Unsere Daten zeigen, dass die vorübergehende Hemmung der Rhokinase-Aktivität die Adhäsion, das Überleben und die Transplantation von hiPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten nach der Transplantation in die infarktierten Tierherzen verbessert. Wir bieten eine einfache, kostengünstige, während hocheffiziente Methode, um die Transplantation von transplantierten hiPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten in den verletzten Tierherzen zu erhöhen. Da diese Technik die Zellentransplantationsraten bei akutem Herzinfarkt und Herzinsuffizienz sicher und effizient verbessern kann, trägt sie zur daraus resultierenden Verbesserung der Herzfunktion, der Vaskularitäten und der Apoptose bei.
Obwohl wir unsere Protokolle nur in hiPSCs getestet haben, können diese Methoden auf andere Zelltypen angewendet werden, wie embryonale Stammzellen, mesenchymale Stammzellen usw. Die Dosis und Dauer der Y-27632 Behandlung ist entscheidend. Die visuelle Demonstration kann alle wichtigen Schritte im Protokoll detailliert demonstrieren, was für jemanden von Vorteil ist, der diese Technik noch nie zuvor ausgeführt hat.
Am 21. Tag nach der hiPSC-CM-Differenzierung das Medium aspirieren und die Zellen einmal mit sterilem PBS waschen. Inkubieren Sie die Zellen mit 0,5 Millilitern zelldissoziationsenzymen pro Brunnen bei 37 Grad Celsius für fünf bis sieben Minuten. Nach der Inkubationszeit die Zellsuspension wiederholt mit einer Ein-Milliliter-Pipette pipette, um die Zellen gründlich zu dissoziieren.
Dann fügen Sie jedem Brunnen einen Milliliter neutralisierende Lösung hinzu, sammeln Sie die Zellmischung in einem 15-Milliliter-Zentrifugenrohr und zentrifugieren Sie drei Minuten lang bei 200 mal g. Nach der Zentrifugation den Überstand entsorgen und die Zellen in der neutralisierenden Lösung wieder aussetzen. Dann pflanzen Sie die Zellen auf gelatinebeschichtete, sechswellige Platten mit einer Dichte von zwei Millionen Zellen pro Brunnen neu.
Nach 24 bis 48 Stunden das Kulturmedium für drei bis fünf Tage durch das Reinigungsmedium ersetzen. Vor der Transplantation, Kultur die Zellen in der Behandlungsgruppe für 12 Stunden in RB-plus Medium ergänzt mit 10-Mikromolar Y-27632. In ähnlicher Weise, führen Verapamil Behandlung auf den Zellen im RB-plus Medium mit einem Mikromol verapamil für 12 Stunden.
Waschen Sie die HiPSC-CMs nach der Behandlung einmal mit PBS und inkubieren Sie die Zellen mit 0,5 Mikrolitern zelldissoziierender Enzyme pro Brunnen für maximal zwei Minuten. Pipette die Zellsuspension mit einer Ein-Milliliter-Pipette, um die Zellen gründlich zu dissoziieren. Als nächstes neutralisieren Sie die Zellen mit neutralisierender Lösung, sammeln Sie die Zellmischung in einem 15-Milliliter-Zentrifugenrohr und Zentrifuge bei 200 mal g für drei Minuten.
Nach der Zentrifugation die Zellen in PBS in einer Konzentration von 0,1 Millionen Zellen pro fünf Mikroliter zur Vorbereitung auf die Injektion wieder aussetzen. Unmittelbar nach der myokarddialen Infarktinduktion fünf Mikroliter Kontroll-HiPSC-CMs, Y-27632-vorbehandelte HiPSC-CMs, verapamil-behandelte HiPSC-CMs oder ein gleiches PBS-Volumen in das Myokard der Maus an jedem Standort, einen im Infarktbereich und zwei in den Bereichen um den Infarkt. 12 Stunden vor der Durchführung des Kalziumtransienten- und Kontraktilitätsnachweises 10-Mikromolar Y-27632, 100-Nanomolar RA, Einmikromollar verapamil oder ein gleiches PBS-Volumen in das Kulturmedium von hiPSC-CMs geben.
