvIII, a glioma-specific antigen, and evaluating their efficacy when combined with a murine model of glioblastoma standard of care. T cells are engineered by transduction with a retroviral vector containing the anti-EGFRvIII CAR gene. Tumor-bearing animals are subjected to host conditioning by a course of temozolomide and whole brain irradiation at dose regimens designed to model clinical standard of care. CAR T cells are then delivered intravenously to primed hosts. This method can be used to evaluate the antitumor efficacy of CAR T cells in the context of standard of care.

The lymphodepletive and immunomodulatory effects of chemotherapy and radiation standard of care can be leveraged to enhance the antitumor efficacy of T cell immunotherapy. We outline a method for generating EGFRvIII-specific chimeric antigen receptor (CAR) T cells and administering them in the context of glioblastoma standard of care.

Generierung von CAR T-Zellen für die adoptive Therapie im Kontext von Glioblastoma Standardtherapie

Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo ...

Immunologie und Infektion

Translational Orthotopic Models of Glioblastoma Multiforme

Genetically engineered mouse (GEM) models for human glioblastoma multiforme (GBM) are critical to understanding the development and progression of brain tumors. Unlike xenograft tumors, in GEMs, tumors arise in the native microenvironment in an immunocompetent mouse. However, the use of GBM GEMs in preclinical treatment studies is challenging due to long tumor latencies, heterogeneity in neoplasm frequency, and the timing of advanced grade tumor development. Mice induced via intracranial orthotopic injection are more tractable for preclinical studies, and retain features of the GEM tumors. We generated an orthotopic brain tumor model derived from a GEM model with Rb, Kras, and p53 aberrations (TRP), which develops GBM tumors&#160;displaying linear foci of necrosis by neoplastic cells, and dense vascularization analogous to human GBM. Cells derived from GEM GBM tumors are injected intracranially into wild-type, strain-matched recipient mice and reproduce grade IV tumors, therefore bypassing the long tumor latency period in GEM mice and allowing for the creation of large and reproducible cohorts for preclinical studies. The highly proliferative, invasive, and vascular features of the TRP GEM model for GBM are recapitulated in the orthotopic tumors, and histopathology markers reflect human GBM subgroups. Tumor growth is monitored by serial MRI scans. Due to the invasive nature of the intracranial tumors in immunocompetent models, carefully following the injection procedure outlined here is essential to prevent extracranial tumor growth.

Here, we describe a preclinical orthotopic mouse model for GBM, established by intracranial injection of cells derived from genetically engineered mouse model tumors. This model displays the disease hallmarks of human GBM. For translational studies, the mouse brain tumor is tracked by in vivo MRI and histopathology.

Translationale orthotope Modelle des Glioblastoma multiforme

Genetically engineered mouse (GEM) models for human glioblastoma multiforme (GBM) are critical to understanding the development and progression of brain ...

Krebsforschung

Creating Anatomically Accurate and Reproducible Intracranial Xenografts of Human Brain Tumors

Orthotopic tumor models are currently the best way to study the characteristics of a tumor type, with and without intervention, in the context of a live animal &#8211;&#160;particularly in sites with unique physiological and architectural qualities such as the brain. In vitro and ectopic models cannot account for features such as vasculature, blood brain barrier, metabolism, drug delivery and toxicity, and a host of other relevant factors. Orthotopic models have their limitations too, but with proper technique tumor cells of interest can be accurately engrafted into tissue that most closely mimics conditions in the human brain. By employing methods that deliver precisely measured volumes to accurately defined locations at a consistent rate and pressure, mouse models of human brain tumors with predictable growth rates can be reproducibly created and are suitable for reliable analysis of various interventions. The protocol described here focuses on the technical details of designing and preparing for an intracranial injection, performing the surgery, and ensuring successful and reproducible tumor growth and provides starting points for a variety of conditions that can be customized for a range of different brain tumor models.

The brain is a unique site with qualities that are not well represented by in vitro or ectopic analyses. Orthotopic mouse models with reproducible location and growth characteristics can be reliably created with intracranial injections using a stereotaxic fixation instrument and a low pressure syringe pump.

Erstellen Anatomisch genaue und reproduzierbare intrakranielle Xenografts der Menschen Hirntumoren

Orthotopic tumor models are currently the best way to study the characteristics of a tumor type, with and without intervention, in the context of a live ...

An Immunocompetent Murine Model for Laser Interstitial Thermal Therapy of Glioblastoma

Glioblastoma (GB), the most aggressive form of primary brain cancer, accounts for approximately half of all high-grade primary brain tumors in adults and has no cure. Laser interstitial thermal therapy (LITT) is a Food and Drug Administration (FDA)-approved treatment for GB and is used in patients who may not be candidates for conventional surgical resection. While the clinical efficacy of LITT has been established, research beyond clinical case studies and case series is limited and hindered by the lack of an established animal model. This protocol uses C57BL/6 mice and syngeneic CT2A glioma cancer cell line to closely recapitulate human GB&#160;while also using a 1064 nm Neodymium-doped Yttrium Aluminum Garnet (Nd:YAG) laser, such as is used in one of the two FDA-approved LITT systems, providing excellent pre-clinical relevance. The successful establishment of this LITT murine model will provide a valuable platform for investigating the unique features of LITT ablation and its effects on the tumor microenvironment, potentially leading to improved therapeutic strategies.

