Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen auf dem Gebiet der Kardiologie zu beantworten. Ist beispielsweise eine neue Humanmedizin mit dem Risiko verbunden, den normalen Herzrhythmus zu verändern? Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie eine große Anzahl von Verbindungen schnell und zu moderaten Kosten bewerten kann.
Demonstriert wird das Verfahren von Camille Forny, einer wissenschaftlichen Mitarbeiterin in meinem Labor. Um sich auf die Messung der Kontraktionskontraktytia von vom Menschen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten(HIPSCCMs) vorzubereiten, beginnen Sie damit, CryoTubes, die gefrorene Zellen enthalten, für zwei Minuten in ein 37 Grad Celsius Wasserbad zu legen. Übertragen Sie die gesamte aufgetaute Zellsuspension von jedem Rohr auf ein einziges, frisches 50 Milliliter konisches Rohr.
Um die übrig gebliebenen Zellen abzurufen, waschen Sie jedes Rohr mit einem Milliliter 37 Grad Celsius vorgewärmten Beschichtungsmedium und fügen Sie dieses Medium zu dem 50 Milliliter konischen Rohr mit aufgetauten Zellen hinzu. Acht Milliliter warmes Beschichtungsmedium in das Rohr geben und die Suspension sorgfältig mischen. Verwenden Sie die Trypan-Blau-Ausschlussmethode und ein Hämozytometer, um lebende Zellen zu zählen.
Durch Zugabe von Warmbeschichtungsmedium die Konzentration auf 50.000 Zellen pro Milliliter einstellen. Um die Zellen in zwei neue 384-Well-Zellkulturplatten zu verteilen, fügen Sie 25 Mikroliter zu jedem Brunnen hinzu, was etwa 12.500 Zellen pro Brunnen ergibt. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in 384-Well-Platten in befeuchteter Atmosphäre mit 5% Kohlendioxid für insgesamt drei bis vier Wochen.
Ersetzen Sie am nächsten Tag das Beschichtungsmedium durch 50 Mikroliter warmes Pflegemedium. Danach alle zwei bis drei Tage die Hälfte des Wartungsmediums austauschen. Ersetzen Sie an den Tagen sieben, 14 und 21 das Medium vollständig.
Sobald die Zellen drei bis vier Wochen in Kultur gehalten wurden, haben sie spontan kontrazytierte Synzyttia gebildet, und die Wirkung von Verbindungen auf diese Kontraktionen kann gemessen werden. Am Tag des Assays, mindestens zwei Stunden bevor die erste Zellplatte für die Messung in den Plattenleser gelegt werden soll, schalten Sie den Reader ein und stellen Sie die Heizung auf 37 Grad Celsius ein. Zur Vorbereitung der zusammengesetzten Platten, warm auf Raumtemperatur 40 Milliliter Wartungsmedium ergänzt mit 1%Volumen-by-Volume Penicillin Streptomycin.
Während sich das Medium erwärmt, verteilen Sie die Testverbindungen und die Kontrollen in zwei 384-Well-Compound-Platten, indem Sie 1,5 Mikroliter Stammlösung pro Brunnen hinzufügen. Zentrifugieren Sie die Verbundplatten bei 100 G für eine Minute. Fügen Sie 37 Mikroliter Wartungsmedium zu jedem Brunnen hinzu und zentrifugieren Sie die Platten wieder bei 100 G für eine Minute.
Zur Herstellung des Fluoreszenzfarbstoffs werden 100 Milliliter Wartungsmedium mit 1% Volumenvolumen Penicillin Streptomycin in einem 37 Grad Celsius Wasserbad ergänzt. Fügen Sie dann 10 Milliliter des erwärmten Mediums in die Mischung aus kalziumempfindlichem Fluoreszenzfarbstoff und Quencher ein, um sie als Stofffluoreszenzmedium zu rekonstituieren. Starten Sie die Plattenleser-Software.
