Questo metodo, un protocollo di trasformazione riproducibile per Schrenkiella parvula, può aiutare a rispondere alle domande nel campo del genoming comparativo e funzionale delle piante, in particolare studi che studiano gli adattamenti delle piante ad ambienti difficili. Questa tecnica consente di ricercare le funzioni di routine nella Schrenkiella parvula sull'estremofita adattata alle sollecitazioni del sale multi-ionico. Consente anche studi comparativi che esaminano anche il suo parente stretto, il genitore madre Aribidopsis Thaliana.
Confrontando Schrenkiella Parvula con Aribidopsis Thaliana può fornire informazioni sulle varianze nella regolazione e nella funzione genica che consentono l'adattamento unico della parvula di Schrenkiella. Il protocollo di trasformazione per Arabidopsis Thaliana è già ben consolidato. Il metodo consente ora studi comparativi utilizzando piante transgeniche di Schrenkiella Parvula.
Generalmente i ricercatori nuovi a questo metodo faranno fatica a causa dell'abitudine alla fioritura e della morfologia delle foglie delle piante di Schrenkiella Parvula che rendono difficile una trasformazione efficace utilizzando un tuffo di flora e la selezione di veri trasformatori. Per iniziare, utilizzare uno stuzzicadenti bagnato per trasferire circa 20-25 semi di S.Parvula su terreno umido. Quindi stratificare i semi a quattro gradi Celsius per cinque o sette giorni.
Dopo la stratificazione, riportare i semi nella camera di crescita per sette-10 giorni. Una volta germinate tutte le piantine, lasciare una sola piantina in ciascuno dei quattro angoli e al centro delle pentole. Coltiva le piante per otto o 10 settimane nella camera di crescita fino a quando non fioriscano.
Il giorno della trasformazione, selezionare le piante di S.Parvula secondo il protocollo di testo. Utilizzare forcep e piccole forbici per rimuovere eventuali infiorescenze impollinati che si stanno già sviluppando in silique. Dopo che le piante sono pronte, preparare una soluzione di infiltrazione di agrobatteri.
Successivamente, immergere l'infiorescenza S.Parvula nella soluzione di infiltrazione di agrobatteri per 20 secondi. Mostrato qui è la prima fase delle piante che possono essere utilizzate per la trasformazione, purché le silique già sviluppate siano rimosse prima della trasformazione, possono essere utilizzate piante più vecchie con più fiori. Dopo la trasformazione, posizionare le piante ippate in fiore orizzontalmente in vassoi puliti con cupole per coprire le piante.
Quindi metti le piante in una stanza di crescita buia per uno o due giorni. Riportare le piante in posizione verticale e trasferirle nella sala di crescita. Nella settimana successiva, monitorare le infiorescenze i immersionate.
Dieci giorni dopo il primo tuffo floreale, le piante di S.Parvula continuano a produrre nuove infiorescenze e silique. Un secondo giro di tuffo floreale può essere eseguito per trasformare ulteriormente le infiorescenze emergenti. Coltiva le piante fino a quando i semi maturano e raccogli i semi intorno a 21 settimane.
Asciugare i semi per due o tre settimane a temperatura ambiente in un contenitore ermetico pieno di essiccanti. Piantare il T un seme secondo il protocollo di testo. Coltiva le piante fino a quando non si sviluppano le prime due o tre vere foglie.
Per eseguire la prima selezione per la resistenza agli erbicidi, diluire l'erbicida di glufosinato ammonio e spruzzarlo sulle piantine. Coprire le piantine con le cupole durante la notte. Rimettere i vassoi nella sala di crescita e rimuovere la cupola.
Attendere che la maggior parte delle piantine siano selezionate dall'erbicida. Per iniziare la seconda selezione, identificare le piante che sopravvivono dopo essere state spruzzate da tre a quattro volte con la soluzione BASTA. Dopo aver coltivato le piante per altre due o tre settimane, selezionare la foglia matura più grande su ogni pianta.
Quindi strofinare delicatamente la superficie della foglia con un dito per rimuovere lo strato di cera. Quindi posizionare una goccia della soluzione BASTA diluita sulla foglia. Monitorare le foglie trattate con la soluzione BASTA per i segni di appassimento fino a una settimana.
Infine selezionare le piante con foglie non influenzate dalle gocce BASTA per ulteriori analisi. In questo protocollo, S.Parvula è stata trasformata con agrobatterio utilizzando un metodo di immersione floreale. L'infezione da agrobatterio ha portato all'aborto di alcuni fiori.
Tuttavia le piante di S.Parvula continuarono a produrre nuovi fiori dopo il primo tuffo di fiori, e potevano essere trasformate di nuovo. Utilizzando i test di spruzzatura e caduta BASTA, è possibile identificare con precisione i veri trasformatori positivi. Il numero di campioni testati utilizzando la conferma PCR può essere ridotto.
Sebbene questo metodo sia simile alla trasformazione dell'Arabidopsis Thaliana, è importante ricordare le differenze di crescita e morfologia di Schrenkiella Parvula. La modifica del protocollo per riflettere queste differenze è fondamentale per una trasformazione riuscita. Questa tecnica potrebbe aiutare i ricercatori a esplorare l'evoluzione delle variazioni genomiche che portano a molteplici adattamenti dello stress da sale nel modello dell'estremofita, Schrenkiella Parvula.
Combinando questa tecnica con le informazioni sulle funzioni di Aradopsis Thaliana, un'altra pianta strettamente imparentato con Schrenkiella Parvula. I ricercatori possono studiare le variazioni nella regolazione e nelle funzioni che queste sono due strutture distinte tra queste due specie. Durante il processo di trasformazione, è importante contenere tutta la soluzione di infiltrazione di agrobatteri in contenitori autoclavebili.
Sterilizzare e scartare in sicurezza tutti i materiali che sono venuti a contatto con l'agrobatterio, inclusi guanti, punte di pipette macro e asciugamani di carta.
