Mit diesem Protokoll können auf einfache Weise Zebrafisch-Sphäroide erzeugt werden, ein 3D-In-vitro-Modell mit unterschiedlichen Anwendungsmöglichkeiten bei der Prüfung der Fischtoxizität. Dies ist eine einfache und schnelle Methode, um einzelne Sphäroide von Zebrafisch-Zelllinien zu erzeugen, die in Größe und Form sehr ähnlich sind. Wenn Sie alle beschriebenen Schritte korrekt ausführen, sollte man keine Probleme haben.
Zebrafisch-Sphäroide können dem Mechanismus der Erforschung der Auswirkungen von Chemikalien auf Fische sehr zugute kommen, was dazu beiträgt, die Bewertung der Umweltsicherheit von Produkten wie Kosmetika zu verbessern. Das Verfahren wird von Irisdoris Rodrigues de Souza, einer Ärztin für Genetik aus meinem Labor, demonstriert. Nehmen Sie zunächst einen T75-Kolben mit Zebrafischzellen bei etwa 80 % Konfluenz.
Entfernen Sie das gesamte Medium und waschen Sie die Zellen, indem Sie 0,01 molare PBS mit einer Pipette in den Kulturkolben geben. Waschen Sie den Kulturkolben mit PBS, indem Sie den Kolben vorsichtig schütteln, und entfernen Sie dann den PBS. Drei Milliliter Trypsin 0,5 millimolar EDTA in den Kulturkolben geben und drei Minuten bei 28 Grad Celsius inkubieren.
Um die Zellen aus dem Kolben zu lösen, klopfen Sie vorsichtig auf den Kolben, um die Zellen freizugeben. Und dann stoppen Sie die Trypsinverdauung, indem Sie drei Milliliter komplettes Nährmedium in den Kolben geben. Übertragen Sie die Zellsuspension mit einer Pipette in ein konisches Zentrifugenröhrchen mit einem Fassungsvermögen von 15 Millilitern und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 100 G.
Entfernen Sie dann vorsichtig den Überstand. Geben Sie einen Milliliter des kompletten Mediums für die jeweils verwendete Zelllinie hinzu und resuspendieren Sie das Pellet mit einer Mikropipette. Geben Sie 10 Mikroliter der Zellsuspension und 10 Mikroliter Trypanblau-Farbstoff in ein Mikroröhrchen, um die Zellen zu zählen und ihre Lebensfähigkeit zu bewerten.
Mischen Sie die Zellsuspension und den Farbstoff mit einer Pipette und geben Sie 10 Mikroliter dieser Mischung in eine Neubauer-Kammer. Zählen Sie die Zellen in den vier großen Quadraten oder Quadranten, die an den Ecken der Kammer platziert sind, und betrachten Sie Zellen, die kein Trypanblau aufnehmen, als lebensfähig. Berechnen Sie dann die Anzahl der lebensfähigen Zellen anhand der auf dem Bildschirm angezeigten Gleichung.
Multiplizieren Sie diese Zellzahl mit zwei, um die endgültige Zellnummer in der Zellsuspension zu berechnen. Nachdem Sie die Zellzahl berechnet haben, stellen Sie die Zellsuspension so ein, dass sie 200 Mikroliter dieser Suspension pro Well einer 96-Well-ULA-Platte mit rundem Boden mit der für jede Zelllinie erforderlichen Anzahl von Zellen enthält. Bereiten Sie die Suspension mit der eingestellten Konzentration der Zellen in einem mittleren Reservoir vor und mischen Sie sie mit einem Mehrkanal-Mikropipet, ohne Schaum oder Blasen zu bilden.
Geben Sie 200 Mikroliter der eingestellten Zellsuspension in jede Vertiefung der ULA-Platte mit rundem Boden. mit einer Mehrkanalpipette. Die Platte muss mit Parafilm oder selbstklebender Siegelfolie versiegelt werden, um eine Verdunstung des Nährmediums von der 96-Well-Platte zu vermeiden.
