Questa tecnica può aiutare a rispondere a domande chiave sulla fisiologia del singolo nefrone, inclusi i tassi di filtrazione glomerulare delle proteine sistemiche e dei metaboliti e i loro contributi alla fisiologia tubolare. Il vantaggio principale di questa tecnica di micropuntura è che consente l'accesso allo spazio di Bowman e al nefrone corticale in tutti i topi. In genere, gli individui nuovi a questo metodo farebbero fatica perché richiede passaggi di preparazione eseguiti correttamente.
Dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del dito, applicare un unguento agli occhi e utilizzare il nastro adesivo per immobilizzare le estremità di un topo adulto da 20 a 25 grammi. Utilizzare una crema depilatoria per rimuovere tutti i capelli sul lato sinistro dell'animale e utilizzare la milza per localizzare il rene sinistro attraverso la pelle sul lato dorsale e caudale della milza. Fai un'incisione di 0,5 centimetri nella pelle, seguita da una piccola incisione nel peritoneo abbastanza grande da far passare il rene.
Estrudere il rene con una leggera pressione e posizionare una forma stabilizzatore renale in polisiloxano attorno al tessuto. Allineare il rene con il distanziale in modo che la superficie più laterale del rene si estenda oltre lo stabilizzatore di circa un millimetro e fissare il rene alla forma con adesivo cianoacrilato. Incollare una piastra di testa alla forma stabilizzatore e montare la piastra della testa alle barre di montaggio sulla piastra di base.
Quindi, riempire il pozzo nel supporto in polisiloxano con una soluzione di agarosio dell'uno per cento e tenere un coperchio di 10 millimetri scivolare sopra la forma fino a quando l'agarosio è sodo. Sigillare il coperchio scivolare sulla piastra della testa con colla e creare un anello intorno al coperchio scivolare con cemento dentale. Quindi iniettare da 100 a 150 microlitri di FITC-Dextran retrò-orbitalmente e spostare rapidamente il mouse e la piastra di fissaggio allo stadio del microscopio a due fotoni.
Dopo aver focalizzato manualmente sulla superficie renale, passare alla modalità a due fotoni senza scansione ed esplorare la finestra di imaging per individuare un glomerulus bersaglio superiore a 30 micrometri sotto lo slittamento di copertura e a meno di 400 micrometri dalla capsula renale laterale. Registrare la distanza laterale e verticale dal glomerulus bersaglio. Quindi registrare le coordinate dello stadio x, y e z per il glomerulus.
E infine, sollevare il punto focale obiettivo di circa un millimetro nella colonna d'acqua senza modificare le coordinate dello stadio x e y. Guidare la punta della pipetta nella colonna d'acqua e attivare l'eccitazione DAPI. Spostate la pipetta nelle quote x e y fino al punto di fluorescenza massima della punta.
Questo sarà il centro dell'obiettivo. Modificate l'impostazione della citazione x in proteine fluorescenti rosse e visualizzate la pipetta con l'oculare per consentire una centratura precisa nella vista oculare. Torna a due fotoni per trovare la pipetta sotto la vista live a due fotoni e posizionare la punta esattamente al centro dell'immagine, questa è la posizione di registrazione.
Quindi salvare un'immagine della pipetta e registrare lo stage e le coordinate del controller della micropipetta. Rimuovere la pipetta dalla colonna d'acqua nell'asse x senza spostare l'asse y e z e spostare la pipetta z nella coordinata z glomerulus bersaglio e nel bordo del rene. Si noti lo stadio x e si calcola la pipetta del bordo renale x utilizzando l'offset dalla fase di registrazione x.
Aumentare lo stadio x per spostare lo stadio verso la pipetta fino a quando il bordo del rene è lontano a sinistra dello schermo, pur rimanendo visibile. Avanzare rapidamente la pipetta a circa 100 micrometri di distanza dalla pipetta X del bordo renale ha appena calcolato. Aumentare il guadagno rosso e iniziare ad avanzare lentamente la punta della pipetta verso il bordo renale sotto l'imaging a due fotoni vivo mentre si monitora l'istogramma dei pixel rossi.
Guidare lentamente la pipetta nell'asse x fino alla pipetta bersaglio glomerulus x, tenendo d'occhio lo stadio x. Una volta raggiunto il glomerulus, documentare la posizione con una pila z. Con la pipetta in posizione, impostare la micropompa per iniettare 100 nanolitri di perfluorodecalina in due minuti.
Per garantire la persistenza della pipetta e per ridurre la confusione dalla spina della pipetta durante l'ingresso. Dopo quattro o sei minuti di filtrazione, impostare la micropompa per aspirare fino a 300 nanolitri ad una velocità fino a 50 nanolitri al minuto. Questo bellissimo glomerulus vicino alla superficie dimostra immagini favorevoli a causa della posizione superficiale del glomerulus a 20 micrometri sotto la capsula renale.
Il glomerulus è troppo vicino alla superficie per la microiniezione, tuttavia, poiché la pipetta colpirebbe lo scivolo di copertura. Questi glomeruli sono posizionati in modo ottimale con i bordi laterali di 250 micrometri a destra e appaiono meno affilati a causa della rifrazione causata dalla loro profondità di 70 micrometri dalla capsula. Entrambi i fattori che rendono accessibili i glomeruli.
In questa tipica immagine di ingresso renale, una proiezione di intensità media da una pila z con viste ortogonali rivela la punta della pipetta all'interno dello spazio di Bowman, notare l'artefatto spettrale della punta della pipetta rossa dalla fluorescenza estremamente luminosa dei punti quantici disposti sulla sezione conica della punta. Qui, un rendering del volume da una pila z acquisito dopo aver posizionato una pipetta nello spazio di Bowman, mostra la punta della pipetta all'interno dello spazio che confina con il ciuffo capillare. Se viene utilizzata una pipetta con un'apertura troppo grande, la capsula renale può rompersi causando sanguinamento subcapsulare e ingresso del sangue nel lume della pipetta.
Utilizzando questo metodo, 17 proteine, principalmente a basso peso molecolare, sono state identificate da un minimo di due peptidi unici per proteina. Insieme a questo metodo, altri metodi come la maspectroscopia, le misurazioni degli elettrodi sensibili agli ioni e l'iniezione di anticorpi fluorescenti possono essere utilizzati per rispondere a domande sul ruolo dei soluti luminali nella fisiologia tubolare e glomerulare.
