この技術は、全身タンパク質および代謝産物の糸球体濾過率および管状生理学への寄与を含む、単一腎系生理学に関する主要な質問に答えるのに役立つ。このマイクロ穿刺技術の主な利点は、ボウマンの空間とすべてのマウスの皮質腎へのアクセスを可能にすることです。一般に、この方法を使用するユーザーは、正しく実行された準備手順を必要とするため、苦労します。
足指ピンチへの応答の欠如を確認した後、目に軟膏を適用し、20〜25グラムの成人マウスの四肢を固定するためにテープを使用する。脱毛クリームを使用して動物の左側の毛を全て取り除き、脾臓の後部および尾側の皮膚を通して左腎臓を見つけるために脾臓を使用します。皮膚に0.5センチメートルの切開を行い、続いて腹部の小さな切開を行い、腎臓が押し通されるのに十分な大きさの腹部を切開する。
穏やかな圧力で腎臓を押し出し、組織の周りにポリシロキサン腎臓安定剤の形を置きます.後でほぼ腎臓の表面が安定剤を超えて約1ミリメートル伸びるように腎臓をスペーサーと一緒に並べ、シアノアクリル酸接着剤で腎臓を形態に固定する。ヘッドプレートをスタビライザーの形に接着し、ヘッドプレートをベースプレートの取り付け棒に取り付けます。
次に、ポリシロキサンの支持体に1%のアガロース溶液を充填し、アガロースが固まるまで10ミリメートルのカバースリップをフォームの上に保持します。カバースリップを接着剤でヘッドプレートに密封し、カバースリップの周りに歯科用セメントでリングを作成します。その後、100~150マイクロリットルのFITC-Dextranをレトロ軌道に注入し、マウスと固定板を2光子顕微鏡ステージに素早く移動します。
手動で腎臓表面に焦点を当てた後、非スキャン2光子モードに切り替え、イメージングウィンドウを探索して、カバースリップの下30マイクロメートルより大きく、横方腎臓カプセルから400マイクロメートル未満のターゲット糸球体を見つけます。ターゲットの糸球体までの横方向および垂直距離を記録します。次に、糸球体の x、y、z のステージ座標を記録します。
そして最後に、xとyのステージ座標を変更することなく、約1ミリメートルの目標焦点を水柱に上げます。ピペットチップを水柱に入れ、DAPI励振をオンにします。xおよびy次元のピペットを先端の最大蛍光の点まで動かします。
これが目的の中心になります。x引用設定を赤蛍光タンパク質に変更し、眼の視点で正確にセンタリングできるようにピペットを眼で視覚化します。ライブ2光子ビューの下にピペットを見つけるために2光子に戻って、画像の中央に正確にチップを配置し、これは登録位置です。
次にピペットの画像を保存し、ステージとマイクロピペットコントローラ座標を登録します。y 軸と z 軸を動かさずに x 軸の水柱からピペットを取り出し、ピペット z をターゲットの糸球体 z 座標と腎臓の端に移動します。ステージxに注意し、登録段階xからのオフセットを使用して腎臓エッジピペットxを計算する。
ステージ x を大きくして、腎臓の端が画面の左端に向かって遠くまでピペットに向かってステージを移動し、目に見えるままにします。ピペットを腎臓端から約100マイクロメートル離れたところに素早く進めるだけで計算した。赤いゲインを増加させ、赤いピクセルヒストグラムを監視しながら、ライブ2光子イメージングの下で腎臓の端にゆっくりとピペットチップを進め始めます。
x軸のピペットを糸球体ターゲットピペットxまでゆっくりと駆動し、ステージxに目を光らせておきます。糸球体に達すると、z スタックで位置を記録します。ピペットを位置に、マイクロポンプを2分間にわたって100ナノリットルのパーフルオロデカリンを注入するように設定します。
ピペットの正愛を確保し、そして入り口の間にピペットのプラグから交戦を減らすために。4~6分の濾過の後、マイクロポンプを1分間に最大50ナノリットルの速度で最大300ナノリットルまで吸引するように設定します。この美しい、表面に近い糸球体は、腎カプセルの下20マイクロメートルで糸球体の表面位置による良好なイメージングを示しています。
しかし、ピペットがカバースリップに当たるように、糸球体はマイクロインジェクションには表面に近すぎます。これらの糸球体は、左右に250マイクロメートルの横縁で最適に配置され、カプセルからの70マイクロメートルの深さによって引き起こされる屈折のためにあまり鋭く見えない。糸球体をアクセス可能にする両方の要因。
この典型的な腎進入画像では、直交図を有するZスタックからの平均強度投影は、ボウマンの空間内のピペット先端を明らかにし、先端の円錐部に配置された量子ドットの極めて明るい蛍光から赤色ピペット先端スペクトルアーティファクトに注意する。ここでは、ボウマンの空間にピペットを配置した後に取得したzスタックからのボリュームレンダリングは、毛細管の房に隣接する空間内のピペットチップを示しています。開口が大きすぎるピペットを使用すると、腎嚢が壊れ、皮下出血やピペット内腔への血液の侵入を引き起こす可能性があります。
この方法を用いて、17個のタンパク質、主として低分子量のタンパク質が、タンパク質当たり最低2つの固有ペプチドから同定されている。この方法と組み合わせることで、マソスペロスコピー、イオン感受性電極測定、蛍光抗体注射などの他の方法を用いて、管状および糸球体生理学における発光体の役割に関する質問に答えることができます。
