Diese Technik kann helfen, Schlüsselfragen zur Ein-Nephron-Physiologie zu beantworten, einschließlich der glomerulären Filtrationsraten von systemischen Proteinen und Metaboliten und ihrer Beiträge zur röhrenförmigen Physiologie. Der Hauptvorteil dieser Mikropunktionstechnik ist, dass sie den Zugang zu Bowmans Raum und dem kortikalen Nephron bei allen Mäusen ermöglicht. Im Allgemeinen würden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, weil sie korrekt ausgeführte Vorbereitungsschritte erfordert.
Nach der Bestätigung eines Mangels an Reaktion auf Zehenkneifung, tragen Sie Salbe auf die Augen und verwenden Sie Klebeband, um die Extremitäten einer 20 bis 25 Gramm erwachsenen Maus zu immobilisieren. Verwenden Sie eine Enthaarungscreme, um alle Haare auf der linken Seite des Tieres zu entfernen, und verwenden Sie die Milz, um die linke Niere durch die Haut auf der dorsalen und kaudalen Seite der Milz zu lokalisieren. Machen Sie einen 0,5-Zentimeter-Schnitt in der Haut, gefolgt von einem kleineren Schnitt im Peritoneum gerade groß genug, um die Niere durchgedrückt werden.
Extrudieren Sie die Niere mit sanftem Druck und legen Sie eine Polysiloxan Nierenstabilisator Form um das Gewebe. Die Niere mit dem Abstandsraum so ausrichten, dass sich die spätere Oberfläche der Niere um etwa einen Millimeter über den Stabilisator hinaus erstreckt, und die Niere mit Cyanoacrylatkleber an der Form fixieren. Kleben Sie eine Kopfplatte an die Stabilisatorform und montieren Sie die Kopfplatte an Befestigungsstangen auf der Grundplatte.
Als nächstes füllen Sie den Brunnen in der Polysiloxan-Stütze mit einer Prozent-Agarose-Lösung und halten Sie einen 10-Millimeter-Abdeckungsschlupf auf der Oberseite der Form, bis die Agarose fest ist. Versiegeln Sie den Deckelschlupf mit Kleber an der Kopfplatte und erstellen Sie einen Ring um den Deckelschlupf mit Zahnzement. Dann 100 bis 150 Mikroliter FITC-Dextran retro-orbital injizieren und maus- und fixierensier Platte schnell auf die Zwei-Photonen-Mikroskopstufe bewegen.
Nachdem Sie sich manuell auf die Nierenoberfläche konzentriert haben, wechseln Sie in den nicht scannenden Zwei-Photon-Modus und erkunden Sie das Bildgebungsfenster, um einen Zielglomerulus zu finden, der größer als 30 Mikrometer unter dem Decksrutsch und weniger als 400 Mikrometer von der seitlichen Nierenkapsel entfernt ist. Zeichnen Sie den seitlichen und vertikalen Abstand zum Ziel glomerulus auf. Zeichnen Sie dann die x-, y- und z-Stufenkoordinaten für den Glomerulus auf.
Und schließlich, erhöhen Sie den objektiven Brennpunkt etwa einen Millimeter in die Wassersäule, ohne die x- und y-Stufenkoordinaten zu ändern. Fahren Sie die Pipettenspitze in die Wassersäule und schalten Sie die DAPI-Erregung ein. Bewegen Sie die Pipette in den X- und y-Dimensionen bis zur maximalen Fluoreszenz der Spitze.
Dies wird das Zentrum des Ziels sein. Ändern Sie die x-Zitationseinstellung in rotes fluoreszierendes Protein und visualisieren Sie die Pipette mit dem Okular, um eine präzise Zentrierung in der Augenansicht zu ermöglichen. Wechseln Sie zurück zu Zwei-Photon, um die Pipette unter der Live-Zwei-Photon-Ansicht zu finden und legen Sie die Spitze genau in der Mitte des Bildes, dies ist die Registrierungsposition.
