Este método, um protocolo de transformação reprodutível para Schrenkiella parvula, pode ajudar a responder perguntas no campo do genoming comparativo e funcional das plantas, especialmente estudos que investigam adaptações de plantas a ambientes severos. Esta técnica permite investigações de funções rotineiras em Schrenkiella parvula no extremophyte adaptado a tensões de sal de íons múltiplos. Também permite estudos comparativos que também olham para seu parente próximo, o pai mãe Aribidopsis Thaliana.
Comparar Schrenkiella Parvula com Aribidopsis Thaliana pode fornecer insights sobre variâncias na regulação genética e função que permitem a adaptação única de Schrenkiella parvula. O protocolo de transformação para Arabidopsis Thaliana já foi bem estabelecido. O método agora permite estudos comparativos utilizando plantas transgênicas Schrenkiella Parvula.
Geralmente, pesquisadores novos neste método lutarão por causa do hábito de floração e da morfologia da folha das plantas Schrenkiella Parvula que fazem uma transformação efetiva usando um mergulho de flora, bem como a seleção de verdadeiros transformadores difíceis. Para começar, use um palito molhado para transferir cerca de 20 a 25 sementes S.Parvula para solo molhado. Em seguida, estratifique as sementes a quatro graus celsius por cinco a sete dias.
Após a estratificação, devolva as sementes à câmara de crescimento por sete a dez dias. Uma vez que todas as mudas tenham germinado, deixe apenas uma muda em cada um dos quatro cantos e no centro dos potes. Plante as plantas por oito a 10 semanas na câmara de crescimento até florescerem.
No dia da transformação, selecione plantas S.Parvula de acordo com o protocolo de texto. Use fórceps e pequenas tesouras para remover quaisquer inflorescências polinizados que já estão se desenvolvendo em siliques. Depois que as plantas estiverem prontas, prepare uma solução de infiltração de agrobacterium.
Depois disso, mergulhe a inflorescência S.Parvula na solução de infiltração de agrobacterium por 20 segundos. Aqui é mostrado o estágio mais antigo das plantas que podem ser utilizadas para a transformação, desde que as siliques já desenvolvidas sejam removidas antes da transformação, plantas mais antigas com mais flores podem ser utilizadas. Após a transformação, coloque as plantas mergulhadas na horizontal em bandejas limpas com cúpulas para cobrir as plantas.
Em seguida, coloque as plantas em uma sala de crescimento escura por um a dois dias. Devolva as plantas para uma posição vertical e transfira-as para a sala de crescimento. Na semana seguinte, monitore as inflorescências mergulhadas.
Dez dias após o primeiro mergulho floral, as plantas S.Parvula continuarão produzindo novas inflorescências e siliques. Uma segunda rodada de mergulho floral pode ser realizada para transformar ainda mais as recém-emergentes inflorescências. Plante as plantas até que as sementes amadurecam, e colhe as sementes em torno de 21 semanas.
Seque as sementes por duas a três semanas à temperatura ambiente em um recipiente hermético cheio de dessecantes. Plante as sementes T de acordo com o protocolo de texto. Cultivar as plantas até que as primeiras duas ou três folhas verdadeiras se desenvolvam.
Para realizar a primeira seleção para resistência a herbicidas, diluir herbicida de amônio glufosinato e pulverizá-lo nas mudas. Cubra as mudas com as cúpulas durante a noite. Coloque as bandejas de volta para a sala de crescimento, e remova a cúpula.
Espere até que a maioria das mudas sejam selecionadas pelo herbicida. Para iniciar a segunda seleção, identifique as plantas que sobrevivem após serem pulverizadas três a quatro vezes com a solução BASTA. Depois de cultivar as plantas por mais duas ou três semanas, selecione a maior folha madura em cada planta.
Em seguida, esfregue a superfície da folha suavemente com um dedo para remover a camada de cera. Em seguida, coloque uma gota da solução BASTA diluída na folha. Monitore as folhas tratadas com a solução BASTA para sinais de murchar por até uma semana.
Por fim, selecione as plantas com folhas não afetadas pelas gotas BASTA para análise posterior. Neste protocolo, a S.Parvula foi transformada com agrobacterium utilizando um método de mergulho floral. A infecção por agrobacterium resultou no aborto de algumas flores.
No entanto, as plantas de S.Parvula continuaram a produzir novas flores após o primeiro mergulho de flores, e poderiam ser transformadas novamente. Usando os testes de pulverização e queda SUFICIENTE, verdadeiros transformadores positivos podem ser identificados com precisão. O número de amostras testadas usando a confirmação do PCR pode ser reduzido.
Embora este método seja semelhante à transformação da Arabidopsis Thaliana, é importante lembrar as diferenças no crescimento e morfologia de Schrenkiella Parvula. Modificar o protocolo para refletir essas diferenças é fundamental para uma transformação bem sucedida. Essa técnica poderia ajudar os pesquisadores a explorar a evolução das variações genômicas que levam a múltiplas adaptações de estresse sal no modelo extremophyte, Schrenkiella Parvula.
Combinando essa técnica com as informações sobre as funções de Aradopsis Thaliana, outra planta intimamente relacionada à Schrenkiella Parvula. Os pesquisadores podem estudar as variações na regulação e funções que são duas estruturas distintas entre essas duas espécies. Durante o processo de transformação, é importante conter toda a solução de infiltração de agrobacterium em recipientes autoclaveáveis.
Esterilizar e descartar com segurança todos os materiais que entraram em contato com a agrobacterium, incluindo luvas, pontas de macro pipeta e toalhas de papel.
