Esta técnica puede ayudar a responder preguntas clave sobre la fisiología de un solo nefrón, incluidas las tasas de filtración glomerular de proteínas y metabolitos sistémicos y sus contribuciones a la fisiología tubular. La principal ventaja de esta técnica de micropuntura es que permite el acceso al espacio de Bowman y a la nefrona cortical en todos los ratones. Generalmente, los individuos nuevos en este método tendrían problemas porque requieren pasos de preparación ejecutados correctamente.
Después de confirmar la falta de respuesta al pellizco del dedo del dedo del de la parte del de los dedos, aplique un ung ón en los ojos y use cinta adhesiva para inmovilizar las extremidades de un ratón adulto de 20 a 25 gramos. Usa una crema depilatoria para eliminar todo el cabello en el lado izquierdo del animal, y usa el bazo para localizar el riñón izquierdo a través de la piel en el lado dorsal y caudal del bazo. Haga una incisión de 0,5 centímetros en la piel, seguida de una incisión más pequeña en el peritoneo lo suficientemente grande como para que el riñón sea empujado a través.
Extruir el riñón con una presión suave y colocar una forma de estabilizador renal de polisiloxano alrededor del tejido. Alinee el riñón con el espaciador de tal manera que la superficie más lateral del riñón se extienda más allá del estabilizador por aproximadamente un milímetro, y fije el riñón a la forma con adhesivo de cianoacrilato. Pegue una placa de cabeza a la forma del estabilizador y monte la placa de cabezal en las barras de montaje en la placa base.
A continuación, llene el pozo en el soporte de polisiloxano con una solución de agarosa al uno por ciento y sostenga un resbalón de cubierta de 10 milímetros en la parte superior de la forma hasta que la agarosa esté firme. Selle el resbalón de la cubierta a la placa de la cabeza con pegamento y cree un anillo alrededor del resbalón de la cubierta con cemento dental. A continuación, inyecte de 100 a 150 microlitros de FITC-Dextran retro-orbital y mueva rápidamente el ratón y la placa de fijación a la etapa del microscopio de dos fotones.
Después de centrarse manualmente en la superficie renal, cambie al modo de dos fotones sin escaneo y explore la ventana de imágenes para localizar un glomerero objetivo que sea mayor de 30 micrómetros por debajo del resbalón de la cubierta y menos de 400 micrómetros de la cápsula renal lateral. Registre la distancia lateral y vertical al glomérulo objetivo. A continuación, registre las coordenadas de la etapa x, y y z para el glomerulo.
Y por último, suba el punto focal objetivo alrededor de un milímetro en la columna de agua sin cambiar las coordenadas de la etapa x e y. Conduzca la punta de la pipeta en la columna de agua y encienda la excitación DAPI. Mueva la pipeta en las dimensiones x e y hasta el punto de fluorescencia máxima de la punta.
Este será el centro del objetivo. Cambie el ajuste de cita x a proteína fluorescente roja y visualice la pipeta con el ocular para permitir un centrado preciso en la vista ocular. Vuelva a dos fotones para encontrar la pipeta debajo de la vista de dos fotones en vivo y coloque la punta precisamente en el centro de la imagen, esta es la posición de registro.
A continuación, guarde una imagen de la pipeta y registre la etapa y las coordenadas del controlador de micropipetas. Retire la pipeta de la columna de agua en el eje X sin mover el eje y y z y mueva la pipeta z a la coordenada z del glomerulo de destino y al borde del riñón. Observe la etapa x y calcule la pipeta de borde renal x utilizando el desplazamiento de la etapa de registro x.
Aumente la etapa x para mover el escenario hacia la pipeta hasta que el borde del riñón esté lejos a la izquierda de la pantalla, sin dejar de estar visible. Avance rápidamente la pipeta a unos 100 micrómetros de distancia de la pipeta de borde renal X acaba de calcular. Aumente la ganancia roja y comience a avanzar la punta de la pipeta lentamente hasta el borde del riñón bajo imágenes de dos fotones en vivo mientras monitorea el histograma de píxeles rojos.
Conduzca la pipeta en el eje X lentamente hasta la pipeta de destino del glomérulo x, manteniendo un ojo en el escenario x. Al llegar al glomérulo, documente la posición con una pila z. Con la pipeta en posición, ajuste la microbopa para inyectar 100 nanolitros de perfluorodecalin durante dos minutos.
Para garantizar la patencia de la pipeta y reducir la confusión de la taponada de la pipeta durante la entrada. Después de cuatro a seis minutos de filtración, ajuste la microbopa para aspirar hasta 300 nanolitros a una velocidad de hasta 50 nanolitros por minuto. Este hermoso glomérulo cercano a la superficie muestra imágenes favorables debido a la posición superficial del glomerulo a 20 micrómetros por debajo de la cápsula renal.
El glomérulo está demasiado cerca de la superficie para la microinyección sin embargo, ya que la pipeta golpearía el resbalón de la cubierta. Estos glomérulos están posicionados de forma óptima con los bordes laterales 250 micrómetros a la derecha y aparecen menos afilados debido a la refracción causada por su profundidad de 70 micrómetros de la cápsula. Ambos factores que hacen que los glomérulos sean accesibles.
En esta imagen típica de entrada renal, una proyección de intensidad media de una pila z con vistas ortogonales revela la punta de la pipeta dentro del espacio de Bowman, observe el artefacto espectral de punta de pipeta roja de la fluorescencia extremadamente brillante de los puntos cuánticos dispuestos en la sección cónica de la punta. Aquí, un renderizado de volumen de una pila z adquirido después de colocar una pipeta en el espacio de Bowman, muestra la punta de la pipeta dentro del espacio que colinda con el tuft capilar. Si se utiliza una pipeta con una abertura demasiado grande, la cápsula renal puede romperse causando sangrado subcapsular y la entrada de la sangre en el lumen de la pipeta.
Usando este método, se han identificado 17 proteínas, principalmente de bajo peso molecular, a partir de un mínimo de dos péptidos únicos por proteína. Junto con este método, se pueden utilizar otros métodos como la maspectroscopia, las mediciones de electrodos sensibles a los iones y la inyección de anticuerpos fluorescentes para responder preguntas sobre el papel de los solutos luminales en la fisiología tubular y glomerular.