Glioblastoma is a devastating form of primary brain cancer, and laser interstitial thermal therapy is emerging as a promising alternative to conventional surgical resection for inoperable glioblastoma. This protocol describes an optimized pre-clinical mouse model that can be used to study treatment effects or adjuvant and combinatorial treatments.

Ein immunkompetentes Mausmodell für die interstitielle Laser-Wärmetherapie des Glioblastoms

Glioblastoma (GB), the most aggressive form of primary brain cancer, accounts for approximately half of all high-grade primary brain tumors in adults and ...

Establishment of Orthotopic Patient-derived Xenograft Models for Brain Tumors using a Stereotaxic Device

The development of clinically relevant and reliable models for central nervous system (CNS) tumors has been pivotal in advancing the field of neuro-oncology. One of the most widely used techniques is the orthotopic intracranial injection, a method that allows investigating of tumor growth, invasion, and dissemination within a controlled setting. This technique involves transplanting tumor cells from a specific patient region into the corresponding anatomical site in an animal. By doing so, these orthotopic brain tumor models offer a unique advantage, as they more accurately replicate cancer's biological behavior and its interactions with the brain environment seen in human patients. This makes them especially valuable for preclinical therapeutic testing, where a close resemblance to the clinical scenario is essential for evaluating potential treatments. This protocol shares experiences in developing patient-derived xenograft (PDX) models for pediatric brain tumors, including diffuse midline glioma (DMG), glioblastoma (GBM), medulloblastoma, and ependymoma. This method delineates the procedure for conducting intracranial stereotaxic injections in mice, ensuring the correct targeting of the injection site within the brain. Additionally, we describe the post-procedural monitoring system employed to detect signs of successful tumor engraftment. Following tumor injection, a rigorous monitoring system is implemented to observe the animals for any signs of neurological impairment, behavioral changes, and/or weight loss, which are common indicators of tumor progression. This system allows for timely intervention and provides critical data regarding the tumor's growth dynamics. By refining these models and protocols, we aim to enhance the reliability and translational potential of preclinical studies, contributing to the development of more effective treatments for pediatric CNS tumors.

The development of orthotopic pediatric brain tumor models requires meticulous precision, using a stereotaxic device to implant cancer cells precisely. The methodology presented here outlines the steps involved in preparing brain tumor cells, performing intracranial injections, and implementing a post-operative monitoring system to assess brain tumor engraftment.

Etablierung von orthotopen patientenabgeleiteten Xenotransplantatmodellen für Hirntumoren mit Hilfe eines stereotaktischen Geräts

The development of clinically relevant and reliable models for central nervous system (CNS) tumors has been pivotal in advancing the field of ...

Image-Guided Resection of Glioblastoma and Intracranial Implantation of Therapeutic Stem Cell-seeded Scaffolds

Glioblastoma (GBM), the most common and aggressive primary brain cancer, carries a life expectancy of 12-15 months. The short life expectancy is due in part to the inability of the current treatment, consisting of surgical resection followed by radiation and chemotherapy, to eliminate invasive tumor foci. Treatment of these foci may be improved with tumoricidal human mesenchymal stem cells (MSCs). MSCs exhibit potent tumor tropism and can be engineered to express therapeutic proteins that kill tumor cells. Advancements in preclinical models indicate that surgical resection induces premature MSC loss and reduces therapeutic efficacy. Efficacy of MSC treatment can be improved by seeding MSCs on a biodegradable poly(lactic acid) (PLA) scaffold. MSC delivery into the surgical resection cavity on a PLA scaffold restores cell retention, persistence, and tumor killing. To study the effects of MSC-seeded PLA implantation on GBM, an accurate preclinical model is needed. Here we provide a preclinical surgical protocol for image-guided tumor resection of GBM in immune-deficient mice followed by MSC-seeded scaffold implantation. MSCs are engineered with lentiviral constructs to constitutively express and secrete therapeutic TNF&#945;-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) as well as green fluorescent protein (GFP) to allow fluorescent tracking. Similarly, the U87 tumor cells are engineered to express mCherry and firefly luciferase, providing dual fluorescent/luminescent tracking. While currently used for investigating stem cell mediated delivery of therapeutics, this protocol could be modified to investigate the impact of surgical resection on other GBM interventions.

Tumor-seeking therapeutic mesenchymal stem cells (MSCs) show promise as a treatment for invasive glioblastoma. Optimal transplantation involves delivery of MSCs into the tumor resection cavity on scaffolds. Here, preclinical techniques to study MSC treatment of glioblastoma are provided including: image-guided tumor resection; implantation of MSC-seeded scaffolds; and postoperative therapy tracking.

Bildgestützte Resektion der Glioblastom und intrakraniellen Implantation von therapeutischen Stammzellen entkernt Gerüste

Glioblastoma (GBM), the most common and aggressive primary brain cancer, carries a life expectancy of 12-15 months. The short life expectancy is due in ...