Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von lebendem menschlichem Gewebe in seiner natürlichen 3D-Struktur und Zusammensetzung für die Übersetzung wichtiger Laborbefunde in potenzielle Therapien. Diese Technik ermöglicht speziell die Erzeugung von Gewebekulturen aus chirurgisch resektiertem oder explantiertem menschlichen Lungengewebe zur Visualisierung einzelner verstorbener Patienten-Lungengewebeproben. Krankheitsfreies Lungengewebe kann als 3D-Gewebekulturen verwendet werden, um Lungenerkrankungen ex vivo zu modellieren, was die Analyse früher Pathomechanismen in einer hohen raumzeitlichen Auflösung ermöglicht.
Beginnen Sie damit, die resektierte Lungenprobe in 15 Milliliter Anbaumedium in einer sterilen 15-Zentimeter-Kulturschale und einem sterilen Metalltablett mit Tissuepapier zu platzieren, und füllen Sie eine 30-Milliliter-Spritze mit 42 Grad Celsius niedriger Schmelzpunkt-Agarose. Entfernen Sie den Obturator aus einem peripheren Venenkatheter und befestigen Sie den Katheter an der 30-Milliliter-Spritze. Identifizieren Sie einen Bronchus mit einem Durchmesser von 0,5 bis 3 Millimetern im Beatmungsgewebe in einem intakten Abschnitt des Gewebes, und legen Sie die Kanüle so weit wie möglich vorsichtig in den Bronchus ein.
Verwenden Sie Zangen, um die Bronchiolenwand um die Kanüle zu komprimieren, idealerweise jede benachbarte Lungenarterie gleichzeitig zu spannen, um die Bronchus um die Kanüle zu versiegeln und eine chirurgische Klemme zu verwenden, um weitere zusätzliche Atemwege zu verschließen, um Agarose-Leckage zu verhindern. Als nächstes verwenden Sie die Zange, um das Lungengewebe aus der Kulturschale zu heben, und verwenden Sie die Spritze, um die Agarose manuell durch die Kanüle zu liefern, nicht schneller als 0,3 Milliliter pro Sekunde. Wenn das Lungengewebe vollständig gefüllt wird, ohne das Gewebe zu überblasen, entfernen Sie sofort die Kanüle und klemmen Sie den Bronchus.
Tauchen Sie das Gewebe in Kulturmedium bei vier Grad Celsius für 30 Minuten, um die Agarose-Erstarrung zu erleichtern, und wiederholen Sie das Agarose-Füllverfahren für zusätzliche Bronchiolöffnungen. Dann lagern Sie die agarosegefüllten Lungengewebeabschnitte in vier Grad Celsius Medium bis zum Schneiden. Für präzise geschnittenes Lungenschneiden, identifizieren Sie die fest agarosegefüllten Bereiche im Lungengewebe, die nicht kollabieren, wenn sie sanft mit einer Pinzette gegen den Boden der Zellkulturschale gedrückt werden.
Verbrauchen Sie einen 1 bis 1,5 Kubikzentimeter Block fest gefüllten Bereich mit einer Seite noch mit Pleura bedeckt, und verwenden Sie Cyanoacrylat Kleber, um die Pluralseite jedes Gewebeblocks an den Vibramhalter zu befestigen. Schneiden Sie den ganzen Weg durch den langen Gewebeblock, bis nur noch zwei bis drei Milometer Gewebe ungeschnitten bleiben. Mit Zangen, um jeden 500-Mikrometer-Abschnitt in einen Brunnen einer Zwölf-Brunnen-Platte mit Anbaumittel zu übertragen, wie sie erhalten werden.
Wenn das gesamte Gewebe geschnitten ist, übertragen Sie die Proben von jedem Brunnen in einzelne Zehn-Zentimeter-Kulturgerichte und positionieren Sie einen vier Millimeter großen Biopsie-Stanzer orthogonal auf die Oberseite der präzisionsgeschnittenen Lungenscheibe. Dann bewegen Sie den Boxer im Uhrzeigersinn und gegen den Uhrzeigersinn Rotationen, erhalten Gewebe Schläge der Lungenprobe. Platzieren Sie jeden Stempel in frischzelligen Kulturmedium in einzelnen Brunnen einer 96-Well-Platte, wie sie erhalten werden.
Wenn alle Gewebeschläge erhalten sind, legen Sie die Platte bis zu fünf Tage in den Zellkultur-Inkubator. Die Immunolabelierung von Fibronectin in Zellkernen mit Immunfluoreszenz in menschlichen 3-D-Lungengewebekulturen ermöglicht die Abbildung der konservierten Alveolarstruktur ex vivo. Die Behandlung der humanen Präzision geschnitten Enlung Scheiben Schläge mit einem profibrotic Zytokin-Cocktail für 48 Stunden führt zu Fibrose-ähnlichen Veränderungen in der menschlichen Lunge 3-D-Gewebekulturen, einschließlich der signifikanten Induktion der Fibrose relevanten extrazellulären Matrixkomponenten, Kollagen Typ One, und Fibronectin Gene.
Zusätzlich sind die Proteinspiegel des mesenchymalen Markers Vimentin bei drei von vier Patienten nach Behandlung von 3-D-Lungengewebekultur-Punches reguliert. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die RNA-Analyse durch quantitative Echtzeit-PCR oder die Proteinanalyse durch Western Blotting durchgeführt werden, um die Gen- und Proteinexpression bzw. die im Gewebe zu bewerten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forschungen auf dem Gebiet der experimentellen Pulmonologie, zur Explantation der Lungenbiologie sowie zur Durchführung toxikologischer und pharmakologischer Studien an menschlichen Gewebeproben.
Denken Sie daran, dass lebendes menschliches Gewebe potenziell infektiös ist und dass Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung persönlicher Schutzausrüstung und der richtigen Gewebelagerung, des Transports und der Abfallbehandlung immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden sollten.