Als nächstes entsorgen Sie das Medium und waschen Sie die Platte einmal mit PBS. Ändern Sie das Medium in ein phenolrotfreies DMEM, das 0,02 Gewichtsprozent des Tensidpolypols, den Calciumindikator für Fünfmikromolare und den entsprechenden Y-27632, RA, verapamil oder ein gleiches PBS-Volumen enthält, und brüten die Platte 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation den Überstand entsorgen, die Zellen dreimal mit dem farbstofffreien DMEM waschen und das Medium 30 Minuten ruhen lassen, um den Mapping-Farbstoff zu entestert.
Legen Sie den zellsäenden Deckel in eine offene Badkammer und legen Sie die Kammer in ein Mikroinkubationssystem ein, das mit einem automatischen Temperaturregler auf 37 Grad Celsius ausgeglichen ist. Durchfülle es mit der Tyrodes-Lösung und füge der Perfusionslösung kontinuierlich RI, RA oder PBS hinzu. Verwenden Sie ein invertiertes Fluoreszenzmikroskop und einen Laser-Scanning-Kopf, um spontane Kalziumtransienten aufzuzeichnen, indem Sie einen x-t-Linienscan verwenden.
Zeichnen Sie die spontane Kontraktion von hiPSC-CMs mit der Differentialinterferenzkontrastfunktion des konfokalen Mikroskops auf. Die Überlebensrate der transplantierten Zellen wurde durch die erhöhte Luziferase-Aktivität bestätigt. Die erhöhte humane Herztroponin T und menschliche nukleare Antigenexpression zeigten, dass y-27632 Vorbehandlung die Zellengraftmentrate signifikant verbessern konnte.
Y-27632 vorbehandelte Zellen zeigten eine größere und definiertere stabförmige zytoskelettale Struktur. Auch die Y-27632-Vorbehandlung verringerte DIE TUNEL-positiven Zellen, was auf die reduzierte transplantierte HiPSC-CM-Apoptose in vivo hindeutet. Western Blot schlug vor, dass Y-27632 Vorbehandlung erhöhte Expression von Integrin beta-1 und N-Cadherin und verringerte die Expression von Phospho-Myosin-Lichtkette 2.
Diese Änderung wurde 72 Stunden nach Y-27632 Rückzug normalisiert. In-vitro-Maus-HL-1-Zellanhaftungsexperimente zeigten, dass die Y-27632-Vorbehandlung die HiPSC-CM-Adhärenz im Vergleich zu HL-1 signifikant erhöhte. Die Y-27632-Vorbehandlung reduzierte die kontraktile Kraft, die maximale transiente Fluoreszenz des Kalziums und die transiente Calciumdauer.
Y-27632 Präbehandlung reguliert Ekardiomyozytenkontraktion durch signifikante Verringerung der Expression von cTnI und cTnT. Ähnlich wie bei Y-27632 erhöhte die Verapamil-Vorbehandlung die Luziferase-Aktivität und die Anzahl der hcTnT/HNA-Doppel-positiven Zellen. Der wichtigste Schritt ist die Kultur zellen in der Behandlungsgruppe für 12 Stunden in Rb-plus Medium ergänzt mit 10-Mikromolar Y-27632.
Basierend auf dieser Methode ist die langsame Freisetzung von Y-27632 zur weiteren Erhöhung der Zellentransplantationsrate eine vielversprechende Strategie. Diese Technik ebnet den Weg für Forscher, die Physiologie und Funktion von HiPSC von CMs in vivo zu untersuchen. Das kleine Molekül CHIR99021, das zur Differenzierung von Kardiomyozyten verwendet wird, ist gefährlich, was zu Atemwegsreizungen führen kann.
Bitte nehmen Sie keinesfalls ein oder inhalieren Sie sie.