Speichern Sie dann ein Bild der Pipette und registrieren Sie die Bühne und die Koordinaten des Mikropipette-Controllers. Entfernen Sie die Pipette aus der Wassersäule in der x-Achse, ohne die y- und z-Achse zu bewegen, und bewegen Sie die Pipette z zur Ziel-Glomerulus-Z-Koordinate und zum Rand der Niere. Beachten Sie die Stufe x und berechnen Sie die Nierenkantenpipette x mit dem Offset von der Registrierungsstufe x.
Erhöhen Sie die Stufe x, um die Bühne in Richtung der Pipette zu bewegen, bis der Rand der Niere weit links vom Bildschirm ist, während sie sichtbar bleibt. Schnell die Pipette auf etwa 100 Mikrometer von der Nierenrand pipette X hat gerade berechnet. Erhöhen Sie die rote Verstärkung und beginnen Sie, die Pipettespitze langsam an die Nierenkante unter Live-Zwei-Photon-Bildgebung vorzurücken, während Sie das rote Pixelhistogramm überwachen.
Fahren Sie die Pipette in der x-Achse langsam zur glomerulus Zielpipette x und behalten Sie die Stufe x im Auge. Dokumentieren Sie beim Erreichen des Glomerulus die Position mit einem Z-Stack. Wenn die Pipette in Position ist, stellen Sie die Mikropumpe so ein, dass sie 100 Nanoliter Perfluorodecalin über zwei Minuten injiziert.
Um die Durchgängigkeit der Pipette zu gewährleisten und die Verwechsler durch Pipettenverstopfung beim Eintritt zu reduzieren. Nach vier bis sechs Minuten Filtration die Mikropumpe so einstellen, dass sie bis zu 300 Nanoliter mit einer Rate von bis zu 50 Nanolitern pro Minute ansaugt. Dieser schöne, oberflächennahe Glomerulus zeigt eine günstige Bildgebung aufgrund der Oberflächenposition des Glomerulus bei 20 Mikrometern unter der Nierenkapsel.
Der Glomerulus ist jedoch zu nah an der Oberfläche für Mikroinjektion, da die Pipette den Deckelschlupf treffen würde. Diese Glomeruli sind mit den Seitlichen 250 Mikrometern nach rechts optimal positioniert und wirken aufgrund der Durchbrechung durch ihre 70 Mikrometer Tiefe aus der Kapsel weniger scharf. Beide Faktoren, die die Glomeruli zugänglich machen.
In diesem typischen Nieren-Einstiegsbild zeigt eine mittlere Intensitätsprojektion aus einem Z-Stack mit orthogonalen Ansichten die Pipettenspitze im Raum von Bowman, beachten Sie das spektrale Artefakt der roten Pipettespitze aus der extrem hellen Fluoreszenz der Quantenpunkte, die auf dem konischen Abschnitt der Spitze angeordnet sind. Hier zeigt ein Volumen-Rendering aus einem Z-Stack, der nach dem Positionieren einer Pipette im Raum von Bowman erworben wurde, die Pipettenspitze im Raum, die an den Kapillarbüschel anklebt. Wenn eine Pipette mit einer zu großen Öffnung verwendet wird, kann die Nierenkapsel brechen und subkapsuläre Blutungen und das Eindringen des Blutes in das Pipettenlumen verursachen.
Mit dieser Methode wurden 17 Proteine, hauptsächlich von niedrigem Molekulargewicht, aus mindestens zwei einzigartigen Peptiden pro Protein identifiziert. In Verbindung mit dieser Methode können andere Methoden wie Maspectroskopie, Ionenempfindliche Elektrodenmessungen und fluoreszierende Antikörperinjektionen verwendet werden, um Fragen über die Rolle von Leuchtleuchten in der röhrenförmigen und glomerulären Physiologie zu beantworten.