Inkubieren Sie die Platte auf einem Orbitalschüttler bei 70 U/min für fünf Tage in einem 28 Grad Celsius heißen Inkubator ohne Kohlendioxid. Beobachten Sie die Sphäroide nach fünf Tagen unter einem Inverslichtmikroskop, um die erzeugten Sphäroide zu beurteilen. Um ihre Form und Größe zu messen, erhalten Sie Bilder der Sphäroide und verwenden Sie Software, um die Bilder zu verarbeiten und zu analysieren.
Nachdem Sie die Software so eingestellt haben, dass ein ausgewählter Bereich basierend auf einer bekannten Skala gemessen wird, wählen Sie die Außenseite des Sphäroids aus, um seine Fläche und Kreisförmigkeit zu bestimmen. Die Fläche des Sphäroids wird verwendet, um seine Größe zu bestimmen, indem der Durchmesser d berechnet wird, und die Software liefert die Zirkularität des Sphäroids durch eine Formel, die die ausgewählte Fläche und den ausgewählten Umfang verwendet. Am ersten Tag des Orbitaschüttelns bildet sich ein ZFL-Zellaggregat.
Das Zellaggregat erhöht seine Zirkularität am dritten Tag und erreicht am fünften Tag eine adäquate Kugelform. Ein 16 Tage altes ZFL-Sphäroid in ULA-Platte ist hier zu sehen. Die ZEM2S-Zelllinie bildet ab dem ersten Tag des orbitalen Schüttelns Sphäroide.
Das Sphäroid behält seine Form bei und nimmt am dritten Tag an Größe zu, und seine maximale Kreisförmigkeit wird am fünften Tag erreicht. Hier ist ein 10 Tage altes ZEM2S-Sphäroid in einer ULA-Platte zu sehen. Die gemessene Größe der Sphäroide der ZFL- und ZEM2S-Zelllinien und der gemessene Zirkularitätsindex der ZFL- und ZEM2S-Sphäroide sind in dieser Abbildung dargestellt.
Dieses grafische Bild stellt das Wachstumsmuster von ZFL- und ZEM2S-Sphäroiden dar. Ein ZFL-Sphäroid und ein ZEM2S-Sphäroid, die sich nach fünftägigem Orbitalschütteln bei 100 U/min gebildet haben, sind hier dargestellt. Das Wachstumsmuster und der Zirkularitätsindex der Sphäroide, die bei Drehzahlen von 70 und 100 U/min gebildet werden, sind in dieser Abbildung dargestellt.
70 U/min ist die am besten geeignete Drehzahl, um mit dieser Methode ZFL- und ZEM2S-Sphäroide zu formen. Die Färbung von Zellmembranen mit Lektin Alexa Fluor 594 und Zellkernen mit DAPI zeigt die zelluläre Integrität im Kern der Sphäroide. Die Fluoreszenz von Resorufin, die durch eine Reduktion von AlamarBlue gebildet wird, zeigt lebensfähige Zellen im Kern beider Sphäroide.
Der MTT-Viabilitätstest in 3D-Kultur und 2D-Kultur der ZEM2S- und ZFL-Zelllinie ist hier dargestellt und zeigt keine signifikanten Unterschiede. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, stellen Sie sicher, dass Sie die Platten versiegeln, um eine Änderung des pH-Werts der Nährmedien und eine Verdunstung in den Vertiefungen zu vermeiden. Die Sphäroide können in einer Vielzahl von In-vitro-Assays eingesetzt werden, um toxische Wirkungen in der Fischleber oder Entwicklungsstudien mit der embryonalen ZEM2S-Zelllinie zu bewerten.
Dieses Protokoll kann dazu beitragen, die Entwicklung von In-vitro-Fischtests voranzutreiben und so zum Fortschritt von tierversuchsfreien Ökotoxizitätsstudien beizutragen.