Bereiten Sie die Software vor, um ein zweiminütiges Segment von Kalziumwellen mit einer Erfassungsfrequenz von mindestens 10 Hertz aufzuzeichnen. Um Fluoreszenzmedium für jede Zellplatte zu machen, verdünnen Sie drei Milliliter Stammfluoreszenzmedium mit 12 Millilitern warmem Pflegemedium mit Antibiotika. Ersetzen Sie 20 Mikroliter Medium in jedem Brunnen der Zellplatte durch 30 Mikroliter Fluoreszenzmedium und mischen Sie, indem Sie einmal nach oben und unten pipetieren.
Legen Sie die Platte unmittelbar danach in einen Plattenleser, damit sich die HIPSCCMs 60 Minuten lang an die Lesertemperatur anpassen können. Starten Sie dann die Plattenleser-Software. Zeichnen Sie ein zweiminütiges Segment von Kalziumwellen mit einer Erfassungshäufigkeit von mindestens 10 Hertz auf, um die Ausgangsschlagrate für jeden Bohrwert zu definieren.
Es ist wichtig, sicherzustellen, dass die Zellplatte nach der Datenerfassung nicht aus dem Gerät übertragen wird. Bei einigen Softwareversionen müssen Sie die Aufzeichnung beenden, bevor sie vollständig beendet wird. Verwenden Sie den Plattenleserroboter, um fünf Mikroliter der Prüf- und Referenzverbindungen gut von der Verbundplatte in die Zellplatte zu pipetten.
Danach starten Sie die Datenerfassung in der Plattenleser-Software, um zwei Minuten Segmente von Kalziumwellen ab fünf, 15, 30, 45 und 60 Minuten nach der zusammengesetzten Zugabe aufzuzeichnen. Um mit der Datenanalyse zu beginnen, exportieren Sie die Rohdaten für jeden Aufzeichnungszeitraum aus der Plattenlesersoftware in ASCII-Textdateien. Und importieren Sie sie dann in Datenanalyse-Software.
Exportieren Sie aus der Datenanalysesoftware die primären Schlagfrequenzen für jeden Aufzeichnungszeitraum als Zwischenablagekopien. Extrahieren Sie die primäre Schlagfrequenz für jeden Brunnen und jeden Zeitpunkt. Importieren Sie schließlich die Schlagfrequenzen in eine Tabellenkalkulationssoftware durch Zwischenablage-Einfügen, und setzen Sie die Datenanalyse wie im Textprotokoll beschrieben fort.
Die Aufzeichnung von Kalziumwellen an der Grundlinie über eine 384-Well-Platte zeigt, dass in den meisten Fällen alle Brunnen eine regelmäßige Schlagrate mit geringer Variabilität über die Platte zeigen. Wenn Blocker von Herzionenkanälen hinzugefügt werden, beeinflussen sie den Rhythmus der Kardiomyozyten. Amlodipin, ein Blocker der langsamen Kalziumkanäle, beschleunigt den Rhythmus um mehr als 100% in einer konzentrationsabhängigen Weise bis zu einem Mikromolar.
Und darüber hinaus, Amlodipin verhaftet die Prügel. E-4031, ein Blocker der schnell verzögerten Gleichrichter-Kaliumkanäle, verlangsamt den Rhythmus um 65 bis 70% in einer konzentrationsabhängigen Weise bis zu 10 Mikromolar. Tetrodotoxin, ein Blocker der schnellen Natriumkanäle, verlangsamt den Rhythmus um etwa 15% in einer konzentrationsabhängigen Weise bis zu einem bis 30 Mikromolar, während über 30 Mikromolar, Tetrodotoxin die Schläge innerhalb der ersten fünf Minuten festhält.
Bepridil, ein gemischter Blocker von Herz-Natrium-, Kalzium- und Kaliumkanälen, erzeugt ebenfalls eine Alles-oder-Nichts-Wirkung, was darauf hindeutet, dass Natriumkanalblock die primäre Wirkung von Bepridil ist. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, beim Pipetieren in der Zellkulturplatte extrem sanft zu sein. Diese Gewebe sind sehr zerbrechlich und leicht beschädigt, wenn sie von Pipetten berührt werden.
Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichen Zellen und Wirkstoffen gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Schutzhandschuhen und Brille sollten immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden.
