Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie es ermöglicht, Proteine ähnlicher Aktivitäten zu unterscheiden, die unterschiedliche Rollen haben, abhängig von der Lokalisierung in Hüllkurven-, Stroma- oder Thylakoidmembranen. Im Allgemeinen werden Personen, die neu bei dieser Methode sind, kämpfen, weil sie Pflanzen verwenden, die zu alt sind, das Blatt zu lange mischen oder nicht vorsichtig genug sein werden, wenn sie die Pellets intakter, aber zerbrechlicher Chloroplasten wieder aufhängen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da das Laden oder Wiederherstellen von Bruchteilen aus Perkoll- oder Saccharosegradientenschritten schwer zu erlernen ist.
Wegen der Gefahr der Vermischung der Gradienten und damit der Kreuzkontamination der verschiedenen Chloroplasten-Unterfraktionen. Die Demonstration des Verfahrens wird von Imen Bouchnak, einem Doktoranden aus unserem Labor, und Lucas Moyet, einem Indoor-Ingenieur, sein. Zu Beginn, wachsen Arabidopsis Pflanzen für fünf Wochen mit einem 12-Stunden-Lichtzyklus bei 23 Grad Celsius am Tag und 18 Grad Celsius in der Nacht, mit einer Lichtintensität von 150 Mikromoler pro Quadratmeter pro Sekunde.
Am nächsten Tag einen Fünf-Liter-Becher vorwiegen und dann auf Eis legen. Ernten Sie die Arabidopsis Blätter, stellen Sie sicher, dass keine Boden pflücken. Wiegen Sie den Becher erneut und zeichnen Sie das Gewebegewicht auf.
Die geernteten Blätter in einen kalten Raum überführen. Legen Sie die Blätter in einen Mixer, der zwei Liter Schleifpuffer enthält, und homogenisieren Sie sie, indem Sie sie dreimal mit hoher Geschwindigkeit für eine Dauer von jeweils zwei Sekunden mischen. Legen Sie vier Schichten Musselin und eine Schicht Nylon blau tex in ein Sieb und diese, um das Homogenat zu filtern.
Drücken Sie die gemischten Blätter vorsichtig in den Musselin und blauen Tex, um die gesamte Flüssigkeit zu extrahieren. Das restliche Gewebe im Mixerbecher wiederherstellen und den Homogenisierungsprozess mit frischem Schleifpuffer wiederholen. Verwenden Sie vier bis fünf Schichten neuen Musselins, um dieses neue Homogenat in einem neuen Becher zu filtern, wie zuvor beschrieben.
Verteilen Sie den Rohzellextrakt gleichmäßig in sechs 500-Milliliter-Flaschen. Legen Sie die Flaschen auf Eis. Zentrifugieren Sie die gekühlten Flaschen bei 2070 G und vier Grad Celsius für zwei Minuten.
Danach den Überstand vorsichtig entsorgen. Verwenden Sie eine Wasserpumpe, um alle verbleibenden Überstand zu aspirieren und halten Sie die Pellets, die konzentrierte Spritchloroplaste enthalten, auf Eis. Mit einer 10-Milliliter-Pipette, fügen Sie drei Milliliter Waschmedium zu jeder Flasche, um sicherzustellen, nicht feine Pipettenspitzen verwenden, um zu vermeiden, die Chloroplasten zu brechen.
Verwenden Sie dann einen Pinsel oder einen gebogenen Plastikspachtel, um die Pellets vorsichtig wieder aufzuhängen. Mit einer 10-Milliliter-Pipette die wieder aufgehängten Chloroplasten in einem einzigen Rohr sammeln. Um das Rohr vorsichtig umzukehren, um eine homogene Chloroplastensuspension zu erhalten.
Verwenden Sie zunächst eine 10-Millileter-Pipette, um langsam sechs Milliliter der Chloroplastensuspension auf jeden der sechs vorbereiteten Percoll-Gradienten zu laden. Zentrieren Sie die Steigungen mit einem schwingenden Schaufelrotor 10 Minuten lang bei 13, 300 G und vier Grad Celsius. Verwenden Sie eine Wasserpumpe, um die obere Phase zu aspirieren, die gebrochene Chloroplasten und intakte Mitochondrien enthält.
Verwenden Sie dann eine 10-Milliliter-Pipette, um intakte Chloroplasten in der unteren Phase zu bergen, wobei Sie darauf achten, die Kerne und Zellablagerungen, die am Boden des Rohres gefunden wurden, zusammen mit den intakten Chloroplasten nicht zu saugen. Verdünnen Sie die intakte Chloroplastensuspension drei- bis viermal mit Waschmedium. Halten Sie etwa 10 Milliliter einer Aliquot intakter Chloroplastenfraktion zur weiteren Analyse durch SDS-Page und Western Blotting auf.
Zentrifuge bei 2070 G und vier Grad Celsius für zwei Minuten. Danach den Überstand vorsichtig entsorgen. Verwenden Sie eine Wasserpumpe, um alle verbleibenden Überstand zu aspirieren und halten Sie das Pellet, das konzentrierte Rohchloroplasten enthält, auf Eis.
