이 기술은 전신 단백질과 대사 산물의 사구 여과 비율과 관 생리학에 대한 기여를 포함하여 단일 nephron 생리학에 대한 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 미세 펑크 기술의 주요 장점은 모든 마우스에서 Bowman의 공간과 피질 네프론에 대한 액세스를 허용한다는 것입니다. 일반적으로 이 메서드에 새로 사용된 개인은 올바르게 실행된 준비 단계가 필요하기 때문에 어려움을 겪게 됩니다.
발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인 한 후, 눈에 연고를 적용하고 테이프를 사용하여 20 ~ 25 그램 성인 마우스의 사지를 고정합니다. 제거 크림을 사용하여 동물의 왼쪽에 있는 머리카락을 모두 제거하고 비장을 사용하여 비장의 등쪽과 caudal 측의 피부를 통해 왼쪽 신장을 찾습니다. 피부에 0.5 센티미터 절개를 하고, 신장이 밀려나갈 만큼 충분히 커진 회막에 더 작은 절개를 합니다.
부드러운 압력으로 신장을 돌출하고 조직 주위에 폴리실록산 신장 안정제 형태를 놓습니다. 신장을 스페이서와 함께 일렬로 세워신장의 거의 표면이 안정기를 넘어 약 1밀리미터 까지 연장되고, 신장을 시아노아크릴레이트 접착제로 형태로 고정한다. 헤드 플레이트를 안정기 형태에 접고 헤드 플레이트를 베이스 플레이트에 장착하는 바에 장착합니다.
다음으로, 1% 아가로즈 용액으로 폴리실록산 지지대에서 우물을 채우고 아가로즈가 단단할 때까지 10mm 커버 슬립을 양식 위에 고정시합니다. 덮개를 접착제로 헤드 플레이트에 밀봉하고 치과 시멘트로 커버 슬립 주위에 반지를 만듭니다. 그런 다음 FITC-Dextran의 100~ 150마이크로리터를 복고풍 궤도로 주입하고 마우스와 고정 판을 2광자 현미경 단계로 빠르게 이동시합니다.
신장 표면에 수동으로 초점을 맞춘 후, 비스캐닝 2광자 모드로 전환하고 이미징 창을 탐색하여 커버 슬립 아래 30 마이크로미터 이상, 측면 신장 캡슐에서 400 마이크로미터 미만의 표적 구이를 찾습니다. 대상 사구체까지 측면 및 수직 거리를 기록합니다. 그런 다음 x, y 및 z 스테이지 좌표를 구체에 대해 기록합니다.
그리고 마지막으로 x 및 y 단계 좌표를 변경하지 않고 물 기둥에 약 1 밀리미터의 객관적인 초점을 올립니다. 파이펫 팁을 물 기둥으로 몰고 DAPI 여기를 켭니다. x 및 y 치수의 파이펫을 팁의 최대 형광 지점으로 이동합니다.
이것은 목표의 중심이 될 것입니다. x 인용 설정을 적색 형광 단백질로 변경하고 안구 뷰에서 정확한 중심을 허용하도록 안구로 파이펫을 시각화합니다. 2광로 돌아가 서 두 광자 보기 아래 파이펫을 찾아 이미지중앙에 팁을 정확하게 배치하면 등록 위치입니다.
그런 다음 파이펫의 이미지를 저장하고 스테이지와 마이크로 피펫 컨트롤러 좌표를 등록합니다. y축과 z축을 움직이지 않고 x축의 물 기둥에서 파이펫을 제거하고 파이펫 z를 대상 글로메러스 z 좌표 및 신장 가장자리로 이동합니다. 스테이지 x를 기록하고 등록 단계 x에서 오프셋을 사용하여 신장 가장자리 파이펫 x를 계산합니다.
단계 x를 늘려 신장 가장자리가 화면 왼쪽까지 멀리 가될 때까지 파이펫쪽으로 스테이지를 이동시키고, 계속 볼 수 있습니다. 파이펫을 신장 가장자리 파이펫 X에서 약 100 마이크로미터 로 빠르게 전진시키는 것만으로 도왔습니다. 적색 게인을 증가시키고 빨간 픽셀 히스토그램을 모니터링하는 동안 살아있는 2 광자 이미징에서 신장 가장자리로 천천히 파이펫 팁을 진행하기 시작합니다.
x축의 파이펫을 천천히 구불구표적 파이펫 x로 몰고 스테이지 x를 주시합니다. 구문체에 도달하면 z 스택으로 위치를 문서화합니다. 파이펫을 배치하면 마이크로펌프를 설정하여 퍼플루오로데칼린 100나노리터를 2분 이상 주입합니다.
파이펫의 자두성을 보장하고, 진입 시 파이펫 플러그로 인한 혼란을 줄입니다. 4~6분간 여과후 마이크로펌프를 분당 최대 50나노리터의 속도로 최대 300나노리터까지 흡인하도록 설정합니다. 이 아름답고 가까운 표면 사구는 신장 캡슐 아래 20 마이크로미터에서 구두류의 표면 위치로 인해 유리한 이미징을 보여줍니다.
사구체는 미세 주입을 위해 표면에 너무 가깝지만 파이펫이 덮개 미끄러짐에 부딪히기 때문에. 이 사구는 오른쪽250 마이크로미터의 측면 가장자리로 최적으로 위치하며 캡슐에서 70 마이크로미터 깊이로 인한 굴절로 인해 덜 날카로운 것처럼 보입니다. 구성갈채를 접근하게 하는 두 가지 요인모두.
이 전형적인 신장 항목 이미지에서 직교 뷰가있는 z 스택의 평균 강도 투영은 Bowman의 공간 내에서 파이펫 팁을 드러내며 팁의 원색 섹션에 배치 된 양자 점의 매우 밝은 형광에서 붉은 파이펫 팁 스펙트럼 아티팩트를 주목하십시오. 여기서 보우만의 공간에 파이펫을 배치한 후 획득한 z 스택에서 볼륨 렌더링이 모세관 터프트에 맞닿아 있는 공간 내의 파이펫 팁을 보여줍니다. 너무 큰 개구부를 가진 파이펫이 사용되는 경우, 신장 캡슐은 피펫 루멘에 혈액의 캡슐 출혈과 입력을 일으키는 원인이 되는 파손할 수 있습니다.
이 방법을 사용하여, 17 단백질, 주로 저분자량의, 단백질 당 2개의 유일한 펩티드의 최소에서 확인되었습니다. 이 방법과 결합하여, 말양상 검사, 이온 에 민감한 전극 측정 및 형광 항체 주입과 같은 다른 방법은 관 및 구체 생리학에서 발광 솔루트의 역할에 대한 질문에 대답하는 데 사용할 수 있습니다.
