Diese Methode, ein reproduzierbares Transformationsprotokoll für Schrenkiella parvula, kann helfen, Fragen auf dem Gebiet der pflanzenvergleichenden und funktionellen Genombildung zu beantworten, insbesondere Studien zur Untersuchung von Pflanzenanpassungen an raue Umgebungen. Diese Technik ermöglicht untersuchungen Routinefunktionen in Schrenkiella parvula an der Extremophyten an Multiionensalzspannungen angepasst. Es ermöglicht auch vergleichende Studien, die auch auf seine nahen Verwandten, die Mutter Aribidopsis Thaliana betrachtet.
Der Vergleich von Schrenkiella Parvula mit Aribidopsis Thaliana kann Einblicke in Varianzen in der Genregulation und -funktion geben, die die einzigartige Anpassung von Schrenkiella parvula ermöglichen. Das Transformationsprotokoll für Arabidopsis Thaliana ist bereits etabliert. Die Methode ermöglicht nun vergleichende Studien mit transgenen Schrenkiella Parvula-Pflanzen.
Im Allgemeinen Forscher neu zu dieser Methode wird wegen der blühenden Gewohnheit und der Blattmorphologie von Schrenkiella Parvula Pflanzen kämpfen, die effektive Transformation mit einem Flora Dip sowie die Auswahl von wahren Transformationsmitteln schwierig machen. Um zu beginnen, verwenden Sie einen nassen Zahnstocher, um etwa 20 bis 25 S.Parvula Samen auf nassen Boden zu übertragen. Dann schichten Sie die Samen bei vier Grad Celsius für fünf bis sieben Tage.
Nach der Schichtung, geben Sie die Samen in die Wachstumskammer für sieben bis zehn Tage. Sobald alle Sämlinge gekeimt sind, lassen Sie nur einen Sämling in jeder der vier Ecken und in der Mitte der Töpfe. Wachsen Sie die Pflanzen für acht bis zehn Wochen in der Wachstumskammer, bis sie blühen.
Wählen Sie am Tag der Transformation S.Parvula-Pflanzen gemäß dem Textprotokoll aus. Verwenden Sie Zangen und kleine Scheren, um alle bestäubten Blütenstände zu entfernen, die sich bereits zu Siliques entwickeln. Nachdem die Pflanzen fertig sind, bereiten Sie eine Agrobacterium-Infiltrationslösung vor.
Danach tauchen Sie den S.Parvula Blütenstand in agrobacterium Infiltrationslösung für 20 Sekunden. Hier ist das früheste Stadium der Pflanzen, die für die Transformation verwendet werden können, solange bereits entwickelte Siliques vor der Transformation entfernt werden, können ältere Pflanzen mit mehr Blüten verwendet werden. Nach der Umwandlung, legen Blumen getaucht etenzten Pflanzen horizontal in saubere Schalen mit Kuppeln, um die Pflanzen zu bedecken.
Dann legen Sie die Pflanzen für ein bis zwei Tage in einen dunklen Wachstumsraum. Bringen Sie die Pflanzen in eine aufrechte Position zurück und übertragen Sie sie in den Wachstumsraum. In der darauffolgenden Woche, überwachen Sie die getauchten Blütenstände.
Zehn Tage nach dem ersten floralen Dip werden Die S.Parvula-Pflanzen immer wieder neue Blütenstände und Sikörnungen produzieren. Eine zweite Runde von floralen Dip kann durchgeführt werden, um die neu entstehenden Blütenstände weiter zu transformieren. Wachsen Sie die Pflanzen, bis die Samen reifen, und ernten Sie die Samen etwa 21 Wochen.
Trocknen Sie die Samen für zwei bis drei Wochen bei Raumtemperatur in einem luftdichten Behälter mit Trockenmitteln gefüllt. Pflanzen Sie die T-ein-Samen gemäß dem Textprotokoll. Wachsen Sie die Pflanzen, bis sich die ersten zwei bis drei echten Blätter entwickeln.
Um die erste Auswahl für Herbizidresistenz durchzuführen, verdünnen Sie Glufosinat-Ammoniumherbizid und sprühen Sie es auf die Sämlinge. Bedecken Sie die Sämlinge über Nacht mit den Kuppeln. Legen Sie die Schalen zurück in den Wachstumsraum, und entfernen Sie die Kuppel.
Warten Sie, bis die meisten Sämlinge durch das Herbizid ausgewählt sind. Um mit der zweiten Auswahl zu beginnen, identifizieren Sie die Pflanzen, die überleben, nachdem sie drei- bis viermal mit der BASTA-Lösung besprüht wurden. Nach dem Anbau der Pflanzen für zwei bis drei weitere Wochen, wählen Sie das größte reife Blatt auf jeder Pflanze.
Als nächstes reiben Sie die Oberfläche des Blattes vorsichtig mit einem Finger, um die Wachsschicht zu entfernen. Dann einen Tropfen der verdünnten BASTA-Lösung auf das Blatt legen. Überwachen Sie die mit der BASTA-Lösung behandelten Blätter bis zu einer Woche lang auf Anzeichen von Welken.
Wählen Sie schließlich die Pflanzen mit Blättern, die von den BASTA-Tropfen nicht betroffen sind, zur weiteren Analyse aus. In diesem Protokoll wurde S.Parvula mit Agrobacterium mit einer floralen Dip-Methode transformiert. Eine Infektion mit Agrobacterium führte zur Abtreibung einiger Blumen.
Die S.Parvula-Pflanzen produzierten jedoch nach dem ersten Blütentauchen weiterhin neue Blüten und konnten wieder verwandelt werden. Mit den BASTA-Sprüh- und Falltests können echte positive Transformationsmittel genau identifiziert werden. Die Anzahl der mit PCR-Bestätigung getesteten Proben kann reduziert werden.
Während diese Methode der Transformation von Arabidopsis Thaliana ähnelt, ist es wichtig, sich an die Unterschiede im Wachstum und der Morphologie von Schrenkiella Parvula zu erinnern. Das Ändern des Protokolls, um diese Unterschiede widerzuspiegeln, ist für eine erfolgreiche Transformation von entscheidender Bedeutung. Diese Technik könnte Forschern helfen, die Evolution genomischer Variationen zu erforschen, die zu mehreren Salzspannungsanpassungen im Extremophytenmodell Schrenkiella Parvula führen.
Kombination dieser Technik mit den Informationen über die Funktionen von Aradopsis Thaliana, einer weiteren Pflanze, die eng mit Schrenkiella Parvula verwandt ist. Die Forscher können die Unterschiede in der Regelung und Funktionen untersuchen, dass dies zwei unterschiedliche Strukturen zwischen diesen beiden Arten sind. Während des Transformationsprozesses ist es wichtig, die gesamte Agrobacterium-Infiltrationslösung in autoklavierbaren Behältern zu enthalten.
Sterilisieren und entsorgen Sie alle Materialien, die mit Agrobacterium in Berührung kamen, einschließlich Handschuhe, Makropipettenspitzen und Papiertücher.