Um die gereinigten intakten Chloroplasten zu lysieren, setzen Sie das Pellet in hypotonischem Medium, das Protease-Inhibitoren enthält, wieder auf. Die wieder aufgehängten Chloroplasten in ein 10 Milliliter Falkenrohr geben. Bereiten Sie den Saccharosegradienten wie im Textprotokoll beschrieben vor.
Mit einer peristaltischen Pumpe langsam drei Milliliter der lysierten Chloroplasten auf jeden der vorgeformten Saccharosegradienten laden. Verwenden Sie hypotonischen mittleren Puffer, um Röhrenpaare auszugleichen, und zentrieren Sie dann den Gradienten bei 70, 000 G und vier Grad Celsius für eine Stunde. Nehmen Sie ein Aliquot der löslichen stromalen Proteine, die bei der Bestimmung der Proteinkonzentration verwendet werden sollen.
Verwenden Sie anschließend eine Wasserpumpe, um die verbleibende obere Phase des Gefälles bis zum gelben Band zu aspirieren. Rufen Sie mit einer Pipette das gelbe Band ab, das der Umschlag ist. Ziehen Sie die Umschläge in ein Rohr.
Entfernen Sie dann die verbleibende Phase des Gradienten bis zum Thylakoidpellet. Die Thylakoidpellets im Membranwaschpuffer mit Proteasehemmern wieder aufhängen. Die Thylakoid-Aufhängung verdünnen und mit Waschmedium drei- bis vierfach umhüllen, wobei das Endvolumen auf 10 Milliliter eingestellt wird.
Rohrpaare mit Membranwaschpuffer ausbalancieren und bei 110, 000 G und vier Grad Celsius eine Stunde lang ultrazentrifugieren. Danach verwenden Sie eine Wasserpumpe, um den Überstand sorgfältig zu aspirieren. Etwa 100 Mikroliter Membranwaschpuffer in das Hüllpellet geben.
Dann, aspirieren Sie den Überstand aus dem Thylakoid-Rohr. Die Thylakoid-Pellets in drei Milliliter Membranwaschpuffer wieder aufhängen. Bewahren Sie die drei gereinigten Unterteile in flüssigem Stickstoff auf, um sie in weiteren Experimenten zu verwenden.
Nachdem die Membranfraktionen zurückgewonnen, gewaschen und konzentriert sind, wird SDS-Page verwendet, um die Proteine zu quantifizieren und die Zusammensetzung aller vier Fraktionen zu analysieren. Das am häufigsten vorkommende Protein aus dem Stroma ist RBCL, und repräsentative Ergebnisse zeigen das erwartete Ergebnis, dass sehr wenig von der großen Untereinheit dieses Proteins die Thylakoid- und Hüllmembranfraktionen enthalten ist. Die leichten Erntekomplexproteine sind reichlich Thylakoid-Komponenten, die die Hüllenmembranen kaum kontaminieren sollten.
Schließlich ist der Phosphattriophosphattranslocator nur in der gereinigten Hüllkurvenfraktion sichtbar, da er im Vergleich zu den gesamten Chloroplastenextrakten in der Hüllkurve stark anreichert. Die Kreuzkontamination der drei Unterkompartimente, der löslichen Ketol-Säure-Reductoisomerase aus dem Stroma, der Chloroplastenhülle n.A. kupfern atPase und der leichten Ernte komplexer Proteine aus den Thylakoidmembranen können durch Immunoblotting und Massenspektrometrieanalyse quantifiziert werden. Während die Stroma in der Regel nicht durch Hüll- oder Thylakoidfraktionen kontaminiert ist, enthalten die gereinigten Hüllkurvenfraktionen 3% Thylakoidproteine und bis zu 10% der Proteine aus dem Stroma.
Die Thylakoide sind schlecht mit Proteinen aus dem Stroma kontaminiert, enthalten aber bis zu 3% der Hüllmembranproteine. Chloroplasten erfüllen viele wichtige Funktionen wie die Assimilation von Kohlenstoff, Schwefel und Stickstoff, sowie die Synthese von essentiellen Metaboliten. Um neue Regulierungsmechanismen zu entschlüsseln, die die Chloroplastenphysiologie kontrollieren, ist die Definition der surplastiken Lokalisation von Chloroplastenproteinen für supergezielte Studien von entscheidender Bedeutung.
Chloroplasten enthalten mehrere Unterteile. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Chloroplastenfeld zu beantworten, z. B. wo sich ein bestimmtes Chloroplastenprotein innerhalb der Organelle befindet. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, alle Chloroplasten-Isolationsschritte bei vier Grad durchzuführen, um Protea-Widerstand in gereinigte Fraktionen zu überweisen.
Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie lascare proteomische Ansätze durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Zusammensetzung und Dynamik des Proteoms der Werte plastid Sub-Kompartimente zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Pflanzenphysiologie den Weg, viele verschiedene Aspekte der Chloroplastenbiogenese und -funktion mithilfe einer gezielten Analyse von Kandidatenproteinen, die in Plastid-Unterteilen identifiziert wurden, zu erforschen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Volumenmixer, flüssigem Stickstoff, auf bestimmten Verbindungen wie Proteasehemmern besondere Sorgfalt erfordert.
Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen, Labormantel und Schutzbrille sollten immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden.
